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提取大豆異黃酮糖苷和苷元并比較其免疫能力的強(qiáng)弱實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)南方醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院10級(jí)臨床醫(yī)學(xué)院（婦幼保健）石惠卿10級(jí)臨床醫(yī)學(xué)院（婦幼保?。┝_玉云10級(jí)臨床醫(yī)學(xué)院（婦幼保?。┝侄A10級(jí)臨床醫(yī)學(xué)院（婦幼保?。┡頃?shū)杰10級(jí)臨床醫(yī)學(xué)院（婦幼保健）劉穎慧摘要 大豆異黃酮是一種生理活性物質(zhì)，更是人體生理生化中不可缺少的成分，它對(duì)調(diào)節(jié)人體新陳代謝，預(yù)防中老年疾病有一定的意義。 研究和開(kāi)發(fā)含有大豆異黃酮的各種新產(chǎn)品，不僅可以提高大豆的附加值，而且可創(chuàng)造出樂(lè)觀的經(jīng)濟(jì)效益，經(jīng)調(diào)查，市場(chǎng)對(duì)大豆異黃酮的年需求量在1500噸，而目前的年產(chǎn)量為500噸。因此大豆異黃酮的研究與開(kāi)發(fā)就有很大的市場(chǎng)潛力。本次試驗(yàn)著重于異黃酮糖苷和苷元的提取，及其在免疫功能上的差異的研究。關(guān)鍵詞：大豆，異黃酮糖苷，異黃酮苷元，免疫目 錄1.前言22.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?3.實(shí)驗(yàn)原理44.實(shí)驗(yàn)器材與試劑55.實(shí)驗(yàn)步驟66.結(jié)果預(yù)測(cè)及分析87.可行性評(píng)估88.注意事項(xiàng)99.參考文獻(xiàn)91.前言大豆是豆科植物的成熟種子，大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)與雌激素相似，是一類植物雌激素。大豆異黃酮有很多方面的藥理活性，包括抗癌預(yù)防和治療心血管疾病，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松和更年期綜合癥以及免疫調(diào)節(jié)作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮主要在腸道被吸收，吸收率為10%40%。目前對(duì)大豆異黃酮 功效 性質(zhì)的研究報(bào)道很多，但關(guān)于大豆異黃酮糖苷和苷元免疫功能對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究尚少，為明確大豆異黃酮糖苷及其苷元組分 的生理作用 ，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究大豆異黃酮糖苷和苷元對(duì)小鼠體液免疫功能的影響 。2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1從大豆中提取異黃酮糖苷及苷元2.2對(duì)大豆異黃酮糖苷及苷元進(jìn)行定性鑒定2.3對(duì)大豆異黃酮糖苷及苷元進(jìn)行定量鑒定2.4比較大豆異黃酮糖苷和異黃酮苷元 對(duì)小鼠血液中溶血素含量的影響 2.5通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，比較出異黃酮糖苷和異黃酮苷元免疫功能的大小，為進(jìn)一步的研究提供參考。3,實(shí)驗(yàn)原理:3.1異黃酮糖苷及苷元的提取原理異黃酮類化合物屬于多酚類化合物，它的母體為3一苯基苯并毗哺酮.異黃酮類化合物常溫下為固體，熔點(diǎn)在11以上，性質(zhì)穩(wěn)定，易于貯藏。易溶于有機(jī)溶劑如氯仿、二甲基甲酸胺、乙醇等，不溶于水、甲醇等極性溶劑。本次試驗(yàn)以大豆為原材料，制備異黃酮糖苷。 后用酸水解法 得異黃酮苷元。3.2異黃酮糖苷及苷元的定性鑒定原理異黃酮糖苷為含糖衍生物，所以可以發(fā)生molish反應(yīng)，產(chǎn)生紫環(huán)。而異黃酮苷元為結(jié)合與糖的非糖部分，不會(huì)與molish反應(yīng)。3.3異黃酮糖苷及苷元對(duì)血液中溶血素的影響比較異黃酮糖苷和異黃酮苷元 可促進(jìn)小鼠分泌溶血素，以雞紅細(xì)胞懸液為免疫原進(jìn)行免疫，雞紅細(xì)胞懸液可與小鼠體內(nèi)的溶血素發(fā)生免疫反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定溶血素光密度值來(lái)推斷糖苷和苷元的免疫功能強(qiáng)弱。3.4小鼠糞便中糖苷和苷元含量的測(cè)定通過(guò)測(cè)定小鼠糞便糖苷和苷元的含量，從而間接測(cè)出小鼠對(duì)糖苷和苷元的吸收多少來(lái)推斷糖酐和甘愿的免疫功能強(qiáng)弱。4實(shí)驗(yàn)器材與實(shí)劑4.1實(shí)驗(yàn)器材抽濾裝置、索氏提取裝置、烘箱、恒溫水槽、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、回流裝置、分光光度計(jì)、電動(dòng)攪拌器、溫度計(jì)、小試管、試管夾、標(biāo)簽、錐形瓶、量筒、燒杯、蒸發(fā)皿、圓底燒瓶、石棉網(wǎng)、膠頭滴管、鐵架臺(tái)、漏斗、玻璃棒、灌胃器、微量加量器、布氏漏斗、酒精燈、濾紙、棉花、棉簽、高速冷凍離心機(jī)、制備型高效液相色譜分析儀、分析性高效液相色譜分析儀。42實(shí)驗(yàn)材料及試劑材料：豆粉200g,活體小鼠12只，80%乙醇溶液，1mol/L鹽酸溶液，乙酸乙酯，molish試劑，濃硫酸、50mmol/L醋酸鈉緩沖液甲醇乙腈（體積比為40:40:20）混合液、流動(dòng)相II為50mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH5）甲醇（體積比為80：20）混合液、甲醇水（體積比為30:70）混合液、甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.1%的乙酸水溶液（體積比為23:77）、5%生理鹽水雞紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、補(bǔ)體溶液4.3 5%生理鹽水雞紅細(xì)胞懸液配制方法：雞血紅細(xì)胞置于Alsever氏液中在4攝氏度下冰箱保存，臨用前用生理鹽水洗滌3次，配成5%混懸液即可。補(bǔ)體溶液配制方法：補(bǔ)體以23只豚鼠血清混合，用生理鹽水配成10%。 5實(shí)驗(yàn)步驟5.1從大豆中提取異黃酮糖苷5.1.1稱取200g粒度為20到60目的豆粉 置于烘箱中通風(fēng)干燥32h,至其變?yōu)楹阒亍?.1.2干燥后的豆粉進(jìn)行索氏提取，去除殘留油脂，直至回流液變?yōu)闊o(wú)色時(shí)將濾紙筒放入烘箱干燥。5.1.3每次稱量30g脫脂豆粉的樣品加入80%乙醇溶液（原料與溶劑比1:20），在恒溫水浴中回流恒速攪拌提取4h，對(duì)所得粗提液真空抽濾兩遍，棄去濾渣。5.1.4收集的粗濾液在70攝氏度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去大量的乙醇溶液，濃縮產(chǎn)物通風(fēng)干燥轉(zhuǎn)化為固體。 5.2大豆異黃酮苷元的制備5.2.1 稱取200g粒度為20到60目的豆粉 置于烘箱中通風(fēng)干燥32h,至其變?yōu)楹阒亍?.2.2干燥后的豆粉進(jìn)行索氏提取，去除殘留油脂，直至回流液變?yōu)闊o(wú)色時(shí)將濾紙筒放入烘箱干燥。5.2.3每次稱量30g脫脂豆粉的樣品加入80%乙醇溶液（原料與溶劑比1:20），在恒溫水浴中回流恒速攪拌提取4h，對(duì)所得粗提液真空抽濾兩遍，棄去濾渣。5.2.4收集的粗濾液在70攝氏度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去大量的乙醇溶液，濃縮產(chǎn)物通風(fēng)干燥轉(zhuǎn)化為固體。 5.2.5將異黃酮糖苷試樣用六倍體積1mol/l鹽酸溶液水解4小時(shí)，水解產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯提取，蒸餾，冷凍干燥，得大豆異黃酮苷元。5.3 大豆異黃酮糖苷和異黃酮苷元的定性鑒定 5.3.1將大豆異黃酮糖苷和異黃酮苷元制成溶液。5.3.2加兩滴Molish試劑，搖勻。 5.3.3傾斜試管，沿試管壁小心加入1ml濃硫酸，勿搖動(dòng)。5.3.4小心豎直后觀察兩層液面交界處的顏色變化。5.4 大豆異黃酮糖苷的定量鑒定 5.4.1制備色譜柱NovaPakHRC18(100mm*25mm i.d.,6um),流動(dòng)相為甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.1%的乙酸水溶液（體積比為23:77） 5.4.2操作儀器使流速為20Ml/min.檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm,進(jìn)樣體積1ml. 5.4.3峰面積定量，外標(biāo)法計(jì)算。5.5 大豆異黃酮苷元的定量鑒定 5.5.1制備色譜柱NoPakHRC18(100mm*25mm i.d.6um),流動(dòng)相為甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.2%的乙酸水溶液（體積比為81：19） 5.5.2操作儀器使流速為30Ml/min ,檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm,進(jìn)樣體積1ml. 5.5.3峰面積定量，外標(biāo)法計(jì)算。56異黃酮糖苷及苷元對(duì)血液中溶血素的影響比較 5.6.1 隨機(jī)取健康小鼠雌雄各6只。分為三組，一組為正常雌雄對(duì)照組，2組為異黃酮糖苷雌雄組，3組為異黃酮苷元雌雄組。 劑量是40100mg/kg,每組4只，按劑量連續(xù)灌胃21天，對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。 5.6.2 所有組小鼠都要進(jìn)行本試驗(yàn)，每只小鼠腹腔注射5%生理鹽水雞紅細(xì)胞懸液0.2ml進(jìn)行免疫,免疫7天。5.6.3摘眼球取血，室溫下放置1h,用長(zhǎng)針將凝血與管壁分離，使血清充分滲出。 5.6.4取血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清1ml,與5%雞血紅細(xì)胞懸液0.5ml,10%補(bǔ)體0.5ml混合，在37攝氏度保溫30min,0攝氏度下終止反應(yīng)。 5.6.5離心后，取上清液于UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)540nm處比色，記錄光密度值OD，另設(shè)不加血清空白對(duì)照，取其上清液作為比色時(shí)調(diào)“0”基準(zhǔn)。以光密度值讀數(shù)作為判斷血清溶血素指標(biāo)，比較各組差異。 5.6.6 分別收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便烘干，恒重取10g,用色譜甲醇溶解，過(guò)0.45um濾膜后，HPLC對(duì)糞便中大豆異黃酮糖苷和苷元進(jìn)行檢驗(yàn)。 試驗(yàn)檢測(cè)方法 采用高效液相色譜法測(cè)定大豆異黃酮含量。 色譜條件：色譜柱HypersilODS2C18柱，250mm*4.6mmID,5um. 流動(dòng)相：甲醇/水=40+60:柱溫30攝氏度：流速1.0ml/min；進(jìn)樣量：10ul:檢測(cè)波長(zhǎng)260nm分析時(shí)間35min/樣品以保留時(shí)間定性，峰面積定量，外標(biāo)法計(jì)算。5.7 小鼠糞便大豆異黃酮糖苷和異黃酮苷元?dú)埩艉繙y(cè)定 5.7.1分別收集各組小鼠糞便5.7.2HPLC法測(cè)量大豆異黃酮糖苷小鼠組糞便中糖苷的含量5.7.3HPLC法測(cè)量大豆異黃酮苷元小鼠組糞便中苷元的含量 6結(jié)果與分析6.1對(duì)小鼠體液免疫功能的影響按5.6步驟對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1組別 鼠數(shù)（只） 劑量 (ml/只) 光密度值（OD）(X+SD)苷元雌鼠 2 0.4 苷元雄鼠 2 0.4糖苷雌鼠 2 0.4糖苷雄鼠 2 0.4空白雌鼠 2 0空白雄鼠 2 06.2小鼠糞便中糖苷和苷元的測(cè)量按照5.7步驟對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如下：組別糖苷（mg）苷元(mg)苷元雌鼠苷元雄鼠糖苷雌鼠糖苷雄鼠空白雌鼠空白雄鼠6.3結(jié)果預(yù)測(cè)與討論： 6.3.1若實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)得糖苷小鼠組的光密度值大于苷元小鼠組，且糖苷小鼠組的糖苷排出量大于苷元小鼠組的苷元排出量，則糖苷的免疫功能強(qiáng)于糖苷。 6.3.2若實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)得糖苷小鼠組的光密度值大于苷元小鼠組，且糖苷小鼠組的糖苷排出量小于苷元小鼠組的苷元排出量，則無(wú)法證明糖苷和苷元的免疫功能強(qiáng)弱。 6.3.3若實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)得糖苷小鼠組的光密度值小于苷元小鼠組，且糖苷小鼠組的糖苷排出量大于苷元小鼠組的苷元排出量，則苷元的免疫功能強(qiáng)于糖苷。 6.3.4若實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)得糖苷小鼠組的光密度值小于苷元小鼠組，且糖苷小鼠組的糖苷排出量小于苷元小鼠組的苷元排出量，則無(wú)法證明糖苷和苷元的免疫能力強(qiáng)弱。7可行性報(bào)告7.1 在實(shí)驗(yàn)5.4中，通過(guò)對(duì)小鼠溶血素光密度的測(cè)定以及對(duì)大豆異黃酮糖苷與大豆異黃酮苷元的吸收來(lái)比較大豆異黃酮糖苷與大豆異黃酮苷元在免疫功能上的差異。7.3 本實(shí)驗(yàn)所用的小鼠數(shù)目有限，故忽略小鼠個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)所造成的影響。7.4 由于本實(shí)驗(yàn)中大豆異黃酮苷元的制取是通過(guò)大豆異黃酮糖苷的水解所得，為節(jié)約時(shí)間，可一次性制得大量大豆異黃酮糖苷，以備后需。7.5 本次實(shí)驗(yàn)只是從表面上去探討大豆異黃酮糖苷與大豆異黃酮苷元免疫功能的差異，至于大豆異黃酮成分如何在體內(nèi)作用，以及糖苷和苷元的進(jìn)一步提取有待專家的進(jìn)一步研究論證。8注意事項(xiàng)8.1 molish反應(yīng)非常靈敏，0.001%葡萄糖和0,0001%蔗糖既能發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，因此不可在樣品中混入紙屑等雜物。8.2對(duì)小鼠的管為何去學(xué)操作要快速準(zhǔn)確。若小鼠掙扎，應(yīng)調(diào)整姿勢(shì)。 參考文獻(xiàn)【1】 閆作梅，顧雪峰，韓俊，大豆異黃酮的功能和開(kāi)發(fā)前景的研究進(jìn)展J. 大豆通報(bào)，2006（1）：3436.【2】 皮雄娥，費(fèi)迪波，王龍英等。大豆黃酮及其生理功能的研究進(jìn)展【J】.飼料工業(yè)，2005,26,（4）:11-14【3】 付雪梅，王之盛，代天飛。大豆異黃酮的營(yíng)養(yǎng)生理功能及其在動(dòng)物生產(chǎn)中得應(yīng)用【J】。畜禽業(yè)。2005.20（6）：10-13【4】 張平，王珍喜，大豆黃酮的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)作用研究概述【J】，貴州畜牧獸醫(yī)，2006,30（6）：7-9【5】 ChangLi-Hsun,Extracting and purifying isoflavones from defatted soybean flakes using superheated water at elevated preasuresJFood chen 2004(84):279-285【6】 Suzanne Hcndrich .Bioavilability of isoflavonesJ.Chgomatography B 2002,777:203-210?！?】 李里特，李再貴，殷麗君.大豆加工與利用