微生物分離實(shí)驗報告.doc

微生物分離實(shí)驗報告 實(shí)驗儀器及材料土樣：18號土樣試劑及培養(yǎng)基培養(yǎng)基：果膠酶篩選培養(yǎng)基；幾丁質(zhì)酶真菌篩選培養(yǎng)基；果膠酶劃線分 離培養(yǎng)基；幾丁質(zhì)酶劃線培養(yǎng)基；細(xì)菌半固體培養(yǎng)基；淀粉培養(yǎng)基；葡萄糖酵解培養(yǎng)基；乳糖酵解培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基a) 試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅復(fù)染液等各種染料以及盧戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀綠水溶液、無菌水等儀器錐形瓶（500mL2；300mL2；100mL3）、培養(yǎng)皿（20套）、試管（20支）、移液管（3支）、燒杯、玻璃棒、載玻片、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、涂布棒、U型管、德漢氏小管、酒精燈、漏斗、接種環(huán)、濾紙、棉塞、牛皮紙、無菌操作臺、滅菌鍋、紗布等細(xì)菌的篩選，分離純化及鑒定細(xì)菌的篩選土樣處理配制生理鹽水：在燒杯中配置200ml0.85的生理鹽水，用移液管各移取9ml于五支潔凈試管，再移取90ml配置好的生理鹽水于三角燒瓶，并放入少許玻璃珠，包好滅菌；加土樣：冷卻后準(zhǔn)確稱取10g土樣放入盛有90ml無菌生理鹽水并帶有少許玻璃珠的三角燒瓶中，充分震蕩搖勻，然后放在30恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min。果膠酶菌種篩選梯度稀釋：用一支無菌吸管吸取1ml土壤懸液加入到盛有9ml無菌水的試管中充分混勻，此為10-1稀釋液，以此類推制成10-2、10-3兩種稀釋度的土壤溶液（如下圖）；涂布：配制果膠酶篩選培養(yǎng)基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養(yǎng)皿蓋周邊用記號筆做好標(biāo)記，分別寫上10-1、10-3兩種稀釋度字樣，每稀釋度標(biāo)記三皿，然后用無菌吸管分別由10-3、10-1兩管土壤稀釋液中吸取適量對好放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿準(zhǔn)確放入0.2ml，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕地來回推動，使之均勻分布，然后改變方向90度沿另一垂直線來回推動，平板內(nèi)邊緣處改變方向用涂布棒再涂布幾次；培養(yǎng)：將平板倒置于30恒溫箱中培養(yǎng)1-2天；果膠酶透明圈平板檢測：取10-1涂布平皿，用0.5的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，則說明水解圈內(nèi)的菌有水解果膠的能力；菌落描述：取此菌進(jìn)行菌落形態(tài)描述，就菌落的大?。ù?、中，?。伾ò?，黃，粉紅等），干濕（干、濕），邊緣（整齊，不整齊），表面（光滑，粗糙，有無突起等）分別進(jìn)行闡述并詳細(xì)記錄；細(xì)菌的分離純化圖 細(xì)菌的劃線分離示意圖劃線分離：制備果膠酶劃線培養(yǎng)基，滅菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌種，第一次劃線分離培養(yǎng)1-2天后取分離所得單菌落再進(jìn)行第二次劃線分離，劃線分離的具體方法是：先在平皿上劃定區(qū)域，然后將接種針在火焰上進(jìn)行滅菌操作，取含菌種的培養(yǎng)皿，在火焰上方（注意：不能離火焰太近）打開培養(yǎng)皿蓋，先拿接種針在上蓋處劃線以降溫，然后用接種針輕挑所選菌落一到兩下，將平皿蓋上放好，再取剛剛冷卻了的干凈平皿在1區(qū)進(jìn)行劃線接種操作。操作完畢后對接種針進(jìn)行滅菌操作，完成后在火焰上方打開平皿蓋，將接種針冷卻后從1區(qū)引線到2區(qū)，再如圖所示劃線，劃完后引線到3區(qū)，同上進(jìn)行劃線，劃線完畢后蓋蓋平放；純種保藏：再配制一份普通細(xì)菌培養(yǎng)基，分裝試管后滅菌，制得斜面，將純種劃線接種在斜面上培養(yǎng)保存并進(jìn)行下一步的鑒定。a) 純種果膠酶水解能力的測定配制果膠酶篩選培養(yǎng)基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養(yǎng)皿蓋周邊用記號筆做好標(biāo)記，將分離純化的細(xì)菌點(diǎn)種于平板上（注意：點(diǎn)種的量不宜過多，以34個為宜），在30培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12天，取培養(yǎng)后的平皿用0.5的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，測量并記錄透明圈的大小b) 簡單染色步驟i. 涂片取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無菌水，用接種環(huán)無菌操作將沾有菌的接種環(huán)置于載玻片上的無菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注意取菌不要太多）ii. 干燥與固定涂菌面朝上，通過火焰以干燥并固定菌物，固定過程應(yīng)使載玻片通過火焰2-3次，注意溫度的控制，過熱的溫度會將細(xì)菌殺死，溫度以手背感覺微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)；iii. 染色將載玻片平放于載波片支架上，滴加結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色1.5miniv. 水洗傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來水沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無色為止；v. 干燥用吸水紙吸去多余水分后自然干燥；vi. 鏡檢將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。c) 革蘭氏染色步驟i. 涂片先在載玻片一側(cè)用記號筆標(biāo)記間隔的四個區(qū)域，在另一側(cè)四個區(qū)域的位置分別滴加半滴無菌水。分別取四種活躍生長期菌種（大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌和一種自選菌）按常規(guī)方法涂片（不宜過厚），用酒精燈按照簡單染色中所述干燥和固定的方法對四種菌進(jìn)行干燥和固定。ii. 初染滴加草酸銨結(jié)晶紫染液使之覆蓋涂菌部位，染色1.5min后水洗；iii. 媒染先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min后水洗；iv. 脫色先用乙醇沖去水跡，然后用95%乙醇覆蓋脫去色素，脫色約30s，立即用水沖洗；v. 復(fù)染先用番紅洗去水跡，然后滴加番紅復(fù)染1.5min后水洗；vi. 鏡檢將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌。分別以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌所染顏色作為對照，來判斷枯草桿菌以及另一種自選菌的染色結(jié)果。d) 芽孢染色步驟i. 涂片，加熱干燥及固定在潔凈蓋玻片接近中部兩處分別滴一滴無菌水，分別接種枯草芽孢桿菌及梭狀芽孢桿菌。然后按照常規(guī)方法加熱干燥及固定；ii. 孔雀綠加熱染色用木夾夾住載玻片，向載玻片上滴加5%孔雀綠水溶液使之完全覆蓋涂菌部位，然后在酒精燈上微微加熱（孔雀綠著色能力強(qiáng)，加熱可使較難染色的芽孢染成綠色，且再難洗脫）至染液冒蒸汽開始計時并維持5min，注意加熱時應(yīng)以有蒸汽微微冒出為宜，過熱或加熱不足均會影響觀察效果，且加熱時在載玻片上隨時補(bǔ)加染液，切勿讓涂片干涸；iii. 水洗水洗一定要等載玻片冷卻后進(jìn)行，否則可能導(dǎo)致載玻片的破裂。具體水洗按常規(guī)方法進(jìn)行；iv. 復(fù)染用0.5%番紅水溶液復(fù)染2min；v. 水洗并干燥按常規(guī)方法水洗后自然干燥；vi. 鏡檢先在低倍鏡下尋找視野范圍，然后換用高倍鏡調(diào)焦，最后加香柏油在油鏡下仔細(xì)尋找兩種細(xì)菌以及其周圍或內(nèi)部染成綠色的芽孢。e) 半固體穿刺法觀察細(xì)菌運(yùn)動性i. 配制培養(yǎng)基配制半固體