「氨基移換反應(yīng)及其產(chǎn)物鑒定」.doc

裝 訂 線專業(yè)： 姓名： 學(xué)號： 日期： 地點： 實驗報告課程名稱： 生物化學(xué)實驗 指導(dǎo)老師： 成績： 實驗名稱：氨基移換反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定 實驗類型： 同組學(xué)生姓名： 一、實驗?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、實驗?nèi)容和原理（必填）三、主要儀器設(shè)備（必填）四、操作方法和實驗步驟五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理六、實驗結(jié)果與分析（必填）七、討論、心得一、實驗?zāi)康?、 學(xué)習(xí)一種鑒定氨基移換反應(yīng)的簡便方法及其原理。2、 掌握紙層析的原理和操作技術(shù)。3、 了解氨基移換反應(yīng)在代謝中的作用。二、實驗原理 在氨基移換酶的催化下，氨基酸的氨基和酮酸的酮基可以互換，這種反應(yīng)稱為氨基移換反應(yīng)。它對于生物體內(nèi)的各大類物質(zhì)的代謝在相互聯(lián)系、相互轉(zhuǎn)化上起著很重要的作用。轉(zhuǎn)氨酶的種類很多，具有專一性，最適合的PH接近7.4。轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于機體的各種組織中，在肝、心、腎等組織中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性較高。 本實驗利用紙層析法，檢查由酮戊二酸和丙氨酸在牛蛙肝細胞內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用下所生成的谷氨酸，從而定性證明組織內(nèi)的氨基移換作用。反應(yīng)式如下： L谷氨酸脫氫酶在體內(nèi)特別是在肝細胞內(nèi)含量豐富，活性高，催化L谷氨酸氧化脫NH2，加碘乙酸（或溴乙酸）能抑制其活性，從而可以保護氨基移換反應(yīng)的產(chǎn)物L(fēng)谷氨酸。 三、儀器和試劑1. 材料：動物肝臟（蟾蜍或豬）2g2. 試劑： 0.01mol/L pH7.4 磷酸緩沖液 （轉(zhuǎn)氨反應(yīng)所需緩沖溶液） 0.1mol/L pH7.4 丙氨酸 （轉(zhuǎn)氨反應(yīng)底物，同時作為紙層析點樣時的標(biāo)準(zhǔn)品） 0.1mol/L pH7.4 酮戊二酸 （轉(zhuǎn)氨反應(yīng)底物） 0.1mol/L pH7.4 L谷氨酸（紙層析點樣時的標(biāo)準(zhǔn)品） 展層溶劑酚溶液（紙層析用） 10% 三氯乙酸（中止酶促反應(yīng)，同時使轉(zhuǎn)氨酶及其它蛋白質(zhì)變性、沉淀下來） 0.25% 碘乙酸溶液（抑制L谷氨酸脫氫酶活性）3. 儀器： 試管及試管架 恒溫水浴箱（37、100） 鉛筆和尺 玻璃毛細管 新華定性濾紙（ 12cm） 剪刀和鑷子 烘箱（80） 滴管 康氏皿（做層析缸） 電吹風(fēng)機及噴霧器（噴灑茚三酮丙酮溶液）四、實驗步驟1、酶液的制備 取新鮮牛蛙的肝臟約3g，在研缽中用剪刀充分剪碎。加少許石英砂，先研磨數(shù)分鐘（約10分鐘），再加入3mL磷酸緩沖液迅速研磨，成為均勻的漿質(zhì)后，再加入9ml磷酸緩沖液，用24層紗布加上玻璃漏斗過濾，留取濾液，即得轉(zhuǎn)氨酶提取液（為粗酶液）。2、氨基移換反應(yīng) 取4支潔凈、干燥的試管，按下表操作（單位：ml） 管號 項目1234酶液（mL）11110.25%碘乙酸溶液（mL）0.50.50.50.5 置37恒溫水浴保溫5min（預(yù)熱反應(yīng)體系）100沸水浴5min（滅活酶）0.1mol/L丙氨酸溶液（mL）11/10.1mol/L酮戊二酸（mL）1/11磷酸緩沖液（mL）1221酶促反應(yīng)混勻, 置37恒溫水浴保溫40min(經(jīng)常搖動)中止酶促反應(yīng)滴加10%三氯乙酸溶液2滴,置100恒溫水浴保溫5min3、層析及顯色 取新華定性濾紙（直徑12cm）一張（保持干凈），按圖1做出點樣位置。找出圓心，用圓規(guī)畫一直徑1.52cm的小圓圈，用鉛筆尖在圓心處截一小圓孔（孔徑約0.20.3cm）。在點樣點的圓圈內(nèi)側(cè)用鉛筆輕輕標(biāo)記樣品號，用玻璃毛細管依次在各原點上點樣，標(biāo)準(zhǔn)品（丙氨酸、谷氨酸）各點兩次，其余樣品各點3次。點樣時，要待前次點樣干燥后方可再次點樣，點樣直徑不超過0.3cm。另取1.5cm（34）cm濾紙，先將下端剪成須狀，卷捻成“燈芯”，上端插入小圓孔，然后將該濾紙平放在盛有展層溶劑的康氏皿中，使“燈芯”下端須狀浸入展層溶劑中，再在濾紙上方蓋上另一康氏皿（圖2）。展層劑沿“燈芯”上升到濾紙，再向四周擴散,待溶劑前沿距康氏皿外槽內(nèi)緣0.5cm(約需半小時)時，取出濾紙，用鑷子拔出“燈芯”，濾紙用電吹風(fēng)吹干，再用噴霧器向濾紙均勻噴灑0.3%茚三酮丙酮溶液，用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干顯色（或者放入80烘箱中顯色3min）。 圖1 層析濾紙示意圖 圖2 層析裝置示意圖五、結(jié)果分析1號反應(yīng)管：部分丙氨酸將氨基轉(zhuǎn)移給酮戊二酸，生成了谷氨酸，所以有丙氨酸和谷氨酸兩條顯色帶。2號反應(yīng)管：只有單一底物丙氨酸，沒有發(fā)生氨基移換反應(yīng)。所以只有一條丙氨酸的顯色帶。3號反應(yīng)管：只有單一底物酮戊二酸，沒有發(fā)生氨基移換反應(yīng)。所以沒有出現(xiàn)顯色帶。但仔細觀察可以發(fā)現(xiàn)有極少量谷氨酸的顯色帶，可能是由于濾紙“燈芯”遭到1號反應(yīng)管中樣品的污染或者酶液中本身存在的少量谷氨酸。4號反應(yīng)管：雖然有兩種底物，但是轉(zhuǎn)氨酶提前100變性失活了，也沒有發(fā)生氨基移換反應(yīng)。只有一條丙氨酸的顯色帶。5號谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：出現(xiàn)一條圓弧狀的紫紅色（半徑較?。╋@色帶。6號丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：出現(xiàn)一條圓弧狀的紫紅色（半徑較大）顯色帶。 注意事項：1、整個操作過程中勿用手直接接觸層析用的定性濾紙和紙質(zhì)燈芯，需要帶手套操作。2、點樣時，要待前次點樣干燥后方可再次點樣，點樣點盡量小而圓，直徑不超過0.3cm。3、樣品點樣點不要吹得太干，吹風(fēng)溫度不宜過高，否則斑點變黃。4、使用層析劑、顯色劑時勿用手直接操作（需要戴上塑料手套，苯酚有較強腐蝕性，手上汗液有雜質(zhì)可以干擾顯色反應(yīng)）。5、防止各種樣品之間交叉污染，每點完一種樣品后，立即更換新的毛細管。六、討論、心得1、茚三酮是一個有機化合物，被廣泛用于檢測氨、一級和二級胺，尤其是氨基酸。茚三酮與它們反應(yīng)時產(chǎn)生深藍色或紫色，稱為羅曼紫。法醫(yī)學(xué)上這個反應(yīng)被用于鑒定指紋。2、標(biāo)準(zhǔn)品（丙氨酸、谷氨酸）各點2次，切勿過多。樣品各點34次，依反應(yīng)效果好壞而定。3、整個操作過程中勿用手直接接觸層析用的定性濾紙和紙質(zhì)燈芯，防止濾紙被污染。4、轉(zhuǎn)氨基作用：指的是一種氨基酸alpha-氨基轉(zhuǎn)移到一種alpha-酮酸上的過程。轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸脫氨基作用的一種途徑。其實可以看成是氨基酸的氨基與alpha-酮酸的酮基進行了交換。結(jié)果是