半定量和實(shí)時(shí)定量PCR步驟.doc

半定量和實(shí)時(shí)定量PCR步驟實(shí)驗(yàn)原理：RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)步驟：Trizol法RNA提取步驟1、提取總RNA2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)3、PCR反應(yīng)以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考：1樣品RNA的抽提取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30孵育2到3分鐘。4下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30孵育10分鐘后，于4下12000rpm離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?下7000rpm離心5分鐘。RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。溶解RNA沉淀溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40l用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80待用。2RNA質(zhì)量檢測(cè)1）紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液濃度和純度。濃度測(cè)定A260下讀值為1表示40gRNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計(jì)算公式為：A260稀釋倍數(shù)40g/ml。具體計(jì)算如下：RNA溶于40lDEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495l的TE中，測(cè)得A260=0.21RNA濃度=0.2110040g/ml=840g/ml或0.84g/l取5ul用來測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35l，剩余RNA總量為：35l0.84g/l=29.4g純度檢測(cè)RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60，10ml的10MOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。10MOPS電泳緩沖液濃度成分0.4MMOPS，pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25l溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。準(zhǔn)備RNA樣品取3gRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10g/ml。加熱至70孵育15分鐘使樣品變性。電泳上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。56V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少23cm。紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。3樣品cDNA合成反應(yīng)體系序號(hào)反應(yīng)物劑量序號(hào)反應(yīng)物劑量1逆轉(zhuǎn)錄buffer2l5逆轉(zhuǎn)錄MMLV0.5l2上游引物0.2l6DEPC水5l3下游引物0.2l7RNA模版2l4dNTP0.1l8總體積10l輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心?；旌弦涸诩尤肽孓D(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5l，37水浴60分鐘。取出后立即95干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80待用。4梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（-actin）實(shí)時(shí)定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)步驟一、組織抽提：1.取組織塊50-100用液氮在研缽中研磨成粉末2.移入玻璃勻漿器加入1mlTrizol抽打勻漿3.移入1.5ml新離心管用5ml針頭抽打4.冰上孵育5分鐘5.離心12,000g45分鐘取上清液移入1.5ml新離心管6.加0.2ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘7.離心12,000g410分鐘取上層液相移入1.5ml新離心管8.加0.5ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘9.離心12,000g45分鐘棄去上清液10.加入1ml75%乙醇，震蕩11.離心7,500g,4,5分鐘棄去上清液12.室溫下使之變透明13.加入DEPC處理水10l-35l溶解RNA（可保存在液氮或低溫冰箱）14.走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計(jì)檢測(cè)260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度二、RT反應(yīng)體系RT反應(yīng)體系（第一步）：約20分鐘RNA抽提物5lRadome引物2lRNAsin0.5l1.6515分鐘2.立即放入冰浴RT反應(yīng)體系（第二步）：約2小時(shí)RNAsin0.5l10mMdNTP1l5RT緩沖液4l25mMMgCl24lAMV逆轉(zhuǎn)錄酶3l1.371.5小時(shí)2.945-10分鐘3.反應(yīng)物保存于-20或進(jìn)行PCR三PCR反應(yīng)體系1)、PCR反應(yīng)體系：約4.5小時(shí)25mMMgCl22l10PCR緩沖液5l10mMdNTP1l上下游引物10pmol/l2.5l2CDNA模板2.5lddH2O34lTaq酶0.5l輕質(zhì)石蠟油50l100l1.942分鐘，551分鐘，722分鐘為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán)2.9445秒，5540秒，721分鐘為第二步30個(gè)循環(huán)3.7210分鐘4.取出后45分鐘后-20保存或走電泳2)、PCR反應(yīng)體系：約5小時(shí)25mMMgCl23l10PCR緩沖液5l10mMdNTP1l上下游引物10pmol/l2.5l2CDNA模板5lddH2O30lTaq酶1l輕質(zhì)石蠟油50l100l1.942分鐘，551分鐘，722分鐘為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán)2.9445