引物設計需要注意事項.doc

引物設計需要注意事項一、PCR引物設計的11條黃金法則1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長度一般在1530堿基之間。引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。3.引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72。GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復性條件最佳。4.引物3端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。引物3端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。6. 堿基要隨機分布。引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應盡量使其G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。8. 引物5 端和中間G值應該相對較高，而3 端G值較低。G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應當選用5 端和中間G值相對較高，而3 端G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3 端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進行分析）9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3 端開始的，不能進行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。10. 擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G）小于58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。11. 引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。 值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。 要設計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設計引物。一般引物長度為1530堿基，擴增片段長度為100600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區(qū)域設計引物。同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的互補。 引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3端開始的。這里還需提醒的是3端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。 綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則： 引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。二、引物的二次篩選引物的二次篩選是指在初次篩選出的幾對引物中進一步篩選出適合我們進行特異、高效PCR擴增的那對引物。本步應注意以下兩點， 一是得到的一系列引物分別在Genebank中進行回檢。也就是把每條引物在比對工具(/blast/) 的blastnr中進行同源性檢索，棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯配的引物。一般連續(xù)10 bp以上的同源有可能形成比較穩(wěn)定的錯配，特別是引物的3端應避免連續(xù)5-6 bp的同源。二是以mRNA為模板設計引物時要先利用生物信息學的知識大致判斷外顯子與內(nèi)含子的剪接位點(例如http:/CCR-081./GENESCAN.html的GENESCAN工具或者GeneParser軟件，然后棄掉正好位于剪接位點的引物。三、引物的最終評估當我們經(jīng)過初次篩選和二次篩選后得到的那對引物便可以用于合成，合成后我們經(jīng)過PCR擴增可以對引物進行最終的評估。一是PCR擴增的特異性和效率。經(jīng)過PCR條件優(yōu)化后能否獲得特異性條帶，即無目的條帶之外的多余