植物功能組研究進(jìn)展.doc

程論文（作業(yè)）封面（ 2011 至 2012 學(xué)年度 第 2 學(xué)期）課 程 名 稱：_ _課 程 編 號(hào)：_學(xué) 生 姓 名：_ _學(xué) 號(hào)：_年 級(jí)：_ _ 任 課 教 師: _ _提 交 日 期： 年 月 日成 績(jī)：_教 師 簽 字：_開課-結(jié)課：第 周-第 周評(píng) 閱 日 期： 年 月 日植物的功能基因組學(xué)研究進(jìn)展摘要: 基因組研究計(jì)劃包括以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)兩方面的內(nèi)容。目前基因功能鑒定的方法主要有:基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(SAGE) 、cDNA 微陣列、DNA(基因) 芯片、蛋白組技術(shù)以及基于轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽和T-DNA 標(biāo)簽的反求遺傳學(xué)技術(shù)等。本文對(duì)上述各種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)以及它們?cè)谥参锘蚬δ荑b定中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞:功能基因組學(xué); 基因表達(dá)的系統(tǒng)分析;cDNA 微陣列;DNA 芯片;蛋白組以擬南芥和水稻為代表的植物基因組研究已取得了迅速的進(jìn)展,到目前為止,占擬南芥基因組(100Mb) 近三分之一的DNA 序列已被測(cè)定并在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中登記注冊(cè),預(yù)期到2001 年通過(guò)全球合作將完成擬南芥全基因組的序列測(cè)定工作。隨著植物基因組計(jì)劃的實(shí)施和進(jìn)展,GenBank 中累積了大量的未知功能的DNA 序列,如何鑒定出這些基因的功能將成為基因組研究的重點(diǎn)課題, 因此, 基因組研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容: 以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics) 和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組研究, 后者往往又被稱為后基因組研究。功能基因組研究的內(nèi)容是利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息, 發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段系統(tǒng)地分析基因的功能1 。目前人類和酵母的功能基因組研究已經(jīng)全面展開, 尤其是對(duì)已完成全基因組測(cè)序的酵母來(lái)說(shuō), 其功能基因組研究任務(wù)更加緊迫。植物的基因組研究雖然起步較晚, 但由于吸取了人類基因組研究中積累的一些經(jīng)驗(yàn), 所以進(jìn)展也相當(dāng)迅速, 對(duì)植物功能基因組學(xué)的研究目前也已經(jīng)受到重視, 在1998 年12月出版的最新一期Plant Cell (10 :1771) 和Plant Physiol . (118 :713) 上均編發(fā)了關(guān)于植物功能基因組學(xué)研究的編者按, 并由Bouchez 和Hofte (1998) 2 綜述了植物尤其是擬南芥功能基因組學(xué)研究的現(xiàn)狀, 本文在此基礎(chǔ)上綜述了目前植物功能基因組學(xué)研究中使用的主要技術(shù)手段以及最新的研究進(jìn)展。1 基因功能的含義基因的功能主要包括: 生物化學(xué)功能, 如作為蛋白質(zhì)激酶對(duì)特異的蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾; 細(xì)胞學(xué)功能, 如參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞途徑; 發(fā)育上的功能, 如參與形態(tài)建成等。目前,獲得一段DNA 序列的功能信息的最簡(jiǎn)單的方法是將該DNA 序列與GenBank 中公布的基因序列進(jìn)行同源性比較,如利用BLASTn 和BLASTx 兩種軟件分別進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性比較等。同源性比較的結(jié)果大體可以分為如下類型: 與生化和生理功能均已知的基因具同源性; 與生化功能已知的基因具同源性, 但該基因的生理功能未知;與其它物種中生化和生理功能均未知的基因具同源性; 雖與生化和生理功能均已知的基因具同源性, 但對(duì)該基因功能的了解尚不深入, 仍停留在表觀現(xiàn)象上。上述同源性檢索分析方法僅僅為該DNA 片段的功能提供了間接的證據(jù),對(duì)基因功能的直接證據(jù)還需要實(shí)驗(yàn)上的數(shù)據(jù)。Bouchez 和Hofte (1998)2 將所需要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)歸納如下: (1) 通過(guò)研究基因的時(shí)空表達(dá)模式確定其在細(xì)胞學(xué)或發(fā)育上的功能, 如在不同細(xì)胞類型、不同發(fā)育階段、不同環(huán)境條件下以及病原菌侵染過(guò)程中mRNA 和/ 或蛋白質(zhì)的表達(dá)的差異等。(2) 研究基因在亞細(xì)胞內(nèi)的定位和蛋白質(zhì)的翻譯后調(diào)控等。(3) 利用基因敲除(knock - out) 技術(shù)進(jìn)行功能喪分析或通過(guò)基因的過(guò)量表達(dá)(轉(zhuǎn)基因) 進(jìn)行功能獲(gain2of2function) 分析,進(jìn)而研究目的基因與表型性狀間的關(guān)系。(4) 通過(guò)比較研究自發(fā)或誘發(fā)突變體與其野生型植株在特定環(huán)境條件下基因表達(dá)的差異來(lái)獲取基因功能的可能信息。2 植物的表達(dá)序列標(biāo)記(EST) 與基因組大規(guī)模測(cè)序通過(guò)從cDNA 文庫(kù)中隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行測(cè)序所獲得的部分cDNA 的5或3端序列稱為表達(dá)序列標(biāo)記( EST) ,一般長(zhǎng)300500bp 左右, 利用EST作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜被稱為轉(zhuǎn)錄圖譜。目前植物EST計(jì)劃主要集中在擬南芥3 5 和水稻6 上,其他植物的EST相對(duì)較少,截止到1998 年12 月底,在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的各種植物EST的數(shù)目總和已達(dá)幾萬(wàn)條(見(jiàn)表1) 。這些EST不僅為植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建提供了大量的分子標(biāo)記, 而且來(lái)自不同組織和器官的EST也為基因的功能研究提供了有價(jià)值的信息,此外,EST計(jì)劃還為基因的鑒定提供了候選基因(candidates) 。EST計(jì)劃的一個(gè)不足之處在于通過(guò)隨機(jī)測(cè)序有時(shí)難以獲得那些低豐度表達(dá)的基因和那些在特殊環(huán)境條件下(如生物脅迫和非生物脅迫) 誘導(dǎo)表達(dá)的基因,因此為了彌補(bǔ)EST計(jì)劃的不足, 必須開展基因組測(cè)序計(jì)劃。通過(guò)分析基因組序列能夠獲得基因組結(jié)構(gòu)的完整信息, 如基因在染色體上的排列順序, 基因間的間隔區(qū)結(jié)構(gòu), 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子的分布等。3 植物基因的功能分析方法基因的時(shí)空差異表達(dá)是植物發(fā)育、分化、衰老和抗逆等生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。基因在不同組織、不同器官以及不同環(huán)境條件下的差異表達(dá)特征, 為基因的功能提供了重要的信息。Velculescu 等(1997) 12 將在特定組織或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的所有基因及其表達(dá)豐度稱為轉(zhuǎn)錄組(transcriptome) , 因此在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的基因表達(dá)差異分析實(shí)際上就是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究。經(jīng)典的減法雜交(subtractive hybridization) , 差示(differentialscreening) , cDNA 代表差異分析(representative difference analy2sis ,RDA) 以及mRNA 差異顯示(differential display) 等技術(shù)已被廣泛用于鑒定和克隆差異表達(dá)的基因, 但是這些技術(shù)不能勝任對(duì)大量的植物基因進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析, 于是, 基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(serial analysis of gene expression , SAGE) 、cDNA 微陣列(cDNA microarray) 和DNA芯片(DNA chip) 等能夠大規(guī)模地進(jìn)行基因差異表達(dá)分析的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。3. 1 基因表達(dá)的系統(tǒng)分析( SAGE)SAGE 技術(shù)的主要理論依據(jù)是: 來(lái)自cDNA 3端特定位置的一段911bp 長(zhǎng)的序列能夠區(qū)分基因組中95 %的基因。這一段基因特異的序列被稱為SAGE標(biāo)簽(SAGE tag) 。通過(guò)對(duì)cDNA 制備SAGE 標(biāo)簽并將這些標(biāo)簽串聯(lián)起來(lái), 然后對(duì)上述串聯(lián)起來(lái)的SAGE 標(biāo)簽進(jìn)行測(cè)序不僅可以顯示各SAGE標(biāo)簽所代表的基因在特定組織中是否表達(dá), 還可以根據(jù)各SAGE 標(biāo)簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達(dá)豐度的指標(biāo)13 。應(yīng)用SAGE技術(shù)的一個(gè)必要前提是GenBank 中必須有足夠的某一物種的DNA 序列資料,尤其是EST序列資料。目前該技術(shù)在人類14 和酵母12 基因組研究中已得以應(yīng)用,但是尚未用于植物基因組研究。SAGE 技術(shù)的不足是不能夠檢測(cè)出稀有轉(zhuǎn)錄物。3. 2 cDNA 微陣列和DNA 芯片技術(shù)cDNA 微陣列和DNA 芯片都是基于reverse Northern 雜交以檢測(cè)基因表達(dá)差異的技術(shù)。二者的基本思路都是首先把cDNA , 或EST, 或基因特異的寡聚核苷酸固定在固相支持物上, 并與來(lái)自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官的mRNA 反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA 探針進(jìn)行雜交, 然后用特殊的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)每個(gè)雜交點(diǎn)進(jìn)行定量分析, 理論上雜交點(diǎn)的強(qiáng)度基本上反映了其所代表的基因在不同細(xì)胞、組織或器官中的相對(duì)表達(dá)豐度。這兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)對(duì)大量基因, 甚至整個(gè)基因組的基因的表達(dá)差異進(jìn)行對(duì)比分析。cDNA 微陣列技術(shù)是Schena 等(1995) 15 發(fā)展起來(lái)的,其主要優(yōu)點(diǎn)是: 靈敏度極高,mRNA 豐度低至10 萬(wàn)分之一仍能被檢測(cè)出; 使用幾種不同顏色的熒光染料標(biāo)記探針, 這樣在同一張陣列膜上進(jìn)行一次雜交實(shí)驗(yàn)就可以同時(shí)分析不同細(xì)胞間或不同環(huán)境脅迫下基因表達(dá)的差異。cDNA 微陣列技術(shù)的主要不足是成本非常高,如需要機(jī)器人點(diǎn)膜和特殊的信號(hào)檢測(cè)分析系統(tǒng), 點(diǎn)在玻璃片上的array 不能重復(fù)使用等。最近,Desprez 等(1998)16 和胡玉欣等(中科院遺傳所,私人交流) 分別獨(dú)立發(fā)展了利用尼龍膜作固相支持物和使用同位素標(biāo)記探針進(jìn)行雜交的cDNA 表達(dá)陣列技術(shù),從而降低了成本,但檢測(cè)的靈敏度卻降低了(萬(wàn)分之一) 。DNA 芯片技術(shù)是Affymetrix 公司率先研制出來(lái)的, 該技術(shù)利用結(jié)合化學(xué)手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特異的寡聚核苷酸, 并與熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交, 再利用特殊的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)分析, 就可以獲得基因的時(shí)空差異表達(dá)譜,最近Ramsay (1998) 17 對(duì)DNA 芯片技術(shù)的原理和應(yīng)用進(jìn)行了較全面的介紹,這里不再贅述。3. 3 蛋白組( proteome) 研究轉(zhuǎn)錄不是基因表達(dá)的最終結(jié)果, 基因功能的實(shí)現(xiàn)最終是以蛋白質(zhì)的形式體現(xiàn)的, 因此, 在轉(zhuǎn)錄水平上所獲取的基因表達(dá)的信息有時(shí)并不足以揭示該基因在細(xì)胞內(nèi)的確切功能。蛋白組指的是由基因組表達(dá)產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱, 由英文單詞protein 的前半部加上單genome 的后半部組合而成。蛋白質(zhì)雙向電泳是目前蛋白組研究的首選技術(shù)18 , 但是該技術(shù)在以下方面尚需改進(jìn): 分辨率和可重復(fù)性; 蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的自動(dòng)定量檢測(cè)系統(tǒng), 以及蛋白質(zhì)N端和內(nèi)部氨基酸序列測(cè)定技術(shù)等。利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對(duì)基因敲除(knock - out) 突變體或轉(zhuǎn)基因重組體與野生型個(gè)體間雙向電泳蛋白圖譜的差異進(jìn)行對(duì)比分析就可以對(duì)目的基因的功能進(jìn)行分析。在植物上該技術(shù)已被用來(lái)分離新的基因, Damerval 等(1998) 19 分析了玉米Opaque2 基因的近等基因系之間的雙向電泳蛋白圖譜的差異, 結(jié)果鑒定克隆了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄激活因子基因。對(duì)水稻鹽脅迫處理和ABA 處理前后的雙向電泳蛋白圖譜進(jìn)行的對(duì)比分析同樣克隆了幾個(gè)與水稻耐鹽性相關(guān)的胚胎晚期豐富蛋白(lea) 基因20 ,21 。3. 4 反求遺傳學(xué)研究傳統(tǒng)的遺傳學(xué)或稱為正向遺傳學(xué)(forward genetics) 主要研究自發(fā)或誘發(fā)突變體中某一突變性狀的遺傳行為, 如控制突變性狀的基因的數(shù)目及其在染色體上的位置、突變性狀在后代中的傳遞規(guī)律等。反求遺傳學(xué)(reverse genetics) 是在已知基因序列的基礎(chǔ)上研究基因的生物學(xué)功能, 一般通過(guò)創(chuàng)造功能喪失(loss-of-function) 突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)。在微生物和小鼠中可以通過(guò)同源重組的方法用突變的基因取代野生型基因創(chuàng)造功能喪失突變體進(jìn)行反向遺傳學(xué)研究, 但在植物中很難進(jìn)行同源重組試驗(yàn)22 , 不過(guò)植物中有成熟的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(transposon tagging) 系統(tǒng)和T-DNA 標(biāo)簽系統(tǒng),而且目前已經(jīng)獲得了擬南芥、金魚草、番茄、玉米和水稻等植物的轉(zhuǎn)座子插入誘變的突變體群體, 以及T-DNA 插入誘變了的擬南芥突變體群體。從這些突變體群體中篩選出特異基因被突變了的植株, 并對(duì)突變株進(jìn)行表型分析將有助于揭示目的基因的生物學(xué)功能。篩選突變體的常用方法是利用PCR 技術(shù),這是在果蠅23 和線蟲( C. elegans) 24 中發(fā)展起來(lái)的比較成熟的方法, 其基本思路是根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)一個(gè)引物, 再根據(jù)插入元件(轉(zhuǎn)座子或T- DNA) 的序列設(shè)計(jì)第二個(gè)引物, 用上述引物對(duì)突變體群體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 由于只有目的基因插入轉(zhuǎn)座子或T-DNA 的突變體才有PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,這樣根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)就可以很容易地從數(shù)以千計(jì)的突變體群體中篩選出所需要的突變體。該技術(shù)已經(jīng)在矮牽牛25 、玉米26 ,27 和擬南芥28 35 等植物中得以成功應(yīng)用。但是對(duì)數(shù)以千計(jì)的材料進(jìn)行PCR 反應(yīng)工作量十分巨大, 為克服這一困難,Winkler 等(1998)33 設(shè)計(jì)了利用DNA 混合池(pooling) 進(jìn)行突變體篩選的實(shí)驗(yàn)程序, 結(jié)果只需要進(jìn)行36 個(gè)PCR 反應(yīng)就可以從由6000 個(gè)突變體組成的群體中篩選出單個(gè)的突變株,大大減輕了篩選的工作量,同時(shí)這些突變體的DNA 樣品及構(gòu)建的DNA 池也可以向其他研究者免費(fèi)提供。當(dāng)然,要對(duì)基因組中所有的基因進(jìn)行功能分析所需要的突變體的數(shù)目也是十分可觀的, 理論上, 要達(dá)到95 %的概率使基因組中每一個(gè)基因均因插入元件而致突變, 則所構(gòu)建的突變體群體中個(gè)體的數(shù)量至少應(yīng)為該植物基因總數(shù)的5 倍左右。在進(jìn)行反求遺傳學(xué)研究時(shí), 有時(shí)篩選出來(lái)的突變體在正常生長(zhǎng)條件下并不表現(xiàn)出突變的表型效應(yīng), 這種情況一方面可能是由于突變的表型效應(yīng)需要在特定的生長(zhǎng)環(huán)境中才能得以表現(xiàn)出來(lái),如擬南芥的鉀離子通道基因突變體Akt1 只有在缺鉀的培養(yǎng)條件下才表現(xiàn)出突變的表型效應(yīng)35 。另一方面, 植物基因組中有些基因是以基因家族的形式存在的, 即存在基因冗余, 這樣只要基因家族中有一個(gè)成員未發(fā)生插入突變, 該基因的表達(dá)就能夠補(bǔ)償其他家族成員由于發(fā)生突變所造成的功能喪失效應(yīng)。因此, 對(duì)植物的家族基因的功能進(jìn)行反求遺傳學(xué)研究時(shí)必須對(duì)該基因家族中的各個(gè)成員均已發(fā)生插入突變的突變株進(jìn)行表型分析, 才能揭示該基因家族的生物學(xué)功能。植物的功能基因組學(xué)研究才剛剛開始, 上述的各種技術(shù)手段都各有優(yōu)缺點(diǎn),隨著植物基因組研究的進(jìn)展和深入,在完善現(xiàn)有的研究手段的同時(shí), 還必須發(fā)展一些新的基因功能的研究技術(shù),同時(shí)加強(qiáng)國(guó)際間的學(xué)術(shù)和材料交流,建立全球共享的植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng), 以最終闡明植物基因組的結(jié)構(gòu)與功能。另外,進(jìn)一步的研究應(yīng)從模式植物擬南芥的基因組研究轉(zhuǎn)向作物的基因組研究,為作物的遺傳改良作出貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn):1Hieter P , Boguski M. 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