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人用疫苗總論 1 概述 疫苗是以病原微生物或其組成成分、代謝產(chǎn)物為起始材料，采用生物技術(shù)制備而成，用于預(yù)防、治療人類相應(yīng)疾病的生物制品。疫苗接種人體后可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性體液免疫和（或）細(xì)胞免疫應(yīng)答，使人體獲得對相應(yīng)病原微生物的免疫力。本總論所述疫苗系指用于傳染病預(yù)防的人用疫苗，按其組成成分和生產(chǎn)工藝可分為以下類型。 1.1 滅活疫苗 是指病原微生物經(jīng)培養(yǎng)、增殖，用理化方法滅活后制成的疫苗，如百日咳疫苗、甲型肝炎滅活疫苗等。 1.2 減毒活疫苗 是指采用病原微生物的自然弱毒株或經(jīng)培養(yǎng)傳代等方法減毒處理后獲得致病力減弱、免疫原性良好的病原微生物減毒株制成的疫苗，如皮內(nèi)注射用卡介苗、麻疹減毒活疫苗等。 1.3 亞單位疫苗 是指病原微生物經(jīng)培養(yǎng)后，提取、純化其主要保護(hù)性抗原成分制成的疫苗，如A群腦膜炎球菌多糖疫苗、流感亞單位疫苗等。 1.4 基因工程重組蛋白疫苗 是指采用基因重組技術(shù)將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因重組到細(xì)菌（如大腸桿菌）、酵母或細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、增殖后，提取、純化所表達(dá)的保護(hù)性抗原制成的疫苗，如重組乙型肝炎疫苗等。 1.5 其他類疫苗 由不同病原徼生物抗原混合制成的疫苗為聯(lián)合疫苗，如吸附百白破聯(lián)合疫苗、麻腮風(fēng)聯(lián)合減毒活疫苗；由同種病原微生物不同血清型的抗原混合制成的疫苗為多價(jià)疫苗，如A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗；由病原微生物的保護(hù)性抗原組分與蛋白質(zhì)載體結(jié)合制成的疫苗為結(jié)合疫苗，如A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗。 本總論是對人用疫苗生產(chǎn)及質(zhì)量控制的通用性要求，具體品種還應(yīng)符合本版藥典各論的要求。 2 過程控制的基本要求 2.1 全過程質(zhì)量控制 疫苗是由具有免疫活性的成分組成，生產(chǎn)過程使用的各種材料來源及種類各異，生產(chǎn)工藝復(fù)雜且易受多種因素影響，應(yīng)對生產(chǎn)過程中的每一個工藝環(huán)節(jié)以及使用的每一種材料進(jìn)行質(zhì)量控制，并制定其可用于生產(chǎn)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)制定工藝過程各中間產(chǎn)物可進(jìn)人后續(xù)工序加工處理的質(zhì)量要求，應(yīng)對生產(chǎn)過程制定偏差控制和處理程序。 2.2 批間一致性的控制 應(yīng)對關(guān)鍵工藝步驟的中間產(chǎn)物的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行測定，并制定可接受的批間一致性范圍。對半成品配制點(diǎn)的控制應(yīng)選擇與有效性相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行測定，半成品配制時(shí)應(yīng)根據(jù)有效成分測定方法的誤差、不同操作者之間及同一操作者不同次操作之間的誤差綜合確定配制點(diǎn)。對成品或疫苗原液，應(yīng)選擇多個關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行批間一致性的控制。 用于批間一致性控制的測定方法應(yīng)按照相關(guān)要求進(jìn)行驗(yàn)證，使檢測結(jié)果可準(zhǔn)確有效地用于批間一致性的評價(jià)。 2.3 目標(biāo)成分及非目標(biāo)成分的控制 疫苗的目標(biāo)成分系指疫苗有效成分。應(yīng)根據(jù)至少能達(dá)到臨床有效保護(hù)的最低含量或活性確定疫苗中有效成分的含量及（或）活性；添加疫苗佐劑、類別及用量應(yīng)經(jīng)充分評估。 疫苗的非目標(biāo)成分包括工藝相關(guān)雜質(zhì)和制品相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)。工藝相關(guān)雜質(zhì)包括來源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基成分以及滅活和提取、純化工藝使用的生物、化學(xué)材料殘留物等；制品相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)包括與生產(chǎn)用菌毒種相關(guān)的除疫苗有效抗原成分以外的其他成分以及抗原成分的降解產(chǎn)物等。 生產(chǎn)過程中應(yīng)盡可能減少使用對人體有毒、有害的材料，必須使用時(shí)，應(yīng)驗(yàn)征后續(xù)工藝的去除效果。除非驗(yàn)證結(jié)果提示工藝相關(guān)雜質(zhì)的殘留量遠(yuǎn)低于規(guī)定要求，且低于檢測方法的檢測限，通常應(yīng)在成品檢定或適宜的中間產(chǎn)物控制階段設(shè)定該殘留物的檢定項(xiàng)。 應(yīng)通過工藝研究確定純化疫苗的制品相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)，并采用適宜的分析方法予以鑒定。應(yīng)在成品檢定或適宜的中間產(chǎn)物控制階段進(jìn)行制品相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)的檢測并設(shè)定可接受的限度要求。 3 疫苗生產(chǎn)用種子批系統(tǒng) 疫苗生產(chǎn)用種子批系統(tǒng)包括生產(chǎn)用菌毒種及基因工程疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞株，應(yīng)符合本版藥典的相關(guān)要求。 種子批系統(tǒng)通常包括原始種子/細(xì)胞種子、主種子批/主細(xì)胞庫和工作種子批/工作細(xì)胞庫，建立種子批系統(tǒng)的目的旨在保證疫苗生產(chǎn)的一致性和連續(xù)性。應(yīng)建立主種子批/主細(xì)胞庫和工作種子批/工作細(xì)胞庫并規(guī)定使用的限定代次。 3.1 三級種子系統(tǒng) 原始種子/細(xì)胞種子是指經(jīng)培養(yǎng)、傳代及遺傳穩(wěn)定性等研究并經(jīng)鑒定可用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種或者細(xì)胞株，可以是一個代次的，也可以是多代次菌毒種或者細(xì)胞株，是主種子批/主細(xì)胞庫前各代次種子的總稱；原始種子/細(xì)胞種子用于主種子批/主細(xì)胞庫的制備。外購或經(jīng)技術(shù)轉(zhuǎn)讓獲得的生產(chǎn)用種子，應(yīng)按規(guī)定建立主種子批/主細(xì)胞庫，主種子批/主細(xì)胞庫前的種子應(yīng)按照原始種子/細(xì)胞種子管理。 主種子批/主細(xì)胞庫是指由原始種子/細(xì)胞種子經(jīng)傳代，并經(jīng)同次操作制備獲得的組成均一的懸液。主種子批/主細(xì)胞庫應(yīng)為一個固定代次，用于工作種子批/工作細(xì)胞庫的制備。 工作種子批/工作細(xì)胞庫是指由主種子批/主細(xì)胞庫經(jīng)傳代，并經(jīng)同次操作制備獲得的組成均一的懸液。工作種子批/工作細(xì)胞庫應(yīng)為一個固定代次，用于疫苗的生產(chǎn)。 種子批系統(tǒng)各種子批/細(xì)胞庫應(yīng)在符合中國現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的條件下建立和制備，并應(yīng)有詳細(xì)的記錄。 主種子批/主細(xì)胞庫確定無外源因子污染時(shí)，來自該主種子批/主細(xì)胞庫的工作種子批/工作細(xì)胞庫只需排除制備工作種子批/ 工作細(xì)胞庫所需的材料和過程可能存在的外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)；如因主種子批/主細(xì)胞庫數(shù)量限制而無法進(jìn)行全面的外源因子檢查時(shí)，應(yīng)對工作種子批/工作細(xì)胞庫進(jìn)行全面檢定。 3.2 細(xì)菌性疫苗種子批系統(tǒng) 應(yīng)詳細(xì)記錄細(xì)菌的來源、傳代及其所使用的所有原材料的情況。對種子批的建立，應(yīng)確定菌種制備、擴(kuò)增方式以及次數(shù)。應(yīng)根據(jù)菌種的儲存特點(diǎn)及生產(chǎn)規(guī)模，盡可能制備批量足夠大的工作種子批，以滿足一定生產(chǎn)周期的使用。 種子批的保藏應(yīng)依據(jù)不同細(xì)菌的特性可采用在培養(yǎng)基上保存培養(yǎng)物、冷凍干燥、液體超低溫冷藏等方式保藏菌種以保證其穩(wěn)定性。 生產(chǎn)用菌種種子批的檢定應(yīng)符合相關(guān)各論的要求。檢定內(nèi)容應(yīng)包括菌種形態(tài)特性、培養(yǎng)特性、增殖能力、分子遺傳標(biāo)識、免疫學(xué)特征、毒力、毒性、毒性逆轉(zhuǎn)、免疫原性、免疫力等試驗(yàn)；同時(shí)應(yīng)采用相對敏感的方法檢測種子的菌株純度，以保證菌株沒有外源因子和雜菌污染。 3.3 病毒性疫苗種子批系統(tǒng) 應(yīng)詳細(xì)記錄病毒的來源、傳代歷史以及傳代過程中任何可能對病毒表型產(chǎn)生影響的操作（如冷適應(yīng)、不同物種動物體內(nèi)或細(xì)胞傳代，或有目的的基因操作等）。 種子批的保藏應(yīng)符合相關(guān)各論的要求；凍干保藏有利于種子批的穩(wěn)定。 種子批檢定項(xiàng)目的確定應(yīng)根據(jù)每個病毒株種子批建立的特定情況，以及對病毒種子相關(guān)特征的評估，包括在生產(chǎn)細(xì)胞基質(zhì)、禽胚或動物體內(nèi)的生長特征、組織嗜性、遺傳標(biāo)志、鑒別（對重組載體目的蛋白基因或目的蛋白的鑒別）、貯存期間的活力、生產(chǎn)過程中的遺傳穩(wěn)定性、減毒特性、純度以及無外源因子污染。如果毒種的減毒或馴化是通過不同物種間傳代獲得的，則應(yīng)對該病毒種子進(jìn)行評估，以證實(shí)無相關(guān)物種的外源性因子污染。種子批遺傳穩(wěn)定性的評估，通常應(yīng)自主種子批代次起至少超過疫苗中病毒代次5代以上。 生產(chǎn)用毒種的檢定應(yīng)符合相關(guān)各論的要求。種子批的檢定項(xiàng)目至少應(yīng)包括鑒別（血清學(xué)、全病毒或部分特征性序列測序）、外源因子、病毒表型、遺傳穩(wěn)定性等。 外源因子檢測如需進(jìn)行病毒中和，應(yīng)避免抗血清中存在中和潛在外源因子的抗體，使用特異性單克隆抗體可最大限度避免這種偶然性；如使用動物免疫血清中和病毒，應(yīng)使用非疫苗生產(chǎn)株病毒免疫SPF動物制備的血清。人類血清抗體譜較廣，不宜用作外源因子檢測時(shí)中和用抗體。為增加外源因子檢測的敏感性，可增加聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），基因測序技術(shù)等敏感檢測技術(shù)排除外源因子。 對已知具有神經(jīng)嗜性的病毒，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?、方法及評分系統(tǒng)進(jìn)行神經(jīng)毒力評估。對于具有神經(jīng)毒力的病毒或可能具有神經(jīng)毒力回復(fù)的病毒（如脊髓灰質(zhì)炎病毒），必要時(shí)應(yīng)對超過主種子代次的毒種進(jìn)行神經(jīng)毒力評估。 在病毒分離和種子批系統(tǒng)的建立過程中，應(yīng)避免使用人血白蛋白和抗生素等添加物。 3.4 基因工程疫苗種子批系統(tǒng) 應(yīng)按規(guī)定建立工程細(xì)胞庫系統(tǒng)，通?？刹捎糜邢尴♂尫ㄒ赃_(dá)到生產(chǎn)用細(xì)胞庫同質(zhì)性目的。應(yīng)通過傳代穩(wěn)定性分析確定工程細(xì)胞的傳代限度，應(yīng)采取適宜控制措施確保建立細(xì)胞庫時(shí)細(xì)胞不被外源因子污染。 種子庫保藏一般可采取液體超低溫冷藏或液氮等方式保藏，以保證其穩(wěn)定性。 種子庫檢定時(shí)應(yīng)證明表達(dá)系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性和生產(chǎn)穩(wěn)定性等。主細(xì)胞庫需進(jìn)行全面檢定，工作細(xì)胞庫重點(diǎn)檢測外源因子污染。 4 病毒性疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì) 4.1 疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的選擇 選擇疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)基于風(fēng)險(xiǎn)效益的綜合評估，包括細(xì)胞的種屬及組織來源、細(xì)胞對病毒的敏感性、擴(kuò)增病毒的穩(wěn)定性、細(xì)胞的特性及全面檢定的可行性、細(xì)胞對制品的安全性、生產(chǎn)工藝的便利性以及下游純化工藝能夠去除風(fēng)險(xiǎn)因素的可能性和達(dá)到的安全水平等。通常情況下應(yīng)選擇風(fēng)險(xiǎn)較低的細(xì)胞用于生產(chǎn)，如人二倍體細(xì)胞等。 4.2 細(xì)胞基質(zhì)的類別 疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)通常包括原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和連續(xù)傳代細(xì)胞。 原代細(xì)胞是指直接取自健康動物的組織或器官，通過采用具有高度可重復(fù)性的組織分離、細(xì)胞處理及原代細(xì)胞培養(yǎng)工藝制備成細(xì)胞懸液并立即培養(yǎng)的細(xì)胞。原代細(xì)胞保持了來源組織或器官原有細(xì)胞的基本性質(zhì)。疫苗生產(chǎn)時(shí)應(yīng)只限于使用原始培養(yǎng)的細(xì)胞或有限傳代的細(xì)胞（原始細(xì)胞傳代一般不超過5 代）。 二倍體細(xì)胞是指在體外具有有限生命周期的細(xì)胞，通過原代細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)獲得（如MRC-5、2BS、KMB17及WI-38細(xì)胞），其染色體具有二倍體性且具有與來源物種一致的染色體核型特征。細(xì)胞體外倍增一定水平后會進(jìn)入衰老期，即細(xì)胞復(fù)制停止，但仍存活且有代謝活動。連續(xù)傳代細(xì)胞是指體外具有無限增殖能力的細(xì)胞，但不具有來源組織的細(xì)胞核型特征和細(xì)胞接觸抑制特性。有些傳代細(xì)胞系是通過原代細(xì)胞在體外傳代過程中自發(fā)突變產(chǎn)生的，如Vero細(xì)胞。4.3 細(xì)胞使用代次的確定 疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)在與生產(chǎn)條件相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行連續(xù)細(xì)胞傳代，確定細(xì)胞可使用的傳代水平。每次傳代時(shí)應(yīng)采用固定的培養(yǎng)時(shí)間、接種量或傳代比率，通過細(xì)胞倍增時(shí)間的變化或傳代水平，確定細(xì)胞在該條件下的最高傳代水平；并結(jié)合細(xì)胞的生長特性、成瘤性/致瘤性及對病毒的敏感性、生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)能力等參數(shù)，分別確定主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫、生產(chǎn)代次及生產(chǎn)限定代次。通常，二倍體細(xì)胞應(yīng)至少傳代至衰老期，并計(jì)算其最高群體倍增水平，其最高使用代次應(yīng)限定在該細(xì)胞在該培養(yǎng)條件下細(xì)胞群體倍增水平的前2/3內(nèi)。傳代細(xì)胞（如Vero細(xì)胞），用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞代次應(yīng)限定在細(xì)胞未出現(xiàn)致瘤性的安全代次內(nèi)。 4.4 細(xì)胞庫的管理 細(xì)胞庫按照三級管理，即細(xì)胞種子、主細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫。細(xì)胞種子可以是自建的或經(jīng)過克隆化篩選或經(jīng)改造的，并證明可用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞，也可以是引進(jìn)的或引進(jìn)后少量凍存的證明可用于生產(chǎn)的細(xì)胞，細(xì)胞種子用于建立主細(xì)胞庫，主細(xì)胞庫用于建立工作細(xì)胞庫。 5 生產(chǎn)用培養(yǎng)基/培養(yǎng)液 培養(yǎng)基的成分應(yīng)明確且能滿足其使用目的，并符合本版藥典的相關(guān)要求。禁止使用來自牛海綿狀腦病疫區(qū)的牛源性原材料。 5.1 細(xì)菌用培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中供細(xì)菌生長所需的營養(yǎng)成分包括蛋白質(zhì)、糖類、無機(jī)鹽、微量元素、氨基酸以及維生素等物質(zhì)。應(yīng)盡可能避免使用可引起人體過敏反應(yīng)或動物來源的原材料，任何動物源性的成分均應(yīng)溯源并進(jìn)行外源因子檢測。 5.2 細(xì)胞用培養(yǎng)液 病毒疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)液應(yīng)采用成分明確的材料制備，并驗(yàn)證生產(chǎn)用細(xì)胞的適應(yīng)性。對使用無動物源性血清培養(yǎng)基的，應(yīng)詳細(xì)記載所有替代物及添加物質(zhì)的來源、屬性和數(shù)量比率等信息。疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基中不得使用人血清。使用生物源性材料，應(yīng)檢測外源性因子污染，包括細(xì)菌和真菌、支原體、分枝桿菌以及病毒。對生產(chǎn)過程中添加的具有潛在毒性的外源物質(zhì)，應(yīng)對后續(xù)工藝去除效果進(jìn)行驗(yàn)證，殘留物檢測及限度應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定。 5.3 常用添加成分 5.3.1 牛血清 牛血清應(yīng)來源于無瘋牛病地區(qū)的健康牛群，并應(yīng)符合本版藥典的要求。通過滅活程序的牛血清更具安全性，但使用經(jīng)滅活的牛血清時(shí)，其檢測應(yīng)在滅活前進(jìn)行，符合規(guī)定后方可使用。除另有規(guī)定外，病毒減毒活疫苗生產(chǎn)時(shí)制備病毒液的維持液不得添加牛血清或其他動物血清成分。 5.3.2 人血白蛋白 病毒培養(yǎng)階段或病毒收獲液保存時(shí)所用人血白蛋白，應(yīng)符合國家對血液制品相關(guān)管理規(guī)定。同一批次疫苗生產(chǎn)工藝中需多步使用人血白蛋白時(shí)，宜采用來自同一廠家的同一批次產(chǎn)品，且有效期應(yīng)能滿足疫苗有效期。 5.3.3 抗生素 疫苗生產(chǎn)中不得添加青霉素和其他-內(nèi)酰胺類抗生素。必須使用抗生素時(shí)，應(yīng)選用毒性低、過敏反應(yīng)發(fā)生率低、臨床使用頻率低的抗生素，使用抗生素種類不得超過一種，除另有規(guī)定外，接種病毒后維持液不得再添加任何抗生素。 5.3.4 其他生物材料 無血清培養(yǎng)基若添加轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、生長因子等生物材料，應(yīng)對其可能引人的潛在外源因子進(jìn)行評估，包括采用適宜的方法進(jìn)行檢測等，并應(yīng)詳細(xì)記錄其材料來源。人和動物來源的生物材料，應(yīng)符合本版藥典和國家相關(guān)規(guī)定的要求。 6 生產(chǎn) 6.1 原液制備 6.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)物的制備 6.1.1.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將工作種子接種于規(guī)定的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。自菌種開啟到菌體收獲應(yīng)有明確的擴(kuò)增次數(shù)規(guī)定。 細(xì)菌大規(guī)模培養(yǎng)可有固體培養(yǎng)法、瓶裝靜置培養(yǎng)法和大罐發(fā)酵培養(yǎng)法等。細(xì)菌培養(yǎng)過程中可進(jìn)行細(xì)菌純度、細(xì)菌總數(shù)、pH值及耗氧量等監(jiān)測。 6.1.1.2 菌體的收獲 根據(jù)不同的培養(yǎng)擴(kuò)增方法采用適宜的方法收獲菌體；對以細(xì)菌分泌性抗原為有效成分的疫苗，采用離心取上清液等方法。培養(yǎng)物收獲后應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌純度、細(xì)菌總數(shù)、活菌含量或抗原含量等檢測。 6.1.1.3 細(xì)菌滅活和毒素抗原脫毒 細(xì)菌滅活或毒素抗原脫毒應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)、滅活劑（或脫毒劑）和劑量以及最佳滅栝條件（溫度、時(shí)間、細(xì)菌濃度、抗原濃度和純度等），并應(yīng)對滅活或脫毒效果、毒性逆轉(zhuǎn)等進(jìn)行驗(yàn)證。 6.1.2 病毒培養(yǎng)物的制備 6.1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) （1） 原代細(xì)胞培養(yǎng) 將產(chǎn)于同一種群的適宜日齡、體重的一批動物，獲取目標(biāo)組織或器官并在同一容器內(nèi)消化制成均一懸液分裝于多個細(xì)胞培養(yǎng)器皿培養(yǎng)獲得的細(xì)胞為一個細(xì)胞消化批。源自同一批動物，于同一天制備的多個細(xì)胞消化批可為一個細(xì)胞批，可用于一批病毒原液的制備。 （2） 雞胚細(xì)胞培養(yǎng) 生產(chǎn)病毒性疫苗的雞胚細(xì)胞應(yīng)來自SPF雞群。來源于同一批雞胚、于同一容器內(nèi)消化制備的雞胚細(xì)胞為一個細(xì)胞消化批；源自同一批雞胚、于同一天制備的多個細(xì)胞消化批可為一個細(xì)胞批，可用于一批病毒原液的制備。 （3） 傳代細(xì)胞培養(yǎng) 將工作細(xì)胞庫細(xì)胞按規(guī)定傳代，同一種疫苗生產(chǎn)用的細(xì)胞擴(kuò)增應(yīng)按相同的消化程序、分種擴(kuò)增比率、培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行傳代。采用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的應(yīng)按固定的放大模式擴(kuò)增，并建立與生物反應(yīng)器培養(yǎng)相適應(yīng)的外源因子檢查用的正常對照細(xì)胞培養(yǎng)物。 （4） 雞胚培養(yǎng) 應(yīng)使用同一供應(yīng)商、同一批的雞蛋或雞胚用于同一批疫苗原液的生產(chǎn)。 原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞以及雞胚培養(yǎng)的正常對照細(xì)胞/雞胚的外源因子檢查應(yīng)符合本版藥典的要求。 6.1.2.2 病毒增殖和收獲 接種病毒時(shí)應(yīng)明確病毒感染滴度與細(xì)胞的最適比例，同一工作種子批按同一MOI的量接種，以保證每批收獲液病毒產(chǎn)量的一致性。除另有規(guī)定外，接種病毒后維持液不得再添加牛血清、抗生素等成分。 同一細(xì)胞批接種同一工作種子批病毒后培養(yǎng)，在不同時(shí)間的多個單次病毒收獲液經(jīng)檢驗(yàn)后可合并為一批病毒原液。 多次收獲的病毒培養(yǎng)液，如出現(xiàn)單瓶細(xì)胞污染，則與該瓶有關(guān)的任何一次病毒收獲液均不得用于生產(chǎn)。 6.1.2.3 病毒滅活 應(yīng)選擇適宜的滅活劑和滅活程序，對影響滅活效果的相關(guān)因素進(jìn)行驗(yàn)證，確定滅活工藝技術(shù)參數(shù)。應(yīng)建立至少連續(xù)5批次樣品的病毒滅活動力曲線進(jìn)行滅活效果的驗(yàn)證，通常以能完全滅活病毒的2倍時(shí)間確定滅活工藝的滅活時(shí)間，應(yīng)在滅活程序前去除可能影響滅活效果的病毒聚合物。 滅活程序一經(jīng)結(jié)束應(yīng)立即取樣進(jìn)行滅活驗(yàn)證試驗(yàn)，取樣后不能立即進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)應(yīng)將樣品置-70及以下暫存并盡快進(jìn)行滅活驗(yàn)證試驗(yàn)。應(yīng)選擇敏感的病毒檢測方法，并對方法學(xué)的最低檢測能力進(jìn)行驗(yàn)證。對同一批病毒原液分裝于多個容器的，應(yīng)按容器分別取樣進(jìn)行驗(yàn)證，不得采用合并樣品進(jìn)行驗(yàn)證。 6.2 抗原純化 不同類型疫菌的純化工藝技術(shù)及目的要求不盡相同，對于全菌體或全病毒疫苗主要是去除培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基成分或細(xì)胞成分，對于亞單位疫苗、多糖疫苗、蛋白質(zhì)疫苗等，除培養(yǎng)基或細(xì)胞成分外，還應(yīng)去除細(xì)菌或病毒本身的其他非目標(biāo)抗原成分，以及在工藝過程中加入的試劑等。應(yīng)對純化工藝過程進(jìn)行驗(yàn)證，并設(shè)立抗原純度、免疫活性、殘留物限度等質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，具體要求一經(jīng)確立不得隨意改變。 6.2.1 細(xì)菌性疫苗 6.2.1.1 全菌體疫苗 通過適宜的方法去除培養(yǎng)基成分，收集菌體，制成活疫苗原液；菌體經(jīng)滅活后制成滅活疫苗。 6.2.1.2 亞單位疫苗 根據(jù)所需組分的性質(zhì)確定純化方式并進(jìn)行純化。對具有毒性的組分還需經(jīng)適宜的方法脫毒后制成疫苗原液。對脫毒的方法、程序和時(shí)間等應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。 6.2.2 病毒性疫苗 6.2.2.1 減毒活疫苗 需要濃縮純化的減毒活疫苗，應(yīng)采用相對簡單、溫和的方法（如超濾、蔗糖密度梯度離心）進(jìn)行病毒的濃縮、純化，但應(yīng)對在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加的牛血清、抗生素的殘留量進(jìn)行檢測，并規(guī)定限度。對在細(xì)胞裂解、病毒提取過程使用有機(jī)溶劑的，應(yīng)對其殘留量進(jìn)行檢測，并符合規(guī)定。 6.2.2.2 滅活疫苗 通常應(yīng)在病毒滅活后采用適宜的方法純化。純化方法應(yīng)能有效去除非目標(biāo)成分。 6.2.3 基因工程疫苗 采用適宜的方法純化。純化方法應(yīng)能有效去除非目標(biāo)成分。 6.3 中間產(chǎn)物 中間產(chǎn)物是從起始材料開始，通過一個或多個不同工藝如發(fā)酵、培養(yǎng)、分離以及純化，添加必要的穩(wěn)定劑等各工藝過程所獲得的產(chǎn)物。 6.3.1 檢測 應(yīng)對中間產(chǎn)物制備成半成品前進(jìn)行關(guān)鍵項(xiàng)目的質(zhì)控檢測，如病毒滴度、活菌數(shù)、抗原活性、蛋白質(zhì)含量以及比活性指標(biāo)的檢測，并需考慮對后續(xù)工藝階段無法檢測的項(xiàng)目，如純度、殘留物等進(jìn)行檢測6.3.2 中間產(chǎn)物的存放 除另有規(guī)定外，中間產(chǎn)物應(yīng)按照連續(xù)生產(chǎn)過程進(jìn)人后續(xù)的加工處理步驟。中間產(chǎn)物因等待檢測結(jié)果需要暫存時(shí)，應(yīng)選擇適宜的保存方式和條件，并對可能影響有效性和安全性的降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測，制定可接受的標(biāo)準(zhǔn)。 6.4 半成品 6.4.1 配制 應(yīng)按照批準(zhǔn)的配方進(jìn)行半成品配制，將所有組分按配制量均一混合制成半成品。這個過程可能包括一個或多個步驟，如添加稀釋液、佐劑吸附、穩(wěn)定劑、賦形劑以及防腐劑等。半成品配制完成后特別是鋁佐劑吸附的疫苗應(yīng)盡快分裝。 半成品配制添加的輔料，其質(zhì)量控制應(yīng)符合本版藥典相關(guān)要求，添加防腐劑應(yīng)在有效抑菌范圍內(nèi)采用最小加量；添加佐劑應(yīng)依據(jù)抗原含量及吸附效果確定其加量。 6.4.2 檢測 應(yīng)取樣檢測，所取待檢樣品應(yīng)能代表該批半成品的質(zhì)量屬性。應(yīng)依據(jù)生產(chǎn)工藝和疫苗特性設(shè)定檢測項(xiàng)目，如無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、殘留有機(jī)溶劑、防腐劑等項(xiàng)目，鋁佐劑疫苗應(yīng)進(jìn)行吸附率和鋁含量檢測。 6.5 成品 將半成品疫苗分裝至最終容器后經(jīng)貼簽和包裝后為成品。 6.5.1 分裝 分裝是指通過分裝設(shè)備將半成品疫苗均一地分配至規(guī)定的終容器的過程。分裝應(yīng)符合本版藥典的要求。應(yīng)根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，對分裝過程中產(chǎn)品的溫度、分裝持續(xù)的時(shí)間、分裝環(huán)境的溫度和濕度等進(jìn)行控制。分裝設(shè)備應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證，以確保承載分裝容器的溫度控制系統(tǒng)和內(nèi)容物分裝量均一性等裝置的性能穩(wěn)定、可靠。 6.5.2 檢測 疫苗成品檢測項(xiàng)目一般包括鑒別、理化測定、純度、效力、異常毒性檢查、無菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、佐劑、防腐劑及工藝雜質(zhì)殘留物檢測等，其中工藝雜質(zhì)主要包括以傳代細(xì)胞生產(chǎn)的病毒性疫苗中宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA殘留，以及生產(chǎn)過程中用于培養(yǎng)、滅活、提取和純化等工藝過程的化學(xué)、生物原材料殘留物，如牛血清、甲醛和-丙內(nèi)酯等滅活劑、抗生素殘留等，由于制品特性無法在成品中檢測的工藝雜質(zhì)，應(yīng)在適當(dāng)?shù)闹虚g產(chǎn)物取樣檢測，其檢測結(jié)果應(yīng)能準(zhǔn)確反映每一成品劑量中的殘留水平。依據(jù)具體情況，成品的部分檢定項(xiàng)目可在貼簽或包裝前進(jìn)行。 應(yīng)盡可能采用準(zhǔn)確的理化分析方法或體外生物學(xué)方法取代動物試驗(yàn)進(jìn)行生物制品質(zhì)量檢定，以減少動物的使用。檢定用動物，除另有規(guī)定外，均應(yīng)采用清潔級或清潔級以上的動物；小鼠至少應(yīng)來自封閉群動物。 7 穩(wěn)定性評價(jià) 疫苗穩(wěn)定性評價(jià)應(yīng)包括對成品以及需要放置的中間產(chǎn)物在生產(chǎn)、運(yùn)輸以及貯存過程中有可能暴露的所有條件下的穩(wěn)定性研究，以此為依據(jù)設(shè)定制品將要放置的條件（如溫度、光照度、濕度等），以及在這種條件下將要放置的時(shí)間。對變更主要生產(chǎn)工藝的制品也應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性評價(jià)，并應(yīng)與變更前的制品比較。 疫苗穩(wěn)定性評價(jià)的主要類型包括：實(shí)時(shí)實(shí)際條件下的穩(wěn)定性研究；加速穩(wěn)定性研究；極端條件下穩(wěn)定性研究；熱穩(wěn)定性研究。疫苗最根本的穩(wěn)定性評價(jià)應(yīng)采用實(shí)時(shí)實(shí)際條件下的研究方案對疫苗產(chǎn)品進(jìn)行評價(jià)，還應(yīng)根據(jù)不同的研究目的所采用的其他適宜的評價(jià)方法進(jìn)一步了解疫苗的穩(wěn)定性。確定中間產(chǎn)物和成品保存條件的主要評估標(biāo)準(zhǔn)通常是看其效力能否保持合格，也可結(jié)合理化分析和生物學(xué)方法進(jìn)行穩(wěn)定性檢測。應(yīng)根據(jù)疫苗運(yùn)輸過程可能脫冷鏈及震動等情況，選擇適宜的評價(jià)方法。 7.1 穩(wěn)定性評價(jià)方案 穩(wěn)定性評價(jià)應(yīng)根據(jù)不同的產(chǎn)品、不同的目的制定適宜的穩(wěn)定性研究方案，內(nèi)容應(yīng)包含檢測項(xiàng)目、可接受的標(biāo)準(zhǔn)、檢測間隔、數(shù)據(jù)及其分析的詳細(xì)信息。通常包括保存條件、保存時(shí)間、取樣點(diǎn)，以及對樣品進(jìn)行檢測并分析等。同時(shí)，還應(yīng)對不同條件下保存的樣品按設(shè)定方案規(guī)定的取樣間隔，盡可能取樣檢測至產(chǎn)品質(zhì)量下降至不合格。 7.2 穩(wěn)定性檢測指標(biāo)和檢測方法 評價(jià)疫苗穩(wěn)定性的檢測指標(biāo)和方法因每種疫苗的特性而異，這些指標(biāo)應(yīng)在質(zhì)量控制研究、非臨床安全性評價(jià)和臨床試驗(yàn)中被證明與疫苗質(zhì)量密切相關(guān)。對大多數(shù)疫苗來說，效力試驗(yàn)是反映產(chǎn)品穩(wěn)定性的主要參數(shù)，不同疫苗可采用不同形式進(jìn)行該項(xiàng)檢測（如減毒活疫苗采用感染性試驗(yàn)、多糖蛋白結(jié)合疫苗可檢測結(jié)合的多糖含量等）。其他與產(chǎn)品效力明確相關(guān)的檢測項(xiàng)目可提供重要的補(bǔ)充數(shù)據(jù)，如抗原降解圖譜、結(jié)合疫苗的載體蛋白解離，以及佐劑與抗原復(fù)合物的解離等。此外，一些常用檢測也可作為穩(wěn)定性研究的一部分，如一般安全性、聚合物程度、pH、水分、防腐劑、容器以及密封程度，內(nèi)包材的影響因素等等。 7.3 穩(wěn)定性結(jié)果評價(jià) 穩(wěn)定性研究結(jié)果用于確定疫苗的保存條件及有效期，并證明在有效期內(nèi)疫苗的有效性和安全性等指標(biāo)符合規(guī)定要求。 中間產(chǎn)物的穩(wěn)定性研究結(jié)果用于生產(chǎn)過程中各中間產(chǎn)物保存條件的確定；應(yīng)分析每一中間產(chǎn)物的保存時(shí)間及累積各中間產(chǎn)物規(guī)定的最長保存時(shí)間對成品穩(wěn)定性評價(jià)結(jié)果的影響。成品穩(wěn)定性研究結(jié)果用于確定保存條件及有效期，并證明在有效期內(nèi)產(chǎn)品有效性和安全性等指標(biāo)符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。對聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性評價(jià)，應(yīng)以成品中最不穩(wěn)定疫苗組分的結(jié)果確定保存條件及有效期。對模擬運(yùn)輸條件的穩(wěn)定性評價(jià)，應(yīng)根據(jù)評價(jià)結(jié)果考慮脫冷鏈的次數(shù)、最高溫度及持續(xù)時(shí)間對疫苗質(zhì)量的影晌。 8 貯存和運(yùn)輸 8.1 疫苗貯存 貯存是指疫苗中間產(chǎn)物或成品，在規(guī)定條件下（包括容器、環(huán)境和時(shí)間等）的存放過程。 8.1.1 中間產(chǎn)物的貯存 在疫苗生產(chǎn)全過程中的不同階段產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，因工藝或生產(chǎn)過程控制的需要（如等待檢驗(yàn)結(jié)果、多價(jià)或聯(lián)合疫苗的序貫生產(chǎn)等），不能連續(xù)投人下一道工藝步驟，應(yīng)在適宜的條件下保存。 8.1.1.1 貯存條件的確定原則 貯存條件的各參數(shù)確定應(yīng)以疫苗生命周期的穩(wěn)定有效為原則，即疫苗各中間產(chǎn)物經(jīng)確定的保存時(shí)間、溫度和內(nèi)外環(huán)境等條件貯存至制備成品疫苗，該成品疫苗在規(guī)定效期內(nèi)仍然能達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 應(yīng)分別對不同階段中間產(chǎn)物的貯存條件進(jìn)行驗(yàn)證，證明該貯存條件不影響作為下一工藝用物料的質(zhì)量指標(biāo)；所需驗(yàn)證通常包括將各中間產(chǎn)物置于擬設(shè)定的最苛刻的貯存條件下（包括最苛刻溫度、最長貯存時(shí)間、最可能出現(xiàn)的潛在污染風(fēng)險(xiǎn)等因素），至少應(yīng)取3批由這些中間產(chǎn)物制成的成品疫苗進(jìn)行加速穩(wěn)定性和實(shí)時(shí)實(shí)際的穩(wěn)定性驗(yàn)證。 8.1.1.2 貯存條件的參數(shù)確定 應(yīng)考慮貯存容器與中間產(chǎn)物或其他組成成分的相互作用可能產(chǎn)生的影響（如容器吸附、釋放或與內(nèi)容物的物理化學(xué)反應(yīng)等），以及中間產(chǎn)物與貯存容器空間的氣體交換導(dǎo)致內(nèi)容物的酸堿度改變；此外，還應(yīng)考慮光照、濕度、在冷庫中的存放位置等因素；采用強(qiáng)毒株病毒/細(xì)菌種子生產(chǎn)的、未經(jīng)滅活處理的原液需貯存時(shí)，還應(yīng)考慮生物安全等因素。 除另有規(guī)定外，中間產(chǎn)物貯存溫度通常為28，減毒活疫苗原液保存于-60或以下更能保持病毒滴度活性。鋁佐劑吸附的中間產(chǎn)物不得凍結(jié)。 疫苗以設(shè)定的工藝連續(xù)生產(chǎn)更