銀杏葉黃酮提取及含量測(cè)定.doc

銀杏葉黃酮提取及含量測(cè)定1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 掌握銀杏葉中黃酮的提取方法2、 了解銀杏葉中黃酮的含量測(cè)定2、 實(shí)驗(yàn)原理 近幾年來，隨著對(duì)黃酮類化合物研究的日益深入與重視，黃酮類化合物提取技術(shù)的發(fā)展也得到了促進(jìn)。目前提取黃酮類化合物的方法主要包括有機(jī)溶劑浸提法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法、微波提取法和酶提取法等。有機(jī)溶劑浸提法目前國內(nèi)外使用最廣泛的銀杏葉中黃酮的提取方法就是有機(jī)溶劑提取法，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或某些極性較大的混合溶劑，如甲醇水（）溶液。由于甲醇的毒性、揮發(fā)性較大，因此一般采用乙醇作為提取劑。銀杏葉干燥粉碎后用有機(jī)溶劑浸泡、提取、過濾，濾液中的溶劑經(jīng)減壓蒸餾除去后得銀杏葉浸膏粗提物。徐桂花等提取銀杏葉中黃酮類化合物時(shí)，采用乙醇（）溶液為提取劑，提取溫度為，料液質(zhì)量濃度比為比，提取時(shí)間為。由于乙醇提取工藝在安全性、溶劑成本、效率及雜質(zhì)酚酸去除等方面都不能應(yīng)對(duì)日益嚴(yán)酷的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)，張林濤等1提出了以硼砂氫氧化鈣堿水為溶劑提取銀杏葉黃酮，其黃酮提取率與文獻(xiàn)值相近，但提取工藝時(shí)間縮短為。超聲波提取法超聲波提取法是利用攪拌作用、強(qiáng)烈的振動(dòng)和空間效應(yīng)、高的加速度等使藥物有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高提取率，縮短提取時(shí)間，并能消除高溫對(duì)提取成分影響的一種提取法。劉晶芝等2運(yùn)用了超聲波技術(shù)與水浸提取相結(jié)合的方法得出超聲波提取的最佳工藝條件為：超聲頻率，超聲處理時(shí)間，料液質(zhì)量比比，提取溫度，靜置，提取率為。郭國瑞等3以水為介質(zhì)，超聲波提取銀杏葉中黃酮苷，與常規(guī)水浸提法比較，超聲波提取效率大大提高，確定超聲波提取的最佳工藝為：超聲處理時(shí)間，料液質(zhì)量比比，提取溫度，提取率為。超臨界流體萃取法超臨界流體萃取法是一種以超臨界流體代替常規(guī)有機(jī)溶劑對(duì)有效成分進(jìn)行萃取和分離的新技術(shù)?？勺鳛槌R界流體的物質(zhì)很多，其中二氧化碳臨界溫度（）接近室溫，且具有無色、無毒、無味、不易燃、化學(xué)惰性、價(jià)廉、易制成高純氣體等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，特別在中藥材及其制劑中更顯示出其獨(dú)特、簡(jiǎn)便、快速、具有較高的選擇性、提取雜質(zhì)少、可直接進(jìn)樣分析的優(yōu)點(diǎn)。鄧啟煥等4探討了超臨界萃取銀杏葉有效成分的影響因素，最佳條件為萃取壓力、時(shí)間、粒度、溫度，經(jīng)測(cè)定銀杏葉黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為，高于國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。微波提取法微波提取法是利用分子或離子在微波場(chǎng)中的導(dǎo)電效應(yīng)直接對(duì)物質(zhì)進(jìn)行加熱從而提取植物細(xì)胞內(nèi)耐熱物質(zhì)的新工藝。曾里等5的研究表明以乙醇溶液作溶劑比以水作溶劑的效果好，最佳條件為以乙醇（）溶液為提取劑，解凍處理。張鵬等6對(duì)微波法提取銀杏葉中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了研究，最佳提取條件為以乙醇（）溶液為提取劑，料液比為比，回流溫度，微波時(shí)間，該條件下總黃酮提取率為。但微波提取存在局限性，它要求被處理的物料具有良好的吸水性而且只適用于生物細(xì)胞內(nèi)耐熱物質(zhì)的分離提取，否則細(xì)胞難以吸收足夠的微波將自身擊破，產(chǎn)物也難以迅速釋放出來。酶提取法酶提取法是利用酶反應(yīng)的高度專一性，將細(xì)胞壁的組成成分水解或降解，破壞細(xì)胞壁，從而提高有效成分的提取率。在銀杏葉總黃酮提取過程中，由于細(xì)胞壁的束縛作用，總黃酮不易溶出。酶提取法能將組成細(xì)胞壁的纖維素骨架逐級(jí)降解成葡萄糖，進(jìn)而破壞細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出。吳梅林等7采用纖維素酶對(duì)銀杏中黃酮類化合物進(jìn)行了提取，三者的酶解條件分別為酶質(zhì)量濃度，酶作用時(shí)間，酶解溫度，酶解介質(zhì)，乙醇（）溶液，提取溫度；纖維素酶濃度，酶解，酶解溫度 ，酶解時(shí)間 ；維素酶用量銀杏葉、酶解時(shí)間。此外，許明淑等利用轉(zhuǎn)苷酶和麥芽糖基供體將極性低的黃酮苷元轉(zhuǎn)為黃酮苷，提高了總黃酮在醇水中的溶解率。結(jié)果表明：溫度為， 為，反應(yīng)時(shí)間為時(shí)，總黃酮的提取率比未加酶對(duì)照組增加了。王建偉等采用復(fù)合酶對(duì)銀杏葉進(jìn)行初步的預(yù)處理，然后用轉(zhuǎn)化酶將黃酮苷轉(zhuǎn)化為生物活性較強(qiáng)的苷元類物質(zhì)，銀杏提取物（含銀杏黃酮醇苷不小于）經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后各苷元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：槲皮素占，山奈酚占，異鼠李素占，總苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)為，顯著提高了銀杏葉提取物（）的生理活性和苷元黃酮的含量，從而大大提高了銀杏黃酮的生物學(xué)效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)中提取采用第一種方法溶劑提取法。對(duì)銀杏中黃酮的總含量測(cè)定的方法較多, 但對(duì)采用微波干燥方式對(duì)葉片進(jìn)行干燥的報(bào)道較少。本文運(yùn)用U V 法測(cè)定銀杏葉及樹皮中黃酮含量。3、 器材與試劑1、 器材：銀杏葉、索氏提取裝置、紫外分光光度儀、電爐、烘箱、10ml容量瓶、50ml容量瓶、試管、膠頭滴管、玻璃棒、溫度計(jì)、圓底燒瓶、石棉網(wǎng)。研缽、烘箱2、 試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液、甲醇、30%乙醇、NaNO2、A1(NO3)3、NaOH、糖類（葡萄精、D果糖、蔗糖，乳糖和麥芽糖）、氯仿等四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)黃酮類化合物的提?。簻?zhǔn)確稱量15g左右銀杏葉，于索氏抽提器中用甲醇提取曲，濃縮并轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，用甲醇定容，搖勻后取1 ml， 于10mI容量瓶中用30 乙醇一水稀釋至刻度，供分析用(二)分光光度法測(cè)定總黃酮含量： 以蘆丁為標(biāo)樣測(cè)定銀杏葉中總黃酮的步驟如下。將一定量樣品液置10mI容量瓶中， 用30% 乙醇補(bǔ)充至5 m1， 加入03mI NaNO2(1：20)，搖勻，放置5min后加入03m1 A1(NO3)3(1：10)， 6min后再加入2ml 1molLNaOH，混勻，用30% 乙醇稀釋至刻度，lOmin后于波長(zhǎng)51Oam處進(jìn)行比色測(cè)定，試劑為空白參比。有關(guān)條件試驗(yàn)結(jié)果：1比色溶液顯色后，在4h內(nèi)吸光度的變化 5 ，說明黃酮類與鋁生成絡(luò)臺(tái)物顯色是穩(wěn)定的。2 .加入的NaNO2、Al(NO3)3和NaOH的量分別在0104mi，01O4ml和O5 4ml濺定的吸光度基本不變。3加入20倍于蘆丁含量的下列之的糖類；葡萄精、D果糖、蔗糖，乳糖和麥芽糖，不干擾黃酮的比色測(cè)定。4提取液中含有的葉綠素等雜質(zhì)的影響：將銀杏葉提取液濃縮， 以熱水溶解后，用氯仿脫脂2次，除去葉綠素等溶于氯仿的成分，測(cè)得總黃酮含量平均低11 (部分I游離的黃酮甙元溶于氯仿)，葉綠索等雜質(zhì)對(duì)總黃酮測(cè)定影響不會(huì)超過11 。5標(biāo)準(zhǔn)曲線： 以O(shè)091mgml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色測(cè)定，用最小二乘法作線性回歸，得方程丫=08965X一0001403，r=099989。6方法的回收率和精密度；用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定了樣品提取和比色測(cè)定流程的回收率，結(jié)果表明：銀杏葉用甲醇一索氏法提取有效成分，稀釋后直接比色測(cè)定，黃酮甙能定量回收。變異系數(shù)為1.6% (n=4)。五、結(jié)果與討論1、不同時(shí)期的銀杏葉中黃酮含量是否一致？2、本實(shí)驗(yàn)中溶劑提取法有什么優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？3、簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)中要