Transwell侵襲實驗.doc

Transwell侵襲實驗1.實驗前一天將ECM膠（8-12 mg/ml）（Sigma）放于4冰箱中融化過夜2.實驗時將所用的槍頭在冰上預冷半個小時，ECM膠用預冷的無血清1640按1：9稀釋（稀釋至1mg/ml），每孔中加入稀釋好的ECM膠40l，放入37培養(yǎng)箱中，孵育5h3.水化基底膜：吸出小室中殘余液體，每孔加入70ul含無血清1640培養(yǎng)液，37，30min，吸去培養(yǎng)基4.對數生長期的細胞，胰酶消化細胞，0.1%血清1640懸浮，計數，稀釋至密度為1106/ml，每空中加200l細胞懸液5.24孔板下室一般加入600l含30%新生牛血清的1640培養(yǎng)基6.24h后，棄去孔中培液，PBS洗2遍，甲醇固定20分鐘，0.1%結晶紫染色15-20 min，用清水洗3遍以上，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞7.400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數個人覺得做Transwell就像小馬過河一樣，要講究個體化，不同的細胞侵襲能力不同，膠的稀釋倍數、細胞上樣量、上下室血清濃度差以及孵育時間也不同。對于你的問題，我覺的不管是在溫箱中放5個小時或者是在超靜工作臺中風干，其主要目的是為了讓Matrigel從液體狀變成膠凍狀，在溫箱中放置5個小時后，拿出來上室中肯定會有液體殘留，此時一定要將殘留的液體洗干凈，然后在水化一下基底膜。(1) 吸去培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦除上室聚碳酸酯膜內側面貼壁細胞，用0.01MPBS漂洗兩次，4%多聚甲醛固定10 分鐘；(2) 吸去固定液，將膜風干，每孔加0.6ml 0.1%結晶紫染液，室溫中放置20 分鐘；(3) 輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將上室取出，從聚碳酸酯膜內側面用吸水紙吸干水分，自然干燥；(4) 測定前，將各實驗組上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6ml 33醋酸脫色，充分振蕩，每組設定5 復孔；同時設置調零孔（33醋酸）；比色：每孔取脫色液150l 加入96 孔板中，在570nm 處測定OD 值。2步驟21 Transwell小室制備211 無基質膠Transwell小室制備 包被基底膜（冰浴操作）：用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面。24孔板每空50-70uL:20uL Matrigel + 160uL DMEM/F-124風干，過夜。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37，30min。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80l (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37 30min使Matrigel聚合成凝膠。212 有基質膠的Transwell小室制備Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300l預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置1530min，使基質膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。22 制備細胞懸液 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓1224h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗12遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調整細胞密度至110105，個人認為不要超過5105。具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細胞，其侵襲能力是不同的。個人經驗，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果最后用計數法統(tǒng)計結果的話將難以計數；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內還要有一定量的細胞存在。個人認為，對照組和處理盡量不要分開計數，因為細胞數目的差異會嚴重影響實驗結果。如果需要對細胞預處理而不得不分開計數，那么計數一定要多重復幾次，力求準確，盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。23 接種細胞 取細胞懸液100200l加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200l。 24孔板下室一般加入500l含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)1248h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。以我的課題為例，我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力，還對細胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細胞，24h內對細胞增殖并無明顯抑制，但24h后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以，用這個濃度來做Transwell，處理時間也必須限定在24h內，否則一旦藥物抑制了細胞增殖或者誘導出凋亡，使處理組細胞數目少于對照組，那么就難以肯定穿過膜的細胞比對照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細胞數目本身就比對照組少而引起的了。時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細胞內會有一定量的MMPs儲存，短時間內可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進去，進而發(fā)揮作用，影響MMPs表達，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點，也可選擇多個時間點研究時間依賴效應，但前提是這個時間范圍內細胞數目不能有明顯變化。另外，我看到細胞在小室內的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時的形態(tài)，不過會聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F(xiàn)象在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產生，這是正?，F(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培養(yǎng)一段時間后，膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴重。因此，個人建議，最好接種細胞后12h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產生。 24 結果統(tǒng)計檢測穿過的細胞數有兩種方法：241 直接計數法2411 “貼壁”細胞計數這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去。通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞 染色：常用的染色方法有結晶紫染色、臺肦藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個人推薦采用0.1%結晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢：(1). 不需要固定細胞，直接染色即可。(2). 配制簡單方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm 測其OD值，間接反映細胞數。個人認為這是結晶紫染色最大的優(yōu)勢所在。因為，雖然經過準確的細胞計數，往往穿過膜的細胞數仍難以準確控制，可能某一批實驗穿過的細胞會特別多，以致細胞成堆，這種情況下就難以計數了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標儀檢測。使用結晶紫染色要注意，染色前要將膜風干，否則可能會染不上。 細胞計數：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側附著的細胞。也有不少人用手術刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點浪費。取若干個視野計數細胞個數。論壇里一般采用35個視野，也有人用10個，都是隨機選取，個人認為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會摻進人為影響，特別是計數視野較少的時候。我選取16個視野，不是隨機選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。不同廠家不同型號的小室，膜的面積不盡相同，但個人認為，拍照時還是應當選取固定的位置，并選擇盡可能多的視野。2412 “非貼壁”細胞計數由于某些細胞自身的原因或某些膜的關系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進下室。這種情況我沒有遇到過，根據論壇里提供的經驗，可以收集下層培養(yǎng)液，用流式細胞儀計數細胞量，也可用細胞計數的方法直接在鏡下計數，個人認為MTT應該也是可以用的，有興趣的可以試試看。 241 間接計數法間接計數法主要用于穿過細胞過多，而無法通過計數獲得準確的細胞數所采用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。2411 MTT法 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞 24孔板中加入500l含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37 4h后取出。 24孔板中加入500l DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10min，使甲臜充分溶