乙肝病毒特性與致病機(jī)理研究進(jìn)展.doc

學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考 乙肝病毒特性與致病機(jī)理研究進(jìn)展王曉冬，王峰，呂月蒙，李強(qiáng)，張國峰，孫濤，賈亞雄 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州（730070） E-mail：摘要：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起中國及東南亞一帶病毒性肝炎的主要病原之一，有半數(shù)以上HBV感染的患者將會(huì)發(fā)展為慢性肝炎(Chronic Hepatitis, CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)，甚至肝細(xì)胞性1fl癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC )，常被形象的稱之為“慢性肝病三步曲”。新近有多項(xiàng)研究表明活化的T細(xì)胞反應(yīng)可能在HBV感染的慢性化和肝細(xì)胞損傷過程中起重要作用。CD4+Th細(xì)胞可分為Thl和Th2細(xì)胞，分別介導(dǎo)兩種不同的免疫學(xué)效應(yīng)。Thl細(xì)胞主要分泌IL-2, IFN- X和腫瘤壞死因子(TNF)等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答;Th2細(xì)胞主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等細(xì)胞因子，參與體液免疫應(yīng)答;Thl/Th2的平衡決定了免疫應(yīng)答的有效性和安全性。Thl與Th2之間存在相互制約或促進(jìn)左右，細(xì)胞因子組成一個(gè)復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及器官功能的自我穩(wěn)定。關(guān)鍵詞：細(xì)胞因子，乙型肝炎病毒，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 1.引言乙型病毒性肝炎（hepatitis B, HB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）引起的。HBV的感染不僅可以導(dǎo)致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且還與肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。20的慢性乙肝患者將發(fā)展成為肝硬化，HBV慢性感染的人罹患HCC的危險(xiǎn)性是正常人的100倍。HBV感染呈世界性分布，其中西歐、北美、澳大利亞為低流行區(qū)，乙性肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）攜帶率在2以下；東歐、日本、南美、北美和地中海國家為中流行區(qū)；中國、東南亞與南非為高流行區(qū)（HBsAg 攜帶率10左右）。全世界共有約3.5億人為HBsAg慢性攜帶者，其中3/4在亞洲。HBV感染導(dǎo)致全球每年50120萬人死亡，其中死于HCC的約占32萬。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，約60的人群感染過HBV，10的人群為攜帶者，多達(dá)1.2億。現(xiàn)有乙型肝炎患者約為1200萬，年發(fā)病率為158/10萬1-4。隨著HBV疫苗在1982年的問世，HBV感染率大大降低，抗病毒藥物的出現(xiàn)也使乙型肝炎的治療取得了一定的進(jìn)展。但是，乙型肝炎的現(xiàn)狀仍然不容樂觀，現(xiàn)有乙型肝炎患者及帶毒者數(shù)量龐大，面臨發(fā)展為肝硬化和肝癌的危險(xiǎn)，不幸的是，到目前為止，還沒有針對(duì)HBV的特效藥物。因此，乙型肝炎的治療至少在今后50年內(nèi)仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問題，尋找更有效的治療途徑是醫(yī)學(xué)研究的重大課題。2.HBV的生物學(xué)特性2.1 HBV的生物學(xué)分類1986年國際病毒革命委員會(huì)正式將人類HBV劃歸為一個(gè)新的病毒科嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）的成員。該科病毒成員除了人HBV外還有：（1）東方土撥鼠肝炎病毒（GHV），1978年在美國新澤西州和馬里蘭州等地的野生土撥鼠發(fā)現(xiàn)該病毒。東方土撥鼠肝炎和肝癌的發(fā)病率較高；（2）地松鼠肝炎病毒（GHV），是1980年在美國南加州的地松鼠中發(fā)現(xiàn)的；（3）鴨乙型肝炎病毒（DHBV），1981年在我國江蘇省啟東縣肝癌高發(fā)區(qū)分離自易發(fā)生肝癌的麻鴨，后來在北京能夠鴨和美國商品鴨中也發(fā)現(xiàn)此病毒5-6。 2.2 HBV的形態(tài)與結(jié)構(gòu) -1- HBV在動(dòng)物病毒中是不尋常的，是由于在被浸染的細(xì)胞中能產(chǎn)生多類型的與病毒相關(guān)的顆粒，電鏡下觀察HBV的提純制品，證明有三種類型顆粒7-9。 1.小球型顆粒 平均直徑為22nm，由空心病毒包膜組成，是HBV多余的衣殼蛋白，沒有病毒核酸。無感染性，但刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，具有中和病毒的作用，制備乙肝疫苗即由此種顆粒組成。 2.管型顆粒 由小球型顆粒連接而成，其長短不一。小球型顆粒和管型顆粒的產(chǎn)生是由于病毒顆粒包膜產(chǎn)量過剩。小球型顆粒和管型顆粒與Dane顆粒的比例依不同的病程差異較大，一般撒Dane顆粒的10 4 108 倍，在患者血液中的含量可高達(dá) 1013個(gè)/ml. 3.Dane顆粒 為完整的具有感染性的病毒顆粒，直徑為42nm，由包膜和核衣殼組成。核衣殼直徑為27nm，含有HBcAg，單一分子的部分雙鏈DNA以及依賴DNA的DNA聚合酶。核衣殼很重要的一個(gè)功能是作為病毒基因組的保護(hù)性容器。另一獨(dú)特的特征是P蛋白與長DNA鏈共價(jià)結(jié)合。在患者血液中的Dane顆粒含量為10 4 106個(gè)/ml. 圖一 電子顯微鏡下可以觀察到乙肝病毒3種不同的形態(tài)： 大球形顆粒，小球形顆粒和管形顆粒10 -2- 圖二 肝病毒（HBV）結(jié)構(gòu)示意圖10 2.3理化特性及抵抗力在氧化銫平衡梯度離心中，HBV顆粒（42nm）的浮力為1.22g/cm3.表面抗原顆粒（22 nm） 為1.22g/cm3，病毒外膜成分含有來自宿主細(xì)胞的脂類，約占外膜干重的30%。 HBV對(duì)理化因素有較強(qiáng)的抵抗力。病毒在30 32 可存活至少6個(gè)月，在 -20 可存活15年。病毒濃度高時(shí)，60 加熱10h,或98 加熱1min,以及乙醚或pH2。4處理均不能有效滅活乙肝病毒，能夠滅活HBV的常用方法和條件包括121高壓滅菌20min, 160 干烤1h，100直接煮沸2min,以及0.5%過氧化酸，3%漂白粉溶液，5%次氯酸鈉和環(huán)氧乙烷等的直接處理。HBV的感染性并非與其抗原性和免疫原性相一致，在一些能夠滅活HBV感染性的條件下，其抗原性和免疫原性-仍可較好保留11。 2.4 HBV的基因組和蛋白組成HBV基因組結(jié)構(gòu)特殊，成不完全閉合的雙鏈形式，負(fù)（一）鏈為全長基因，約含3200個(gè)核苷酸，而正（+）鏈?zhǔn)秦?fù)鏈長度的2080%，病毒顆粒內(nèi)含有DNA聚合酶。在所有已知可感染人體而且具有獨(dú)立復(fù)制能力的雙鏈DNA病毒中，HBV基因組是最小但又是最高效的。 它具有以下4個(gè)鮮明的特點(diǎn)12-14： （1）不完全雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)； （2）利用重疊的開放讀碼框（open reading frame ORF）編碼多個(gè)蛋白質(zhì)； （3）所有調(diào)控序列均位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)； （4）基因序列具有多變性。 -3- 圖三 HBV基因組基本結(jié)構(gòu)15 HBV含有4個(gè)ORF，即S區(qū)（包括preS1、preS2及S）、C區(qū)（包括preC和C）、P區(qū)和X區(qū)16，ORF之間互相重疊。HBV有4種轉(zhuǎn)錄子，共用一個(gè)PolyA加尾信號(hào)，長度分別為3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb（圖 ）。4種mRNA合成7種病毒蛋白，即外膜蛋白（大、中、主蛋白）、核殼蛋白（前C和C蛋白）、X蛋白和P蛋白17。 外膜蛋白由S基因區(qū)編碼，包括3種外膜成分：主蛋白（small protein ,S protein, 即HBsAg）、中蛋白（middle protein ,M protein, 即preS2+HBsAg）和大蛋白（large protein ,L protein, 即preS1+preS2+HBsAg）,主蛋白在3種成分中含量最高。主蛋白和中蛋白由2.1kbmRNA翻譯而來，而大蛋白則是2.4kbmRNA的產(chǎn)物。HBV的外膜蛋白構(gòu)成病毒的外殼包裹顆粒，使病毒能夠附著和侵入新的細(xì)胞。大蛋白在病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合、病毒顆粒的包裝和自細(xì)胞向外分泌的過程中發(fā)揮重要作用。此外，外膜蛋白還含有引起宿主免疫反應(yīng)的抗原表位，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。 核殼蛋白由HBV基因組的C區(qū)編碼，存在兩種形式：核心抗原（HBcAg）和e抗原(HBeAg). HBcAg分子量21KD，是病毒核殼的組成成分，在病毒復(fù)制過程中負(fù)責(zé)對(duì)前基因組RNA包裝，這是基因組復(fù)制的必備步驟。HBcAg有較強(qiáng)的免疫原性，幾乎所有的HBV感染者均產(chǎn)生針對(duì)HBcAg的抗體。HBeAg是分泌性蛋白，先由preC+C區(qū)編碼帶有信號(hào)肽的24KD的前體蛋白，前體蛋白進(jìn)入高爾基體被蛋白酶切割后形成16KD成熟分子進(jìn)入病人的血液中，HBeAg可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，其功能尚不清楚。HBcAg和HBeAg均是3.5kbmRNA的翻譯產(chǎn)物。 P蛋白即聚合酶（polymerasa, Pol）由P基因區(qū)編碼， 是一個(gè)含816個(gè)氨基酸的大蛋白，也是3.5kbmRNA的翻譯產(chǎn)物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)P蛋白具有4個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域，P蛋白參與病毒基因組復(fù)制的全過程，每一個(gè)結(jié)構(gòu)域在基因組復(fù)制過程中都發(fā)揮不同的作用。HBV前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄過程中的幾個(gè)關(guān)鍵步驟，包括RNA的包裝、DNA合成所需的引物、以RNA和DNA為模板合成DNA以及將RNA-DNA雜交體中的RNA消化等，均涉及P蛋 -4- 白的功能。由于P蛋白的重要性，使其成為抗病毒藥物的主要靶點(diǎn)。 X蛋白由X基因區(qū)編碼，其轉(zhuǎn)錄子為0.7kbmRNA。X蛋白具有多種功能。它可反式激活HBV本身的、其它病毒或細(xì)胞的調(diào)節(jié)序列，還可以激活蛋白激酶C，從而影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。病毒在體內(nèi)復(fù)制和傳播也需要X蛋白的參與18-21。 2.5 HBV的復(fù)制在HBV的復(fù)制過程中，最突出的特點(diǎn)是，作為DNA病毒，HBV不以DNA為模板進(jìn)行復(fù)制，而是將DNA轉(zhuǎn)錄RNA中間體（RNA intermediate）或稱前基因組RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成DNA進(jìn)行復(fù)制，與逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制過程類似。HBV的復(fù)制過程有以下幾個(gè)環(huán)節(jié)22： （1）侵入：病毒顆粒的外膜蛋白和宿主細(xì)胞膜上的受體（至今不清楚）結(jié)合，脫去外殼 核心顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而脫去核殼，病毒DNA及聚合酶進(jìn)入細(xì)胞核； （2）修復(fù)：HBV聚合酶修復(fù)不完整的正鏈，使其與負(fù)鏈完全互補(bǔ)，形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA, ccc DNA）,即超螺旋結(jié)構(gòu)，是病毒復(fù)制的重要標(biāo)志； （3）轉(zhuǎn)錄：宿主RNA聚合酶以ccc DNA為模板，轉(zhuǎn)錄出長短不一的mRAN,這些mRNA分子從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)； （4）復(fù)制： mRNA分子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被翻譯成外膜、核心、X和聚合酶等多種蛋白。3.5kbmRNA被成為前基因組RNA（pregenomic RNA,pRNA）,含有病毒編碼的全部遺傳信息，既是蛋白質(zhì)翻譯的模板，也是HBV基因組復(fù)制時(shí)反轉(zhuǎn)錄的模板。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，核心蛋白包裹pRNA和聚合酶形成新生的核心顆粒，病毒復(fù)制即在其中進(jìn)行：先由病毒自身的聚合酶以pRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNA，pRNA被降解：再以負(fù)鏈為模板，合成正鏈DNA，形成部分雙鏈的環(huán)狀DNA，即成熟的病毒基因組； （5）循環(huán)：一小部分含有病毒基因組的核心顆粒重新進(jìn)入細(xì)胞核，以維持核內(nèi)一定量的ccc DNA； （6）釋放：大多數(shù)新形成的核心顆粒出芽到細(xì)胞質(zhì)，裝配好病毒的外殼，形成成熟的病毒顆粒釋放到細(xì)胞外。 圖四 HBV的復(fù)制過程23 -5- 3.HBV的致病性與免疫性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起中國及東南亞一帶病毒性肝炎的主要病原之一，有半數(shù)以上HBV感染的患者將會(huì)發(fā)展為慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis, CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)，甚至肝細(xì)胞性1fl癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC )，常被形象的稱之為“慢性肝病三步曲24。 HBV感染后導(dǎo)致乙型肝炎的致病機(jī)制迄今尚未完全闡明。目前學(xué)者們一致認(rèn)為乙型肝炎病人肝臟損傷并不是病毒在肝內(nèi)復(fù)制的直接結(jié)果，而是機(jī)體對(duì)HBV表達(dá)產(chǎn)物的免疫導(dǎo)致反應(yīng)機(jī)制所致25。 人體被HBV感染后，可產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)： （1）體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng)：受乙肝病毒感染后，機(jī)體可產(chǎn)生三種抗體，抗HBs、抗HBc 及抗HBe?？笻Bs一般在感染HBV后4周出現(xiàn)，對(duì)乙肝有保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，在醫(yī)務(wù)人員中，有抗HBs者發(fā)生乙肝的不到1%，而無抗HBs者有11%發(fā)生肝炎。但抗HBs僅能作用于細(xì)胞外的HBV，在預(yù)防感染上較重要，而在疾病恢復(fù)時(shí)尚需細(xì)胞免疫協(xié)同作用。 抗HBc的出現(xiàn)反映了HBV新近感染及正在體內(nèi)進(jìn)行增殖，因此，它可用為HBV在體內(nèi)復(fù)制的一個(gè)指標(biāo)?？笻Bc一般在感染后60150天出現(xiàn)，往往在癥狀出現(xiàn)前或出現(xiàn)不久后即存在，比抗HBs出現(xiàn)要早3187天，由于抗HBc在疾病恢復(fù)過程中不僅不升高、反而下降，因此，認(rèn)為抗HBc與抗HBs不同，它與保護(hù)無關(guān)，而與病毒增殖和肝細(xì)胞損害有關(guān)?？笻be能使病毒活力降低，可能有保護(hù)作用，但機(jī)制不一樣26。 （2）細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)：目前認(rèn)為HBV是非溶細(xì)胞性的，即不會(huì)增殖裂解被感染的細(xì)胞。因此，機(jī)體清除乙肝病毒主要依賴T細(xì)胞（Tc, T殺傷細(xì)胞）或通過抗體介導(dǎo)的K細(xì)胞來殺傷靶細(xì)胞，將病毒釋放于體液中，以后再經(jīng)抗體作用。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，凡轉(zhuǎn)為慢性肝炎者，一般T細(xì)胞數(shù)及功能較低下。因此，推測(cè)可能乙型肝炎病人T細(xì)胞功能強(qiáng)弱與臨床過程的輕重和轉(zhuǎn)歸有關(guān)。Dudleuy認(rèn)為，當(dāng)T細(xì)胞免疫功能正常，受病毒感染的肝細(xì)胞不多時(shí)，乙肝病毒很快被細(xì)胞免疫配合體液免疫予以清除，這時(shí)，由細(xì)胞免疫所造成的急性肝細(xì)胞損傷可完全恢復(fù)。如T細(xì)胞免疫功能低下，免疫反應(yīng)不足以完全破壞被病毒感染的肝細(xì)胞，或亦不能產(chǎn)生有效的抗HBs，或即使抗HBs卻無法作用于細(xì)胞內(nèi)的病毒，持續(xù)在肝細(xì)胞內(nèi)的病毒可引起免疫病理反應(yīng)而導(dǎo)致慢性持續(xù)性肝炎。如機(jī)體對(duì)病毒完全缺乏細(xì)胞免疫反應(yīng)，既不能有效地清除病毒，亦不導(dǎo)致免疫病理反應(yīng)，結(jié)果出現(xiàn)HBsAg 無癥狀攜帶癥狀。如果T細(xì)胞免疫功能過強(qiáng)，病毒感染的細(xì)胞又過多，細(xì)胞免疫反應(yīng)可迅速引起大量肝細(xì)胞壞死，臨床上表現(xiàn)為暴發(fā)性肝炎。但上述學(xué)說尚未被完全證實(shí)，通過進(jìn)一步的研究，多數(shù)人認(rèn)為細(xì)胞免疫和體液免疫相互配合發(fā)揮免疫作用。因此，抗體介導(dǎo)的K細(xì)胞作用已日益受到重視，并認(rèn)為是殺傷靶細(xì)胞的重要免疫機(jī)制。除上述T細(xì)胞作用低下外，還有人認(rèn)為慢性活動(dòng)性肝炎的發(fā)生與T細(xì)胞抑制性功能低下，Tc細(xì)胞或K細(xì)胞的殺傷功能過強(qiáng)有關(guān)，從而造成肝細(xì)胞持續(xù)損傷27。 （3）自身免疫反應(yīng)：HBV感染肝細(xì)胞后，一方面可引起肝細(xì)胞表面抗原的改變，暴露出膜上的肝特異蛋白抗原，另一方面可能因HBsAg含有與宿主肝細(xì)胞蛋白相同的抗原，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)肝細(xì)胞膜抗原成份的自身免疫反應(yīng)。通過研究，發(fā)現(xiàn)確有部分乙肝病人存在對(duì)LSP的特異抗體或細(xì)胞免疫反應(yīng)。一般認(rèn)為，如病人在病程中出現(xiàn)自身免疫反應(yīng)，則可加強(qiáng)對(duì)肝細(xì)胞的損傷而發(fā)展成為慢性活動(dòng)性肝炎。 正常人由于T細(xì)胞對(duì)自身抗體系統(tǒng)的調(diào)控，在清除老化或破壞的肝細(xì)胞時(shí)，雖可產(chǎn)生自身抗 -6- 體，但并不發(fā)生自身免疫性疾病。在慢性肝炎，特別是慢性活動(dòng)性肝炎時(shí)，由于T細(xì)胞免疫機(jī)能缺陷，乙型肝炎抗原（包括HBsAg,HBcAg及HBeAg）與宿主肝細(xì)胞表面或內(nèi)部的蛋白質(zhì)相互作用，形成含自身組織蛋白的抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性，可引起持續(xù)的自身免疫反應(yīng)；也可能由于病毒使機(jī)體免疫系統(tǒng)穩(wěn)定性發(fā)生紊亂，細(xì)胞免疫失去調(diào)控，體液免疫反應(yīng)亢進(jìn)，對(duì)宿主的自身組織產(chǎn)生抗體，發(fā)生自身組織免疫反應(yīng)，引起肝細(xì)胞損傷。有研究表明，慢性活動(dòng)性肝炎的患者出現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞表面肝特異性脂蛋白的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。有人報(bào)道，根據(jù)肝炎患者肝細(xì)胞上免疫球蛋白的沉積，提示存在與HBsAg無關(guān)的自身免疫機(jī)理。有人認(rèn)為，肝炎患者病毒性損傷可釋放肝特異抗原，使宿主致敏，并使肝損傷持續(xù)存在。因此，自身免疫反應(yīng)在慢性活動(dòng)性肝炎發(fā)病中具有一定的作用28。 （4） 細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫機(jī)制：雖然HBV特異性CTL應(yīng)答對(duì)HBV清除起著重要的作用但肝內(nèi)CTL的數(shù)目湖殺傷效應(yīng)遠(yuǎn)低于能有效控制HBV感染的能力。如果CTL通過直接殺傷效應(yīng)有效地清除含HBV的肝細(xì)胞，則多數(shù)乙肝患者有可能發(fā)生大片肝壞死及急性肝衰竭。因此，除了CTL應(yīng)答外，其他的機(jī)制有可能介導(dǎo)HBV誘發(fā)的肝損傷。體內(nèi)及體外的研究顯示，有些細(xì)胞因子可直接抑制HBV復(fù)制。通過加速HBVmRNA的降解抑制HBV的復(fù)制。有人報(bào)道，由HBV特異性的CTL產(chǎn)生的IFN-Y及TNF-a可通過非細(xì)胞致病效應(yīng)增強(qiáng)CTL的抗病毒效應(yīng)。肝內(nèi)CTL產(chǎn)生型致炎性細(xì)胞因子，包括IFN-Y，IL-12等，控制肝內(nèi)的病毒感染和復(fù)制。如果這些細(xì)胞因子分泌的不足，則形成慢性感染29-31。 新近有多項(xiàng)研究表明Th1/Th2細(xì)胞平衡在HBV感染的結(jié)局中起著關(guān)鍵的作用。CD4+Th細(xì)胞（CD4+輔助性T細(xì)胞）可分為Thl和Th2細(xì)胞，分別介導(dǎo)兩種不同的免疫學(xué)效應(yīng)。Thl細(xì)胞主要分泌IL-2, IFN- X和腫瘤壞死因子(TNF)等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答;Th2細(xì)胞主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等細(xì)胞因子，參與體液免疫應(yīng)答;Thl/Th2的平衡決定了免疫應(yīng)答的有效性和安全性。Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，傾向于發(fā)生急性自限性感染和HBV清除；而Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，傾向于發(fā)生持續(xù)的慢性HBV感染?；罨腡h1優(yōu)勢(shì)反應(yīng)可以強(qiáng)化充分的HBV特異性CTL反應(yīng)。慢性HBV感染者中，HBcAg/HBeAg特異性的Th1/Th2細(xì)胞平衡被打破（分泌性HBeAg耗竭了Th1細(xì)胞，HBeAg特異性Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)）。體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)是被不同的Th細(xì)胞亞群所調(diào)節(jié)的：體液免疫主要由Th2細(xì)胞調(diào)節(jié)，細(xì)胞免疫主要由Th1細(xì)胞調(diào)節(jié)。Th細(xì)胞亞群失衡將嚴(yán)重?cái)_亂體液免疫和細(xì)胞免疫32-34。 在鼠模型中觀察到影響 HBcAg/ HBeAg特異性 Th1/Th2細(xì)胞平衡的因素包括35: 抗原構(gòu)成 （HBcAg 對(duì) HBeAg）； 宿主 MHC 和 T細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn) ； Th1 細(xì)胞和 Th2 細(xì)胞的交互調(diào)節(jié) 分泌性 HBeAg對(duì) Th1細(xì)胞的抑制； 細(xì)胞因子體內(nèi)治療使HBV特異性Th細(xì)胞亞群反應(yīng)向 Th1或 Th2 傾斜。 干擾素能誘導(dǎo)IL-122亞單位的表達(dá)，可以使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，這是干擾素調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡的分子機(jī)制之一。 最新的研究認(rèn)為,CTL在不損傷肝細(xì)胞的情況下也可能清除HBV DNA、核殼蛋白和DNA復(fù)制中間體，即“非溶細(xì)胞性清除機(jī)制”。這種作用是通過Th1型細(xì)胞因子誘導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的，慢性乙型肝炎的恢復(fù)伴隨著Th1型細(xì)胞因子反應(yīng)上調(diào)，在病毒清除時(shí)干擾素水平有顯著升高。在黑猩猩中也發(fā)現(xiàn)HBV DNA水平的下降伴隨著干擾素的增加。在干擾素抗病毒治療顯現(xiàn)持續(xù)反應(yīng)者中，肝內(nèi)HBV特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)和Th1型細(xì)胞因子顯著增加存在相關(guān)性，外周血淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)也以Th1型占優(yōu)勢(shì)，這說明干擾素的抗病毒效應(yīng)在很大 -7- 程度上是通過Th1型細(xì)胞因子而實(shí)現(xiàn)的36-38。 4. 乙型肝炎的抗病毒治療和特異性免疫重建乙型肝炎治療的目的是減輕肝臟病變，防止或延緩發(fā)展為肝硬化、肝癌，最終目標(biāo)是徹底清除病毒，達(dá)到完全治愈。除一般的保護(hù)肝臟和免疫調(diào)節(jié)治療外，抗病毒治療是肝炎治療的重點(diǎn)也是難點(diǎn)。 到目前為止，獲得美國食品與藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)并在臨床應(yīng)用的抗HBV藥物有兩大類：干擾素及核苷類似物，它們的代表藥物分別是a干擾素（interferon-a, IFN-a）,拉米夫定（Lamivudine, 3CT）39。 4.1 干擾素干擾素本身是機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，具有抗病毒、抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。 干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用包括以下幾個(gè)方面40-41： （1）調(diào)整Th1/Th2細(xì)胞平衡，促進(jìn)Th1優(yōu)勢(shì)反應(yīng)； （2）使CD4/CD8比值恢復(fù)正常；激活NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒（ADCC）活性； （3）能誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞表面主要組織相容復(fù)合體（MHC）-類抗原表達(dá)，有利于CTL對(duì)感染細(xì)胞的識(shí)別和攻擊； （4）能激活抗原提呈細(xì)胞，增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞的功能； （5）能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，誘導(dǎo)釋放溶酶體酶； （6）調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，如IL-1、IL-2、TNF、有絲分裂因子、巨噬細(xì)胞激活因子等的分泌，參與免疫增強(qiáng)反應(yīng)。 4.2拉米夫定拉米夫定抑制HBV DNA復(fù)制迅速、療效確切。但拉米夫定的免疫調(diào)節(jié)作用并未得到肯定。早年的一項(xiàng)研究認(rèn)為，拉米夫定可以使血清HBV DNA迅速下降，但不能重新恢復(fù)受損的HBV特異性T細(xì)胞反應(yīng)。 最近的研究認(rèn)為，拉米夫定可以重建HBV特異性細(xì)胞免疫在拉米夫定治療過程中測(cè)定T細(xì)胞功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，拉米夫定在大幅度降低病毒和抗原數(shù)量的同時(shí)，可使長期處于對(duì)HBV低反應(yīng)狀態(tài)的T細(xì)胞功能得以恢復(fù)。在一組HBeAg陽性、ALT升高單獨(dú)應(yīng)用拉米夫定的病例中，觀察到拉米夫定可以克服慢性HBV感染狀態(tài)時(shí)CTL低應(yīng)答狀態(tài)，使CTL對(duì)外源性刺激敏感。在拉米夫定治療后714天，可以測(cè)得明顯的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)HBV核殼抗原的反應(yīng)，這種反應(yīng)在12例患者中有10例呈持續(xù)性，其出現(xiàn)繼之以快速且顯著的血清病毒水平的下降。伴隨著血清病毒水平的下降，拉米夫定治療后慢性乙型肝炎患者有效的抗病毒T細(xì)胞反應(yīng)可以得到恢復(fù)和重建；拉米夫定還可增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)絲裂原和回憶抗原的反應(yīng)，說明拉米夫定的效應(yīng)并不局限于HBV特異性T細(xì)胞42。 一般認(rèn)為干擾素和拉米夫定治療顯效的近期均不能清除細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA,停藥后部分病例容易復(fù)發(fā)，這些復(fù)發(fā)病例很可能沒有建立起充分的抗病毒免疫反應(yīng)。當(dāng)充分正規(guī)的治療使抗病毒免疫反應(yīng)穩(wěn)固重建后，細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA也許可以清除43。 近年來核苷類藥物的研發(fā)在國際上很活躍，隨著抗病毒藥物的逐漸增多，藥物的聯(lián)合 -8- 應(yīng)用為提高療效和降低耐藥提供了可能。 5.乙型肝炎的基因治療所謂乙型肝炎的基因治療是指將正常的野生型基因或特定設(shè)計(jì)的治療基因?qū)霗C(jī)體或特定的細(xì)胞內(nèi)替代、修正、補(bǔ)償有缺陷的基因功能；或封閉、抑制異常表達(dá)的基因以達(dá)到治療某種疾病的目的。目前乙型肝炎基因治療的主要策略包括：反義技術(shù)、反基因技術(shù)、核酶、DNA疫苗、干擾性多肽或蛋白質(zhì)以及單鏈抗體等。 5.1反義技術(shù)反義技術(shù)是指設(shè)計(jì)與mRNA序列互補(bǔ)的核酸分子，導(dǎo)入細(xì)胞，使其遵循堿基配對(duì)原則與mRNA特異性位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制或阻止蛋白質(zhì)的翻譯，達(dá)到抗病毒的目的。反義技術(shù)有反義寡聚核糖核苷酸（antisense oligodexynucleotide, ASODN）和反義RNA（antisense RNA）。ASODN是人工合成的由12 30個(gè)堿基組成的與靶mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸片段。它的作用機(jī)制包括以下幾個(gè)方面： （1）ASODN與靶mRNA結(jié)合，形成DNA-RNA雜化分子，阻止蛋白質(zhì)的翻譯，并誘導(dǎo)RNaseH降解靶mRNA； （2）作用于mRNA5端，阻止帽子結(jié)構(gòu)的形成，影響mRNA的成熟； （3）作用于polyA的形成位點(diǎn)，阻止mRNA的成熟及向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移。由于ASODN在細(xì)胞或體內(nèi)易被核酸降解失活，為增強(qiáng)其穩(wěn)定性提高抑制作用，需要對(duì)ASODN進(jìn)行修飾?，F(xiàn)常用的修飾方法包括硫代磷酸化和甲基化，亦有報(bào)道用聚乙二胺與ASODN結(jié)合可阻止在體內(nèi)降解。經(jīng)過修飾后的ASODN在透膜性和穩(wěn)定方面都有很大提高。體外研究表明，針對(duì)HBV S、C、P、X區(qū)基因的ASODN均取得相應(yīng)的抑制效果。反義RNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與基因的mRNA完全互補(bǔ)，從而阻止蛋白質(zhì)的翻譯。 5.2 反基因技術(shù)與反義技術(shù)不同，反基因技術(shù)是根據(jù)三螺旋結(jié)構(gòu)DNA形成的原理，以靶基因中同聚嘌呤-嘧啶區(qū)域?yàn)榘形稽c(diǎn)，設(shè)計(jì)、合成反基因寡核苷酸或三螺旋形成寡核苷酸，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，通過與雙鏈DNA形成三螺旋結(jié)構(gòu)，抑制或阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄。 5.3 核酶（Ribozyme, Rz） 核酶（Ribozyme, Rz）是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可特異性地與靶基因結(jié)合并切割靶mRNA。近年來，應(yīng)用Rz已成功地在細(xì)胞內(nèi)抑制HBV的基因表達(dá)。最近，一種針對(duì)HBVmRNA的經(jīng)化學(xué)修飾的Rz已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。 5.4 DAN疫苗（DNA vaccine） DAN疫苗（DNA vaccine）又稱基因疫苗或核酸疫苗，是指將編碼某一特定蛋白質(zhì)抗原的基因片段插入適當(dāng)?shù)恼婧思?xì)胞表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后經(jīng)肌肉注射或基因槍技術(shù)直接接種到機(jī)體中，宿主細(xì)胞攝取質(zhì)粒后，表達(dá)抗原蛋白，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。針對(duì)HBV的基因疫苗一般選擇HBV C區(qū)和S區(qū)為靶點(diǎn)構(gòu)建質(zhì)粒，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答 ，達(dá)到清除病毒的目的。目前已有一批針對(duì)HIV、HBV及流感病毒的預(yù)防及治療型DNA疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。 -9- 5.5 負(fù)性突變體技術(shù)負(fù)性突變體技術(shù)是通過構(gòu)建病毒蛋白編碼基因的突變體，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異常的病毒蛋白或多肽，從而干擾病毒核酸的包裝及病毒顆粒的裝配。 5.6 單鏈抗體技術(shù)單鏈抗體技術(shù)是將目的抗體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞并產(chǎn)生抗體，中和病原體并抑制其復(fù)制的一種治療方法。有研究表明，HBsAg的單鏈抗體（single chain variable fragments, scFv）可使細(xì)胞外的HBsAg降低85%。選擇抗HBcAg的單鏈抗體基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)scFv，通過在細(xì)胞內(nèi)形成抗原-抗體復(fù)合物和干擾HBcAg的功能可抑制病毒復(fù)制44-46。 6. 常見的幾種HBV病毒變異6.1 S基因區(qū)變異S基因區(qū)包括前S1、前S2及S基因，分別編碼前S1蛋白、前S2蛋白及主蛋白。HBV DNA第3055核苷酸(nt)約相當(dāng)于前S1起始碼下游第230堿基，可突變形成終止碼，并影響前S2起始碼，這種突變與HBV逃避干擾素治療和宿主免疫清除有關(guān)。HBV DNA第2995-3177nt位于前S開放讀碼框(ORF)內(nèi)，但其缺失可削弱前S的免疫性，但仍能保留與肝細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，有利于HBV逃避機(jī)體的免疫攻擊，形成慢性攜帶狀態(tài)47。 在某些病人，HBsAg雖然轉(zhuǎn)陰，但肝功能仍未恢復(fù)，有相當(dāng)比例HBsAg()、抗HBs(+/-)的患者體內(nèi)仍可檢出HBV DNA，可能原因有： HBsAg滴度低，常規(guī)方法不能檢出； HBsAg隱匿于HBsAg/抗HBs復(fù)合物中； 病毒整合后S基因替代突變、缺失或重排； HBV變異株產(chǎn)生改變了HBsAg的抗原反應(yīng)性，使病毒發(fā)生“診斷逃避”。 臨床上出現(xiàn)的HBsAg(+)母親所生嬰兒用乙肝疫苗免疫失敗者和原位肝移植受者免疫預(yù)防再感染失敗者中，大多出現(xiàn)了S基因區(qū)變異，從而形成“免疫逃避和疫苗逃避”。在用高效價(jià)乙肝免疫球蛋白(HBIG)預(yù)防HBV再感染的原位肝移植受者體內(nèi)檢出的S突變株，特別是第142，l44，145aa三處，包括典型的“疫苗逃避株”145甘氨酸精氨酸。這些突變可削弱或改變HBsAg的免疫原性，降低HBsAg被HBIG識(shí)別的能力；撤除HBIG后又可回復(fù)到野生型，高度提示這些突變是長期免疫壓力篩選的結(jié)果。因而有學(xué)者不贊同乙肝孕婦在懷孕第7、8、9月注射HBIG以減低新生兒感染率，他們認(rèn)為這樣反而會(huì)因過度使用HBIG而導(dǎo)致病毒變異而使阻斷失效。但這樣的報(bào)道尚未有有力數(shù)據(jù)支持。 6.2 前C/C基因變異，C1896位(A83)的變異： 前C/C基因變異，C1896位(A83)的變異是HBV中最常見的變異。野毒株1896位是G，變異為A，A83氨基酸(TGC)變異為終止密碼(TAG)，使前C蛋白的翻譯終止，從而使eAg不能合成，此突變有助于HBV逃避免疫攻擊但它并不影響報(bào)道復(fù)制，而形成慢性感染狀態(tài)。這種情況臨床上表現(xiàn)為HBeAg(-)、HBV-DNA(+)，而病人仍處于活動(dòng)狀態(tài)的慢性乙型肝炎。即未經(jīng)藥物治療的小三陽但HBV-DNA陽性者。上述變異也見于干擾素治療后，因此提示以HBeAg轉(zhuǎn)陰作為疾病好轉(zhuǎn)的指標(biāo)有時(shí)并不準(zhǔn)確，結(jié)合HBV-DNA檢測(cè)判斷48。 6.3 P基因區(qū)變異 -10- P基因區(qū)編碼HBV DNA聚合酶(DNAP)，其自然突變率與逆轉(zhuǎn)錄病毒gag基因相近。第2798nt AC可使DNAP中的一個(gè)脯氨酸由蘇氨酸取代，導(dǎo)致HBV復(fù)制缺陷。目前臨床上廣泛使用的胞苷類似物拉咪呋啶(1amivudine)和烏苷類似物泛昔洛韋(famciclovir)等抗HBV藥物，作用靶位主要是DNAP，通過與底物dNTP競爭結(jié)合以抑制HBV的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。但這些藥物的使用產(chǎn)生了HBV的耐藥突變株，而形成了“抗病毒治療逃避”。HBV耐藥株的突變就發(fā)生在DNAP基因內(nèi)。DNAP催化中心核苷酸結(jié)合位區(qū)為一高度保守序列，即“酪氨酰(Y)、蛋氨酰(M)、天冬氨酰(D)”基序(YMDD motif)，是DNAP發(fā)揮催化活性所必需的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。發(fā)生突變以后可能使已降低的病情加?。此^反跳），對(duì)所用藥物產(chǎn)生耐受。YMDD耐藥變異的防治：隨著用藥時(shí)間的延長，核苷類藥物易引起病毒變異，導(dǎo)致耐藥。為了減少耐藥性的出現(xiàn)，可以聯(lián)合用藥。從理論上講，干擾素和核苷類藥物在不同的靶位點(diǎn)聯(lián)合應(yīng)用，可減少耐藥株的出現(xiàn)。阿德福韋是一個(gè)廣譜的抗病毒藥物。在HIV治療過程中未發(fā)現(xiàn)有耐藥變異。所有變異株對(duì)阿德福韋均敏感，且對(duì)聯(lián)合變異也有效49。 6.4 X基因區(qū)變異X基因是病毒復(fù)制的重要調(diào)節(jié)區(qū)，是轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄和正鏈合成的起點(diǎn)，也是多種細(xì)胞因子結(jié)合點(diǎn)，此區(qū)變異影響到病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。目前認(rèn)為X基因區(qū)BCP、SP或PreSP的變異改變了HBV基因表達(dá)的平衡，與HBV持續(xù)感染相關(guān)。這種變異株的HBsAg，HBcAg，HbeAg表達(dá)水平均下降，但DNA水平與野生株相仿或稍高，提示病毒復(fù)制能力變化不大；將后一變異株與少量完整的X基因共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，則HBcAg產(chǎn)量比單純變異株多3倍。但Cabrerizo等報(bào)道HBV ORF-X變異可能也是某些患者體內(nèi)HBV DNA水平較低、病毒生物活性減弱的一個(gè)原因。HBxAg也可能成為致敏CTL攻擊的靶抗原?；颊哐逯锌扇苄訦BxAg相關(guān)多肽可調(diào)節(jié)CTL對(duì)靶細(xì)胞的免疫識(shí)別，因此ORF-X變異可能亦不利于清除HBV。另一方面，HBxAg是一種強(qiáng)力反式激活因子，可通過多種途徑促發(fā)肝細(xì)胞癌變50。 7. 乙型肝炎研究的細(xì)胞模型建立表達(dá)乙型肝炎病毒的體外培養(yǎng)細(xì)胞模型，對(duì)研究HBV生物學(xué)特性、乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、體外抗HBV藥物篩選及致癌機(jī)制的研究有重要意義。 7.1 肝源細(xì)胞系肝臟是HBV感染和復(fù)制的主要場(chǎng)所，故肝細(xì)胞是HBV感染模型的首選細(xì)胞。目前應(yīng)用于HBV培養(yǎng)的細(xì)胞系有成人肝細(xì)胞系、胚胎肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系，尤其是肝癌細(xì)胞系，如HepG2, Huh6-C15, Huh-7,Hep3B, PLC/PRE/5等，在HBV DNA及其基因組片段的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立中占有重要的地位。 （1）成人肝細(xì)胞模型:用含HBV感染顆粒的人血清接種培養(yǎng)的成人肝細(xì)胞，可在上清中檢測(cè)到HBV抗原和HBV DNA，表明HBV可感染原代培養(yǎng)的成人肝細(xì)胞，同時(shí)用pre S1特異性抗血清能阻斷病毒感染。川在含2%二甲亞礬(DMSO)培養(yǎng)液中加入聚乙二醉可顯著增強(qiáng)HBV DNA內(nèi)吞量和提高病毒的吸附效率而不改變HBV感染的組織及種屬特異性。HBV感染成人肝細(xì)胞模型與自然感染過程相似，病毒抗原可較長時(shí)間存在，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)HBV DNA復(fù)制型.但成人肝細(xì)胞是一類終末分化的細(xì)胞，不能傳代培養(yǎng)，且在肝細(xì)胞鋪板后，成熟肝細(xì)胞的功能如白蛋白產(chǎn)生能力下降、失去典型多角形態(tài)，對(duì)病毒敏感性也逐漸下降，限制其實(shí)際應(yīng)用。 -11- （2）胚胎肝細(xì)胞模型:人胎肝細(xì)胞系可較好模擬人體內(nèi)肝細(xì)胞的生物學(xué)功能，并對(duì)血清HBV感染敏感，產(chǎn)生HBV復(fù)制型和各種病毒標(biāo)志物，釋放Dane顆粒。來自不同胎齡的胎肝細(xì)胞對(duì)HBV感染顯示相同的感染動(dòng)力學(xué)。但成熟的原代胎肝細(xì)胞體外長期培養(yǎng)非常困難，細(xì)胞分化能力有限，不能多次傳代，且胎肝細(xì)胞的分化狀態(tài)對(duì)病毒復(fù)制可能產(chǎn)生影響，限制了其應(yīng)用和研究。 （3） HepaRG細(xì)胞株:由于用血清直接感染細(xì)胞更接近自然感染狀態(tài)，適用于研究在自然條件下病毒吸附、穿入宿主細(xì)胞的機(jī)制，及抗體的中和作用、抗病毒治療等，而過去所建立的肝癌細(xì)胞株無法直接用病人血清感染。Philippe Giipon等1121從慢性丙型肝炎感染的肝癌病人體內(nèi)分離，加入DMSO和類皮質(zhì)激素培養(yǎng)，建立的HepaRG肝癌細(xì)胞株。HepaRG細(xì)胞株與正常的肝細(xì)胞相比具有相似的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)功能，既可用于轉(zhuǎn)染，又和原代肝細(xì)胞一樣適合于HBV血清直接感染，從培養(yǎng)上清中可檢測(cè)到HBV抗原和HBV DNA.而且該細(xì)胞株具有與正常人肝細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，可以應(yīng)用于研究病毒感染的早期階段包括仍然未知的病毒分子受體、藥物對(duì)病毒感染早期階段的作用、抗病毒藥物的篩選、藥物的毒理學(xué)和藥理學(xué)在內(nèi)的許多領(lǐng)域。 7.2 非肝源細(xì)胞系1980年以來，陸續(xù)在肝外組織如胰腺、腎臟、骨髓淋巴樣母細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞等中發(fā)現(xiàn)了HBV DNA及其基因產(chǎn)物，并且可作為HBV感染復(fù)發(fā)的重要來源，提示HBV除了肝細(xì)胞外，還有泛嗜性，這是將非肝源細(xì)胞列入轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的重要依據(jù)。目前用于HBV DNA轉(zhuǎn)染的非肝源性細(xì)胞系有:FL5-1,Hela細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞系U937細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。這些細(xì)胞系可表達(dá)病毒的全部或部分抗原、HBV DNA，表明其內(nèi)環(huán)境可支持HBV復(fù)制、包裝和分泌。HBV基因在U937和樹突狀細(xì)胞中成功表達(dá)對(duì)研究HBV復(fù)制機(jī)理、在骨髓來源的細(xì)胞系中的調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)對(duì)HBV的影響等十分有用。但非肝臟細(xì)胞裝配和分泌的HBV顆粒，只是類似于天然狀態(tài)的HBV病毒顆粒，與真正天然狀態(tài)的HBV顆粒有很大差別。 7.3 動(dòng)物細(xì)胞系許多研究表明，HBV可在動(dòng)物細(xì)胞系中獲得短暫或較長時(shí)間的表達(dá)。DeMeyer創(chuàng)414研究表明HBV S基因表達(dá)的小蛋白(SP)能與Ca+依賴性磷脂結(jié)合蛋白(human annexin V)特異性結(jié)合，促進(jìn)HBV進(jìn)入大鼠原代肝細(xì)胞復(fù)制并進(jìn)行表達(dá)，介導(dǎo)HBV跨種屬特異性感染。在動(dòng)物細(xì)胞系中的成功轉(zhuǎn)染表明HBV感染的種屬屏障在于其對(duì)靶細(xì)胞細(xì)胞膜的吸附及透過，而HBV的復(fù)制和表達(dá)則依賴于肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。此外，小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3和LtK 、大鼠Morris肝癌細(xì)胞系Q7、果蠅細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero等，也常被選為轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，可表達(dá)HBV的抗原和分泌病毒顆粒。HBV在非人類細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的細(xì)胞模型可作為在人類細(xì)胞內(nèi)復(fù)制模型的補(bǔ)充51-52。 7.4 展望HBV細(xì)胞模型是篩選抗HBV藥物、研究HBV生物學(xué)特點(diǎn)及其與細(xì)胞間相互作用的必要工具。己有的細(xì)胞模型在研究HBV發(fā)病機(jī)理、免疫機(jī)制、抗病毒藥物的篩選中發(fā)揮了一定的作用，但也存在問題: (1)無對(duì)病毒感染和致癌機(jī)理合適的細(xì)胞模型; -12- (2)細(xì)胞表達(dá)的穩(wěn)定性問題。今后建立的細(xì)胞模型應(yīng)借助于分子生物學(xué)、分子細(xì)胞學(xué)的最新進(jìn)展，尋找既適用于轉(zhuǎn)染，又可用血清直接感染，接近肝細(xì)胞生理狀態(tài)并能穩(wěn)定表達(dá)HBV抗原的細(xì)胞模型，將對(duì)研究HBV的生物學(xué)特性、感染姆制、抗病毒藥物的篩選和致癌機(jī)制有重要幫助。 參考文獻(xiàn) 1. 姚光弼等，臨床肝臟病學(xué)，上海科學(xué)技術(shù)出版社 2. 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