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牛胚胎移植簡(jiǎn)介 一 胚胎移植的技術(shù)程序二 胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景 一 胚胎移植的技術(shù)程序 胚胎移植的技術(shù)程序包括供體和受體的準(zhǔn)備 供體超數(shù)排卵處理和配種 胚胎的收集 胚胎的檢查 胚胎移植等為了從供體母畜得到較多供移植的胚胎 需對(duì)供體母畜進(jìn)行超數(shù)排卵處理 同時(shí) 胚胎移植成功與否和供體 受體發(fā)情同期化成度密切相關(guān) 故需人為地控制供體和受體地發(fā)情時(shí)間 進(jìn)行同期化處理 所以 超數(shù)排卵和同期發(fā)情是進(jìn)行胚胎移植必須首先完成地兩個(gè)基本步驟 一 供體和受體母畜的準(zhǔn)備 供體應(yīng)該是良種母畜 不僅應(yīng)具有較高的育種價(jià)值 而且應(yīng)該有良好的繁殖機(jī)能 經(jīng)產(chǎn)母畜應(yīng)在生殖機(jī)能恢復(fù)正常后方可作為供體 如豬和牛在分娩兩個(gè)月后方可用作供體母畜 已證明對(duì)超數(shù)排卵處理發(fā)應(yīng)良好的母畜可反復(fù)用作供體 每頭供體需準(zhǔn)備數(shù)頭受體 受體母畜可選用非良品種的個(gè)體 但應(yīng)具有良好的繁殖性能和健康狀態(tài) 體況中上等 在擁有大量母畜的情況下 可選擇與供體發(fā)情時(shí)間相同的自然發(fā)情個(gè)體作受體 供體與受體母畜發(fā)情時(shí)間前后相差不宜超過一天 由于在一般情況下難以找到足夠數(shù)量的自然發(fā)情母畜作受體 所以多采用對(duì)受體母畜進(jìn)行同期發(fā)情處理 其方法見發(fā)情控制技術(shù) 二 超數(shù)排卵處理 在母畜發(fā)情周期中的適當(dāng)時(shí)間 注射促性腺技術(shù) 是卵巢上有比自然生理狀態(tài)下更多的卵泡發(fā)育并排卵 這種方法稱超數(shù)排卵 Superovulation 簡(jiǎn)稱超排 1 超排處理的意義很顯然 如果不能得到足夠數(shù)量的胚胎 就無法充分發(fā)揮胚胎移植的優(yōu)勢(shì) 所以對(duì)供體母畜進(jìn)行超排處理已成為胚胎移植技術(shù)程序中不可缺少的一個(gè)環(huán)節(jié) 從理論上講經(jīng)超排處理后排出的卵子越多越好 而事實(shí)上如果一次排出的卵子太多 往往會(huì)因?yàn)榇傩韵偌に厥褂脛┝窟^大而影響胚胎的質(zhì)量 出現(xiàn)受精率降低 同時(shí)胚胎的收集率也降低 對(duì)于牛和羊一般認(rèn)為一次排出10 15枚卵子的超排效果較為理想 2 超排處理方法在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時(shí)期 利用外源性促性腺激素處理 增進(jìn)卵巢的生理活性 誘發(fā)許多卵泡同時(shí)發(fā)育成熟并排卵 1 母牛在發(fā)情周期的第16或17天肌肉或皮下注射PMSG1500 2000IU 該方法是按照發(fā)情周期的規(guī)律 在黃體期即將結(jié)束 卵泡期即將來臨前 順勢(shì)促進(jìn)較多的卵泡生長(zhǎng)和成熟 這種超排方法必須和發(fā)情周期的進(jìn)程配合好 所以在時(shí)間安排上受到限制 應(yīng)用很不方便 另一種方法是在發(fā)情周期的中期 在注射促性腺激素的同時(shí) 注射或子宮灌注PGF2a或其類似物以溶解黃體 一般是在發(fā)情周期第10 13天內(nèi)進(jìn)行 具體做法是在注射PMSG后 隔日肌肉注射PGF2a或5 10mg 或子宮灌注PGF2a2 3mg 如用FSH 則連續(xù)注射4 5天 每天兩次 總劑量為30 40mg 國產(chǎn)品400 500大鼠單位 在第5次注射FSH的同時(shí)注射PGF2a 2 母羊在發(fā)情周期的第16 18天 一次肌注 或皮下 PMSG750 1500IU 或每天注射兩次FSH 連3 4天 出現(xiàn)發(fā)情后或配種當(dāng)日再肌注hCG500 700IU 也可象母牛一樣 在發(fā)情周期中期處理 即在注射PMSG之后 隔日注射PGF2a或其類似物 如采用FSH 用量為10 20mg 或200 300大鼠單位 分3天6次注射 第5次同時(shí)注射PGF2a 用PMSG超排處理牛 羊 雖然使用方便 僅需注射一次 但由于其半衰期長(zhǎng) 會(huì)產(chǎn)生后效應(yīng) 導(dǎo)至發(fā)情期延長(zhǎng) 因此 用PMSG進(jìn)行超排受到局限 結(jié)合注射PMSG抗血清可以消除半衰期過長(zhǎng)的副作用 目前多采用FSH進(jìn)行超排 連續(xù)注射3 5天 每天2次 劑量均等或遞減 效果較好 超排效果受動(dòng)物的遺傳特性 體況 年齡 發(fā)情周期的階段 產(chǎn)后時(shí)間的長(zhǎng)短 卵巢功能 季節(jié) 激素的品質(zhì)和用量等多種因素影響 所以 不同的品種 不同的個(gè)體 對(duì)超排處理的反應(yīng)差異極大 超排效果很不穩(wěn)定 這方面迄今仍是胚胎移植中有待改進(jìn)的問題之一 三 供體母畜的配種 經(jīng)超排處理夫人 母畜 在表現(xiàn)發(fā)情后 應(yīng)根據(jù)育種的需要 選擇優(yōu)良公畜的精液 適時(shí)進(jìn)行人工授精 為了得到較多得發(fā)育正常的胚胎 應(yīng)使用活率高 密度大的精液 而且可適當(dāng)?shù)脑黾尤斯な芫拇螖?shù) 兩次受精間隔8 10個(gè)小時(shí) 四 胚胎的收集 胚胎的收集是利用沖卵液將胚胎由生殖道中沖出 并收集在器皿中 收集胚胎有兩種方法 即手術(shù)法和非手術(shù)法 前者可用于各種家畜胚胎的收集 后者僅適用于牛 馬等大家畜 且只能在胚胎進(jìn)入子宮角后收集 收集胚胎時(shí)應(yīng)考慮配種時(shí)間 排卵的大致時(shí)間 胚胎運(yùn)行的速度和發(fā)育階段等因素 只有這樣才能順利地完成胚胎的收集過程 并得到較高的胚胎回收率 各種家畜授精后胚胎發(fā)育的速度和運(yùn)行情況見表 胚胎收集的時(shí)間不應(yīng)該早于排卵后的第一天 最早應(yīng)在受精卵完成第一次卵裂之后 否則不易辨別卵子是否受精 收集時(shí)間一般在配種后的3 8天 牛最好是在配種后的6 8天 即胚胎發(fā)育至桑椹胚或者早期囊胚 以便非手術(shù)法收集和移植 1 手術(shù)法收集胚胎根據(jù)畜種的不同及外科手術(shù)的要求 在腹中線或腹側(cè)作一切口 先將一側(cè)輸卵管及子宮角移出腹腔 用注射器吸取沖卵液注入輸卵管或子宮角內(nèi)進(jìn)行沖洗 并觀察卵巢上的排卵情況 然后將該側(cè)送回腹腔 并移出另一側(cè) 用同樣方法進(jìn)行沖洗 手術(shù)法沖洗胚胎有以下幾種方式 圖10 2 一種方式是用注射器的磨鈍針頭刺入子宮角頂端 注入沖洗液 然后再輸卵管的傘部接取沖卵液 這種方式適用于牛 羊 兔等 另一種方式?jīng)_洗的方向與此相反 即由傘部注入沖洗液 在子宮角上端接取 豬和馬的子宮角與輸卵管的接合部有一活塞結(jié)構(gòu) 用第一種方式 沖洗液不易通過 因此多采用第二種方式 上述兩種方式是當(dāng)胚胎還處于輸卵管時(shí)采用 當(dāng)確認(rèn)所有的胚胎都已進(jìn)入子宮角內(nèi)時(shí) 可采用沖洗子宮角的方式 即從子宮角上端注入沖卵液 由基部接取 或者相反 這種方式適合于各種家畜 沖卵液用量以子宮角容積大小而異 沖卵操作 要求迅速準(zhǔn)確 以防止對(duì)傷口 生殖器官和沖卵液的污染 力求避免給動(dòng)物帶來刺激和對(duì)生殖器管造成損傷 一般來說 術(shù)后生殖器官容易發(fā)生不同程度的粘聯(lián) 嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成不孕 這是手術(shù)法收集胚胎最大的缺點(diǎn) 沖洗之后 應(yīng)立即縫合傷口 母畜應(yīng)單獨(dú)飼養(yǎng) 并隨時(shí)觀察其傷口的愈合情況 2 非手術(shù)法收集胚胎牛 馬也可采用非手術(shù)法收集胚胎 由于它比手術(shù)法簡(jiǎn)單易行 而且對(duì)生殖器官的傷害程度較小 因此在生產(chǎn)中較多采用此法 牛的非手術(shù)法收集胚胎可利用雙通式或三通式導(dǎo)管沖卵器 其差別在于雙通式采卵器沖卵液注入和流出是經(jīng)同一管道完成的 而三通式采卵器沖卵液的注入和流出是經(jīng)過兩個(gè)不同的管道完成的 無論是雙通式還是三通式 其外管前端均連接一氣囊 當(dāng)沖卵器插入子宮角內(nèi)時(shí) 充氣沖卵液流入子宮體并沿著子宮頸口流出 每側(cè)子宮角需沖卵液100 500ml 沖卵液的導(dǎo)出應(yīng)順暢迅速 并盡可能將沖卵液全部收回 為此 沖卵時(shí)最好用手在直腸內(nèi)將子宮角提高并略加按壓 以利于沖卵液流出 胚胎的回收率與沖卵液回收的完全程度呈正相關(guān) 應(yīng)用非手術(shù)法收集胚胎時(shí) 只有當(dāng)胚胎都進(jìn)入子宮角后方可進(jìn)行 顯然 這種方法無法收集停留在輸卵管內(nèi)的胚胎 因此 用非手術(shù)法收集牛 馬的胚胎時(shí) 一般在配種后的6 8天進(jìn)行 收集胚胎的沖洗液有多種 主要有杜氏磷酸鹽緩沖液 D PBS 布林斯特氏液 合成輸卵管液 SOF 惠屯氏液 Ham sF 110以及TCM 199 尤以D PBS最常用 它們除含有多種鹽外 還含有多種有機(jī)成分 不但可用于胚胎收集 還可用于胚胎體外培養(yǎng) 冷凍保存及解凍等 收集胚胎的沖洗液可不含牛血清白蛋白 培養(yǎng)和保存時(shí)則需加入 或以胎犢血清代替 血清白蛋白的含量一般為0 3 1 犢牛血清需在56 時(shí)持續(xù)滅活30分鐘 沖卵液 培養(yǎng)液中血清的含量一半分別為5 10 20 五 胚胎的檢查 胚胎的檢查包括兩個(gè)過程 一是檢胚 二是胚胎鑒定 檢胚時(shí)須將收集到的沖卵液靜置10分鐘 等胚胎下沉后移去上層液 直接活吸取底部液體 然后置于實(shí)體顯微鏡下檢胚 檢到的胚胎應(yīng)及時(shí)移入含有20 犢牛血清的PBS培養(yǎng)液中進(jìn)行鑒定 胚胎鑒定的方法有以下幾種 1 形態(tài)學(xué)法這是目前鑒定哺乳動(dòng)物胚胎最廣泛 最實(shí)用的方法 一般是在30 60倍的實(shí)體顯微鏡下或120 160倍的生物顯微鏡下對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)定 評(píng)定的內(nèi)容包括 1 卵子是否受精 未受精卵的特點(diǎn)是透明帶內(nèi)有分布均勻的顆粒 無卵裂球 2 透明帶形狀 厚度 有無破損等 3 卵裂球的致密程度 卵黃周隙內(nèi)是否有游離細(xì)胞或細(xì)胞碎片 細(xì)胞大小是否有差異 4 胚胎的發(fā)育程度是否與胚齡一致 胚胎的透明度 胚胎的可見結(jié)構(gòu)是否完正等 根據(jù)胚胎的形態(tài)特征將胚胎分為A 優(yōu) B 良 C 中 D 劣 四個(gè)等級(jí) 2 熒光活體染色法將二醋酸熒光素 FDA 加入待鑒定的胚胎中 培養(yǎng)3 6分鐘 活胚胎顯示熒光 死胚胎無熒光 這種方法比較簡(jiǎn)單 而且可驗(yàn)證上述形態(tài)學(xué)對(duì)胚胎做出的分類結(jié)果 因此 在生產(chǎn)上應(yīng)用的也比較多 3 測(cè)定代謝活性法通過測(cè)定胚胎的代謝活性 鑒定胚胎的活力 其方法是將待鑒定的胚胎放入含有葡萄糖的培養(yǎng)液中 培養(yǎng)1小時(shí)后 測(cè)定葡萄糖的消耗量 每培養(yǎng)1小時(shí)消耗葡萄糖2 5ug以上者為活胚胎 應(yīng)該注意的是在檢胚及進(jìn)行胚胎分類時(shí) 胚胎均應(yīng)保持在不低于25 的環(huán)境溫度下 六 胚胎的移植 胚胎移植也有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種方式 前者適用于各種家畜 后者僅適用于牛 馬等大家畜 用作受體的母畜應(yīng)具有明顯的發(fā)情癥狀 發(fā)情時(shí)間應(yīng)與供體母畜一致 1 手術(shù)移植法受體母畜應(yīng)和供體母畜同時(shí)做好術(shù)前準(zhǔn)備 在進(jìn)行胚胎檢查的同時(shí)或之后 立即在受體腹部作一切口 找到排卵側(cè)的卵巢并觀察黃體發(fā)育情況 根據(jù)胚胎的發(fā)育階段 用注射器或移植管將胚胎注入排卵卵巢同側(cè)子宮角上端或輸卵腹部?jī)?nèi) 然后迅速復(fù)位 縫合 2 非手術(shù)移植法牛的非手術(shù)移植法是將一只手伸入直腸 先檢查黃體位于那一側(cè)卵巢及其發(fā)育情況 然后類似于人工授精技術(shù) 用手把握住子宮頸 另一只手將胚胎移植搶插入與黃體同側(cè)的子宮角內(nèi) 注入胚胎 所移胚胎僅限于來自供體子宮角的胚胎 移植時(shí)動(dòng)作要迅速準(zhǔn)確 避免對(duì)組織造成損傷 黃體發(fā)育不良的母畜最好不用作受體 以免影響受胎率 七 供體和受體術(shù)后觀察 對(duì)術(shù)后的受體和供體不但要注意觀察它們的健康狀況 同時(shí)要留心觀察它們?cè)陬A(yù)定的時(shí)間是否發(fā)情 供體在下一次發(fā)情時(shí)可照常配種 或經(jīng)過兩 三個(gè)月再重復(fù)當(dāng)供體 供體母畜的正常發(fā)情是我們所希望的 而受體母畜則相反 術(shù)后發(fā)情則說明未受胎的原因可能是胚胎移植死亡或在移植過程中丟失 也可能是移植的胚胎本來就有缺陷 如果未發(fā)情則需進(jìn)一步觀察 在適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行妊娠檢查 如確已妊娠 則需加強(qiáng)飼養(yǎng)管理 二 胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景 一 胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用 人工受精 胚胎分割胚胎分割的目的有兩個(gè) 一個(gè)是進(jìn)行性別鑒別 另一個(gè)是增加胚胎利用率 降低生產(chǎn)成本 這一技術(shù)的關(guān)鍵就是保護(hù)液選擇和切割技術(shù) 我國在這一領(lǐng)域的研究和應(yīng)用與世界先進(jìn)水平接近 據(jù)報(bào)道 內(nèi)蒙古采用鮮胚切割的牛胚發(fā)育率為80 凍胚為56 9 這項(xiàng)技術(shù)的研究與應(yīng)用潛力較大 胚胎性別鑒定過去采用細(xì)胞遺傳學(xué) 特異性抗原檢測(cè) 目前采用Y 特異性DNA探針技術(shù) 在國內(nèi)外已開始應(yīng)用 這項(xiàng)技術(shù)要求一定的設(shè)備和分子生物學(xué)技術(shù) 但準(zhǔn)確度高 據(jù)中國農(nóng)科院畜牧所羅應(yīng)榮等報(bào)道 應(yīng)用PCR試劑盒鑒定性別準(zhǔn)確率為97 7 切割取樣后的凍胚成功率為45 4 冷凍胚胎切割取樣后移植成功率為38 略低于全胚成功率 如何縮小這個(gè)差距 也是需研究改進(jìn)的 胚胎移植提高雙胎率是肉牛生產(chǎn)的重要技術(shù)英國的Powson等人給僅存一個(gè)黃體的子宮角中放入一個(gè)受精卵 雙胎率達(dá)到73 據(jù)河北省胚胎移植研究中心桑潤(rùn)之等報(bào)道 把7日齡的凍胚移植到兩側(cè)子宮角受孕率61 5 雙胎率50 移植到一側(cè)受孕率52 2 雙胎率41 7 6 在這一方面的研究我國與國外還有一定差距 盡管胚移技術(shù)在國外已經(jīng)是一項(xiàng)比較成熟的技術(shù) 但在國內(nèi) 由于技術(shù) 管理上的問題 推廣面積小 如內(nèi)蒙古1993 1997年完成移植肉牛657例 河北省移植受體母牛122頭 還是推廣較好的省份 從胚胎生產(chǎn)角度來看 依靠進(jìn)口胚胎 勢(shì)必造成成本太大 不利于推廣 國產(chǎn)胚胎因技術(shù) 設(shè)備落后 質(zhì)量不移定 也沒有形成規(guī)模 但成本較低 從胚胎移植技術(shù)來看 由于牛的品種個(gè)體一致性差 在超排藥物種類選擇 尤其是適宜劑量等方面掌握的不好 缺乏足夠的試驗(yàn)數(shù)據(jù) 積累的經(jīng)驗(yàn)還不夠 同期發(fā)情處理 最佳移植條件的確定與檢測(cè) 性別鑒定技術(shù)的實(shí)用化程度等方面都還沒有形成配套技術(shù) 熟練影響胚胎移植技術(shù)推廣的重要原因 胚胎移植目前存在的主要問題 理論上講胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用可使母畜的繁殖力比在自然狀況下提高很多倍 但從目前的技術(shù)水平和所取得的成績(jī)看 胚胎移植的效果比理論上的預(yù)期值低很多 例如牛的胚胎移植 每頭供體經(jīng)一次超排處理后移植 最后產(chǎn)犢一般是2 4頭 胚胎移植目前存在的主要問題有以下幾個(gè)方面 我國奶牛平均產(chǎn)奶量為1546kg 而世界奶牛平均產(chǎn)奶量為2010kg 發(fā)達(dá)國家平均為6000 7000kg 我國肉牛日增重平均1 2kg 而發(fā)達(dá)國家平均為1 8 2 4kg 我省黃牛改良工作自70年代以來 大力推廣黃牛凍配改良 取得了很大成效 但是應(yīng)用新的繁殖生物技術(shù) 胚胎移植技術(shù) 擴(kuò)繁引進(jìn)的良種肉牛奶牛的群體 加速提高我省肉牛 奶牛的生產(chǎn)水平 提高養(yǎng)牛的經(jīng)濟(jì)效益已經(jīng)顯得十分迫切和需要 如何解決胚胎移植的技術(shù)問題 以推動(dòng)這項(xiàng)技術(shù)在黃牛改良上的應(yīng)用 尚需在以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究 牛的超數(shù)排卵 同期發(fā)情及沖卵技術(shù)的改進(jìn)研究 以提高采集有效受精卵的數(shù)量 非手術(shù)法胚胎移植試驗(yàn)與技術(shù)改進(jìn) 以提高非手術(shù)法胚胎移植的受胎率 胚胎分割技術(shù)的試驗(yàn)與應(yīng)用 以提高胚胎的利用率 降低生產(chǎn)成本 進(jìn)行胚胎性別的鑒定 有目的的控制公母群體數(shù)量 胚胎移植雙卵技術(shù)試驗(yàn) 以提高肉牛生產(chǎn)效益 1 超排效果不夠穩(wěn)定利用外援性促性腺激素刺激多排卵并不能每次都得到預(yù)期效果 不同的個(gè)體對(duì)超排處理的反應(yīng)差異極大 排卵率很不穩(wěn)定 有的個(gè)體甚