《生化檢驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)》PPT課件.ppt

生化檢驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)與進(jìn)展 上海長(zhǎng)征醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科于嘉屏 一 比色分析 1 比色分析理論 Beer Lambert定律A lg I0 I KCL或I I0 10 KCLI0 入射光強(qiáng)度I 透過(guò)光強(qiáng)度K 常數(shù)C 溶液濃度L 溶液的厚度 1 郎伯定律I0ItlL dI Idl dI aIdl dI I adl積分ItLdI I adl得 ln I0 It aLI00將ln改為lg 則為 lg I0 It 0 434aL K L令lg I0 It A 則A K L 2 比爾定律A K C 3 郎伯 比爾定律A KLC 透光率 transmittance T 透射率 T I I0吸光度 absorbance A 光密度 epticaldensity D或OD A lgI0 I lgTT 10 A 10 KCLA KCL當(dāng)L用cm C用mol L表示 則K即稱之為摩爾吸光系數(shù) 用 表示 當(dāng)C 1mol L L 1cm 則 A T 與A的關(guān)系 透光率 T 吸光度 A 10 0000 750 1250 50 3010 250 6020 170 7700 11 0000 051 3010 012 0000 0013 000 2 影響因素 1 化學(xué)因素的影響溶液中溶質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解 締合 與溶劑間的作用等原因而出現(xiàn)偏離比爾定律的現(xiàn)象 由化學(xué)因素引起的偏離 有時(shí)可控制溶液條件設(shè)法減免 此外 能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)也可導(dǎo)致偏離比爾定律 2 非單色光的影響比爾定律的一個(gè)重要條件是單色光 但在比色分析中常有不同波長(zhǎng)的光同時(shí)存在 這就使吸光度發(fā)生改變 從而偏離比爾定律 波長(zhǎng)的選擇 可見(jiàn) 3 光學(xué)因素的影響散射是向空間各個(gè)方向 而使透射光減弱 反射可使光能損失 當(dāng)光線通過(guò)兩種不同介質(zhì)時(shí) 則發(fā)生反射 當(dāng)樣本溶液與空白溶液的折射率有較大差異時(shí) 導(dǎo)致吸收值的偏差 4 非平行光通過(guò)吸收池時(shí) 由于光線的傾斜使厚度L增大而影響測(cè)量值 3 比色法的誤差 1 儀器誤差濾光片 狹縫過(guò)寬 光電池疲勞 儀器結(jié)構(gòu) 散熱不良 2 方法誤差 3 操作誤差 比色法舉例 1 總蛋白 TP 蛋白質(zhì)中的肽鍵 Cu2 堿性條件紫紅色絡(luò)合物引起在波長(zhǎng)540 560nm范圍內(nèi)吸光度的上升 與總蛋白含量成正比2 白蛋白 ALB 白蛋白 溴甲酚綠pH4 2白蛋白溴甲酚綠復(fù)合物引起在波長(zhǎng)630nm范圍內(nèi)吸光度的上升 與白蛋白含量成正比 二 分光光度計(jì) 1 光源熱光源 鎢燈 鹵鎢燈 320 2500nm 氣體放電光源 氫燈 氘燈 185 375nm 氘燈發(fā)光強(qiáng)度比氫燈強(qiáng)3 5倍 是目前紫外光區(qū)常用光源 2 單色器單色器是一種用來(lái)把光源發(fā)出的復(fù)合光分解成單色光 并能任意改變所需波長(zhǎng)的裝置 1 棱鏡玻璃棱鏡的折射率大 色散能力也大 因而分辨本領(lǐng)高 但它吸收紫外光 因此只適用于350 3000nm的波長(zhǎng)范圍 石英棱鏡對(duì)紫外光吸收少 適用于195 4000nm間分光 但由于石英棱鏡折射率低于玻璃 因而色散能力差 2 光柵光柵是利用光的衍射 干涉原理制成的色散元件 目前 全息光柵在質(zhì)量上 成本上都大大優(yōu)于機(jī)械光柵 因光柵分光在紫外和可見(jiàn)光區(qū)均適用 且色散力強(qiáng) 分辨率高 故近年生產(chǎn)的分光光度計(jì)大都采用光柵作單色器 3 比色杯比色杯可由玻璃和石英等材料制成 玻璃適用于350nm以上光區(qū) 而石英杯則適用于紫外和可見(jiàn)光區(qū) 4 檢測(cè)器在分光光度計(jì)中 把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)輸出的裝置稱檢測(cè)器 光電池光電管光電倍增管 雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)來(lái)自光源的光被兩個(gè)單色器分別分離出波長(zhǎng)為 1和 2的兩束單色光 經(jīng)過(guò)折波器后 兩束波長(zhǎng)不同的單色光交替地照射于同一樣品杯 樣品杯背后的光電倍增管交替地接收到兩種波長(zhǎng)照射吸收池后所產(chǎn)生的信號(hào) 此信號(hào)經(jīng)電子電路轉(zhuǎn)化為兩個(gè)吸光度之差 A 三 酶法分析 酶法分析包括兩方面的內(nèi)容 借助酶來(lái)測(cè)定某一化合物的濃度 如測(cè)定體液中的葡萄糖 甘油三酯 膽固醇 尿素 尿酸 肌酐等 借助酶來(lái)測(cè)定另一種酶的活性 實(shí)際上是用酶來(lái)測(cè)定待測(cè)酶的產(chǎn)物 如轉(zhuǎn)氨酶 肌酸激酶 淀粉酶等 葡萄糖葡萄糖 O2 H2O葡萄糖氧化酶葡萄糖酸 H2O2H2O2 苯酚 4 氨基安替比林過(guò)氧化物酶醌亞胺 H2O尿素尿素 H2O脲酶2NH4 CO2NH4 酮戊二酸 NADH谷氨酸脫氫酶谷氨酸 NAD H2O 肌酸激酶 CK 磷酸肌酸 ADPCK肌酸 ATP葡萄糖 ATPHK葡萄糖 6 磷酸 ADP葡萄糖 6 磷酸 NADPG6PDH6 磷酸葡萄糖酸 NADPH H 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ALT 丙氨酸 酮戊二酸ALT丙酮酸 谷氨酸丙酮酸 NADH H LDH乳酸 NAD H2O 酶催化特點(diǎn) 高度的特異性高催化效率作用條件溫和 酶的活性部位 底物結(jié)合部位催化部位 酶的輔助因子 金屬離子輔基和輔酶NAD NADP 酶的分類(lèi) 1 氧化還原酶2 轉(zhuǎn)移酶3 水解酶4 裂合酶5 異構(gòu)酶6 合成酶 酶的系統(tǒng)命名 應(yīng)將酶的一種或兩種底物以及催化反應(yīng)的性質(zhì)明確標(biāo)明 乳酸脫氫酶L 乳酸 NAD 氧化還原酶肌酸激酶ATP 肌酸磷酸轉(zhuǎn)移酶 酶的活性單位 一國(guó)際單位為在一分鐘內(nèi)催化轉(zhuǎn)變1個(gè)微摩爾的反應(yīng)物的酶量 IU UU L1Katal為每秒鐘轉(zhuǎn)化1mole底物的酶量1國(guó)際單位 16 67nKatal1Katal 6 107國(guó)際單位 酶活性測(cè)定 影響酶活性測(cè)定 底物 激活劑 抑制劑 緩沖液 pH 溫度 酶濃度 在最適條件下以求達(dá)到最大的反應(yīng)速度 但由于底物的溶解度低 或售價(jià)太高 或需連鎖的酶反應(yīng) 則必須對(duì)測(cè)定條件作修正 酶活性測(cè)定的最適條件 合適的底物 輔因子 活化劑 變構(gòu)劑的種類(lèi)和濃度指示酶和輔助酶的種類(lèi)和濃度反應(yīng)混合液的最適pH 緩沖液種類(lèi)和濃度去除各種抑制劑 酶促反應(yīng)的兩個(gè)階段 反應(yīng)級(jí)數(shù)0級(jí)1級(jí) P 1 可逆反應(yīng)2 產(chǎn)物抑制3 酶變性失活v dP dt4 底物不飽和 S 時(shí)間t 酶反應(yīng)進(jìn)程和酶濃度曲線 酶量 E 401 E 越大 線性反產(chǎn)應(yīng)期越短物2 E 相同 S 越小 P 20線性反應(yīng)期越短10505101520時(shí)間 min 酶反應(yīng)時(shí)間曲線 時(shí)間 min 5 t0 反應(yīng)時(shí)間越短 10 t1 線性范圍越大15 t2 20 t3 010203040酶量 E 米氏方程 E S ES E P k k k k 1 2 2 1 v V 2 S Km 米氏曲線 S V Vmax Km Vmax2 Km Km 米氏常數(shù) 米 孟氏公式 v Vm S Km S 當(dāng) S Km時(shí) 則v Vm 即反應(yīng)速度是一個(gè)常數(shù) 為零級(jí)反應(yīng) 如 S Km時(shí) 混合級(jí)反應(yīng) 米氏常數(shù)的意義 如v 0 5Vm 則Km S Km值等于酶促反應(yīng)的初速度為最大速度的一半時(shí)所需的底物濃度 Km等于ES的解離常數(shù) 而Km的倒數(shù)可代表酶和底物的親和力 Km是酶的特征性常數(shù) 當(dāng)pH 溫度和離子強(qiáng)度恒定時(shí) Km只和酶及底物的性質(zhì)有關(guān) 而與酶濃度無(wú)關(guān) 純度不同的同一種酶 如雜質(zhì)中沒(méi)有可使底物發(fā)生旁反應(yīng)的其它酶或酶的激活劑和抑制劑 則Km的變化不大 米氏常數(shù)的應(yīng)用 1 如已知酶的Km 可計(jì)算某一底物濃度時(shí)的v Vm 2 如要求v占Vm一定的百分比 也可算出所需底物濃度為其Km的多少倍 3 利用工具酶來(lái)測(cè)定某一底物的濃度時(shí) 可計(jì)算工具酶的用量 4 測(cè)定幾個(gè)同工酶對(duì)同一底物的Km 可估計(jì)是原級(jí) Km常有差異 還是次生性同工酶 Km接近或相同 5 測(cè)定正逆方向底物的Km 可大體知道該酶催化哪一方向?yàn)橹?6 如已知一組酶中各酶的Km及其相應(yīng)底物的濃度 有助于尋找限速步驟 Km的求取 Lineweaver Burk作圖法1 v Km Vm 1 S 1 VmEadie Hofstee作圖法v Vm Km v S Eisenthal和Cornish Bowden作圖法設(shè)Y軸和X軸分別為求取Vm及Km的座標(biāo) 將不同S濃度點(diǎn)在X軸的負(fù)側(cè) 相應(yīng)的反應(yīng)速度點(diǎn)在Y軸上 連接各線 交點(diǎn)在Y軸上的座標(biāo)為Vm 在X軸上的座標(biāo)為Km 酶活性測(cè)定的基本知識(shí) 酶活性是通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)過(guò)程中單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量 即測(cè)定酶促反應(yīng)的速率來(lái)獲得的 1 定時(shí)法測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始后某一時(shí)間內(nèi) t1到t2 產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來(lái)求取酶反應(yīng)初速度的方法稱為定時(shí)法 產(chǎn)2物3生1成t1t2 2 連續(xù)監(jiān)測(cè)法連續(xù)測(cè)定 每15s 1min監(jiān)測(cè)一次 酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間的變化來(lái)求出酶反應(yīng)初速度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法 又稱動(dòng)力學(xué)法或速率法 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果連接成線 很易找到成直線的區(qū)段 來(lái)計(jì)算酶活性 此法較為準(zhǔn)確 分為直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法和間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法 法 連續(xù)監(jiān)測(cè)法的測(cè)定時(shí)間 吸光度 A3 A2 A1t1t2t3t4時(shí)間 3 平衡法通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始至反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度總變化量來(lái)求出酶活性的方法稱為平衡法 用平衡法測(cè)定時(shí) 因產(chǎn)物的增加或底物的減少與反應(yīng)時(shí)間不成線性 故不能把 P 或 S 的總變化量除以t來(lái)代表每分鐘產(chǎn)物或底物的變化 另外 平衡法也會(huì)受到產(chǎn)物抑制 可逆反應(yīng)等因素的影響 由于反應(yīng)時(shí)間較定時(shí)法長(zhǎng) 故這種影響會(huì)更大 測(cè)定結(jié)果也較連續(xù)監(jiān)測(cè)法低 對(duì)于有些零級(jí)反應(yīng)期很短的酶促反應(yīng) 用連續(xù)監(jiān)測(cè)法和定時(shí)法很難測(cè)出其初速度 也只得采用平衡法測(cè)定 定時(shí)法與連續(xù)法比較 定時(shí)法條件無(wú)限制試劑需量少 經(jīng)濟(jì)采用放射性試劑時(shí) 靈敏度高結(jié)果不能立刻揭曉人工操作多 費(fèi)時(shí)毋需偶聯(lián)酶產(chǎn)物會(huì)生抑制作用 連續(xù)法因偶聯(lián)酶使條件受限制需量較大與放射性試劑來(lái)比 靈敏度低結(jié)果立刻揭曉人工操作少偶聯(lián)酶的費(fèi)用很大偶聯(lián)作用能消耗產(chǎn)物 一 工具酶及酶偶聯(lián)反應(yīng) 通過(guò)酶偶聯(lián)反應(yīng)間接地測(cè)出第一個(gè)酶促反應(yīng)中待測(cè)物的濃度或待測(cè)酶的活性 那些作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性的酶稱為工具酶 A B酶1C DC 或D E酶2F GF 或G H酶3I J酶1 待測(cè)酶酶2 輔助酶酶3 指示酶E H 輔助底物 在利用工具酶的反應(yīng)中 唯一的限速因子應(yīng)該是待測(cè)化合物或待測(cè)酶 對(duì)工具酶試劑中的雜質(zhì) 雜酶 抑制劑等 的含量也有一定的限制 以減少或避免干擾測(cè)定的副反應(yīng) 如果工具酶制劑中污染了待測(cè)酶會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響 如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 AST 測(cè)定的工具酶是蘋(píng)果酸脫氫酶 MDH 如污染0 03 的AST 則當(dāng)AST活性為7U L時(shí) 測(cè)定誤差為6 而測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 ALT 的工具酶是乳酸脫氫酶 LDH 如污染0 03 的ALT 則當(dāng)ALT活性為5U L時(shí)測(cè)定誤差也是6 二 常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性 1 NADH或NADPH 乳酸脫氫酶 LDH NAD 或NADP 蘋(píng)果酸脫氫酶 MDH NAD 或NADP 谷氨酸脫氫酶 GLDH NAD 或NADP 6 磷酸葡萄糖脫氫酶 G6PD 動(dòng)物G6PDNADP 微生物G6PDNAD NADH或NADPH在340nm有特征性光吸收 而它們的氧化型NAD 或NADP 則沒(méi)有這個(gè)吸收峰 340nm波長(zhǎng)處的吸光度與NAD P H的濃度成正比 另外NAD P H有強(qiáng)烈的熒光 其激發(fā)波長(zhǎng)為340nm 發(fā)射波長(zhǎng)為460nm max 340nm 肌酸激酶 CK 磷酸肌酸 ADPCK肌酸 ATP葡萄糖 ATPHK葡萄糖 6 磷酸 ADP葡萄糖 6 磷酸 NADPG6PDH6 磷酸葡萄糖酸 NADPH H 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ALT 丙氨酸 酮戊二酸ALT丙酮酸 谷氨酸丙酮酸 NADH H LDH乳酸 NAD H2O 2 H2O2指示反應(yīng) 葡萄糖氧化酶 尿酸酶 甘油氧化酶 膽固醇氧化酶 用于葡萄糖 尿酸 甘油 膽固醇的測(cè)定 可使相應(yīng)底物被O2氧化成H2O2 H2O2可通過(guò)下列指示反應(yīng)來(lái)檢測(cè) 使單一的色素原顯色 無(wú)色色素原過(guò)氧化物酶 POD 存在下被H2O2氧化后可生成有色的色素 使成對(duì)的色素原顯色 必須要兩個(gè)色素原共同存在 再在指示酶POD的催化下生成色素 發(fā)光反應(yīng) H2O2也可用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來(lái)監(jiān)測(cè) 它是憑借某些熒光前身物在氧化后 處于激發(fā)狀態(tài)的分子可發(fā)射光子 光子量和H2O2的濃度成正比 葡萄糖葡萄糖 O2 H2O葡萄糖氧化酶葡萄糖酸 H2O2H2O2 苯酚 4 氨基安替比林過(guò)氧化物酶醌亞胺 H2O甘油三酯甘油三酯 H2O脂蛋白脂酶甘油 脂肪酸甘油 ATP甘油激酶 磷酸甘油 ADP 磷酸甘油 O2甘油磷酸氧化酶磷酸二羥丙酮 H2O2H2O2 4 氨基安替比林 ESPAS過(guò)氧化物酶醌亞胺 H2OESPAS N 乙基 N 3 磺丙基 間 茴香胺 3 硝基苯衍生物 芳香酯酶 磷酸酯酶和硫酸酯酶 對(duì) 硝基酚和有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸形成的酯類(lèi)糖苷酶 對(duì)硝基酚和糖苷衍生物 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 芳香酰胺酶和胰蛋白酶 對(duì) 硝基苯胺的氨基酰衍生物故硝基苯酚或硝基苯胺作為底物的結(jié)合型化合物均無(wú)色 而一旦水解或游離型產(chǎn)物在pH大于8的堿性條件下能生成黃色的醌類(lèi)離子型化合物 在400nm 410nm有光吸收峰 其吸光度與濃度成正比 max 405nm 堿性磷酸酶 ALP 磷酸對(duì)硝基苯 H2OALP磷酸鹽 對(duì)硝基苯酚 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 GT 谷氨酰對(duì)硝基苯胺 雙甘肽 GT谷氨?；p甘肽 對(duì)硝基苯胺 三 酶法分析的類(lèi)型 用工具酶測(cè)定體液中代謝物的濃度 一般可用兩種不同的測(cè)定方法 1 代謝物濃度的酶法分析 1 終點(diǎn)法將待測(cè)底物與工具酶保溫一定時(shí)間后 全部轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測(cè)的化合物 然后測(cè)定后者的總量來(lái)計(jì)算待測(cè)物的總量或濃度 尿素 H2O尿素酶CO2 2NH3乙醇 NAD 醇脫氫酶乙醛 NADH H 反應(yīng)常呈一級(jí)反應(yīng) 使待測(cè)底物完全轉(zhuǎn)變所需的時(shí)間取決于加入的工具酶量 2 動(dòng)力學(xué)法待測(cè)物不必完全轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測(cè)的化合物 而是利用工具酶反應(yīng)速率來(lái)定量其濃度 一是利用零級(jí)反應(yīng) 如待測(cè)物是某個(gè)工具酶的激活劑或抑制劑 其濃度可決定該工具酶的反應(yīng)速度 可采用此方法 因測(cè)定時(shí)該工具酶本身及其底物都是足量的 故反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng) 例 測(cè)定血清中肝素AT 肝素AT AT 為肝素與AT 復(fù)合物 AT 凝血酶凝血酶 AT 無(wú)活性 殘余凝血酶甲苯磺酰 甘 脯 精 4NA凝血酶甲苯磺酰 甘 脯 精 4 硝基苯胺 二是利用一級(jí)反應(yīng) 本法的基本要求是作為某一工具酶底物的待測(cè)物的濃度 S 必須遠(yuǎn)小于該工具酶的Km 此時(shí)反應(yīng)速度基本上與 S 成正比 呈一級(jí)反應(yīng) 動(dòng)力學(xué)法較終點(diǎn)法具有簡(jiǎn)便 省時(shí) 干擾少 可測(cè)定低濃度物質(zhì) 不需樣品對(duì)照以及易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn) 成為自動(dòng)化分析的主要方法 但此法必須同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品的反應(yīng)速度 來(lái)推算未知樣品中待測(cè)物的濃度 2 酶活性測(cè)定的酶法分析這類(lèi)酶學(xué)分析法是用工具酶來(lái)測(cè)定待測(cè)酶的產(chǎn)物以求取待測(cè)酶的活性 適合于待測(cè)酶產(chǎn)物不能直接監(jiān)測(cè)的情況 也可有終點(diǎn)法和動(dòng)力學(xué)法兩種 1 終點(diǎn)法將底物與待測(cè)酶反應(yīng)一定時(shí)間后 終止反應(yīng) 再用指示酶測(cè)定該時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量即可算出酶活性 2 偶聯(lián)反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué) SExP1EiP2應(yīng)先將樣品與工具酶預(yù)保溫 使樣品中的內(nèi)源性干擾物充分催化消耗 然后加入底物S起動(dòng)反應(yīng) 起動(dòng)后 因P從零開(kāi)始升高 故工具酶反應(yīng)速度也較低 不能代表待測(cè)酶反應(yīng)速度 這一時(shí)期稱為延滯期 隨著反應(yīng)進(jìn)行 進(jìn)入恒態(tài)期 只要工具酶用量足夠 就能正確地反映酶的活性 A延遲期恒態(tài)期非恒態(tài)期1 51 0SExP1EiP20 50306090120150180秒 以NADH減少為指示反應(yīng) 如Ei用量過(guò)少 Ex的速度Vx大于Ei的速度 即P1生成的速度大于P1消失的速度 可導(dǎo)致P1的逐漸堆積 不能成為恒態(tài)或其延滯期極長(zhǎng) 但如Ei用量足夠 Vi等于或大于Vx 則P1一旦生成可較快或很快轉(zhuǎn)變成P2 P1產(chǎn)生與消失速度一致而成為恒態(tài) 四 酶活性濃度的計(jì)算 Vt 106U L A min Vs L A吸光度變化Vt為反應(yīng)系統(tǒng)總體積Vs為樣品體積 為被測(cè)物的摩爾吸光系數(shù) mol 1cm 1 L為光徑106是將mol轉(zhuǎn)化成 mol 常數(shù)K值的意義和設(shè)置 Vt 106U L A min Vs L A min KVt 106K Vs L 常數(shù)K值的檢驗(yàn) pH 溫度 單色光 儀器信號(hào)接收V 儀器加樣系統(tǒng)對(duì)一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對(duì)硝基酚 對(duì)硝基苯胺 可以用高純?cè)噭┡涑蓸?biāo)準(zhǔn)品 將它們作為標(biāo)本進(jìn)行酶的測(cè)定 根據(jù)其濃度和吸光度變化可計(jì)算出實(shí)際K值 對(duì)NAD P H 可使用測(cè)葡萄糖試劑盒 對(duì)已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行終點(diǎn)法測(cè)定 此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD P H 故不難從吸光度變化求出K值 利用標(biāo)準(zhǔn)管的方法較簡(jiǎn)單 但標(biāo)準(zhǔn)管的濃度必須在該比色法或紫外分光光度法測(cè)定的濃度線性范圍內(nèi) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法可得濃度和吸光度的線性范圍 消除濃度過(guò)高偏離線性的影響 但標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備時(shí)間與測(cè)定樣品的時(shí)間不同 容易產(chǎn)生試劑批號(hào) 配制 實(shí)驗(yàn)溫度 儀器工作狀態(tài)等因素造成的誤差 單試劑 雙試劑 液體試劑 1 單試劑的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 操作簡(jiǎn)便適用于各類(lèi)生化分析儀缺點(diǎn) 配方復(fù)雜 穩(wěn)定劑 掩蔽劑 穩(wěn)定性差 不能完全避免內(nèi)外源物質(zhì)干擾 2 雙試劑的特點(diǎn) 1 可較徹底排除樣品空白和內(nèi)外源干擾物 2 更加符合酶偶聯(lián)反應(yīng)的特性和過(guò)程 3 試劑配方簡(jiǎn)單 4 試劑穩(wěn)定 便于儲(chǔ)存 運(yùn)輸和使用 5 可用抑制法直接測(cè)定某些同工酶 3 液體試劑的優(yōu)點(diǎn) 1 不需手工調(diào)制 省工省時(shí) 2 試劑批間差小 重復(fù)性好 3 杜絕干粉試劑重溶時(shí)因水質(zhì)差引起試劑變質(zhì) 4 有利于急診標(biāo)本 5 按需取量 避免浪費(fèi) 自動(dòng)生化分析儀主要參數(shù) 測(cè)定方法學(xué)類(lèi)型的選擇 終點(diǎn)法 速率法 固定時(shí)間法溫度波長(zhǎng)樣品與試劑量延遲時(shí)間測(cè)定時(shí)間濃度校正因子 四 免疫濁度分析法 抗體 Ab 與可溶性抗原 Ag 反應(yīng) 形成一定結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物 成為懸浮于反應(yīng)溶液中的微粒 在沉淀反應(yīng)中形成的復(fù)合物微粒具有特殊的光學(xué)性質(zhì) 可用儀器檢測(cè) 提高了方法的速度 靈敏度和易操作性 抗原 抗體沉淀反應(yīng)的特征 1 抗體過(guò)剩區(qū) 隨著抗原濃度增加 IC也相應(yīng)增加 濁度增加 2 等價(jià)點(diǎn) 抗原抗體相當(dāng)時(shí) 所有抗體與抗原形成IC 濁度最大 達(dá)到等價(jià)點(diǎn) 3 抗原過(guò)剩區(qū) 抗原過(guò)量存在 不但不會(huì)形成更多的IC 反而會(huì)引起原先的IC溶解 濁度下降 產(chǎn)生虛假的低濃度結(jié)果 1 透射比濁測(cè)定法是測(cè)定入射光強(qiáng)度由于溶液中粒子的散射而降低的程度 它并不直接測(cè)定散射的光強(qiáng) 這一點(diǎn)與分光光度測(cè)定法極為類(lèi)似 用這種方法時(shí) 多用聚乙二醇 PEG 作為反應(yīng)增強(qiáng)劑 這種非離子型聚合物可以降低抗原抗體復(fù)合物的溶解度 2 散射比濁測(cè)定法它是直接測(cè)定溶液中微粒所散射的光強(qiáng) 散射比濁法也已經(jīng)用于自動(dòng)分析儀器中 3 免疫濁度測(cè)定中應(yīng)注意的問(wèn)題 1 偽濁度的影響 非特異的交叉反應(yīng)增濁劑濃度反應(yīng)時(shí)間樣品本身的濁度試劑的污染和變質(zhì)器材不夠清潔 2 鉤狀效應(yīng) hookeffect 的影響 當(dāng)Ag和Ab濃度比例不當(dāng)時(shí) 不能有效地形成免疫復(fù)合物 產(chǎn)生弱陽(yáng)性甚至假陰性結(jié)果 3 嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控是極必要的 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 五 方法學(xué)評(píng)價(jià) 一 準(zhǔn)確度試驗(yàn)準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與 真值 的符合程度 是評(píng)價(jià)一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法是否可取的重要指標(biāo) 1 標(biāo)準(zhǔn)物鑒定為了確定和評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性 常用基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)液或參考血清為樣本進(jìn)行檢測(cè) 所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以衡量方法的準(zhǔn)確性 2 回收試驗(yàn)回收率的計(jì)算是 回收值 加入值 100 這里的回收值是指標(biāo)本中加入標(biāo)準(zhǔn)液后的測(cè)定值減去標(biāo)本原來(lái)的測(cè)定值 回收率達(dá)到100 5 者為準(zhǔn)確性符合要求的方法 回收試驗(yàn)應(yīng)注意 樣品的選用樣品最好應(yīng)用新鮮混合血清 標(biāo)準(zhǔn)物的加入應(yīng)先配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物溶液 再加入到基礎(chǔ)樣品中 所加標(biāo)準(zhǔn)溶液量越少越好 標(biāo)準(zhǔn)物的加入濃度最好同時(shí)設(shè)計(jì)幾個(gè)加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的試驗(yàn)樣品 加入標(biāo)準(zhǔn)液后的試驗(yàn)樣品的總濃度不能超過(guò)本方法的線性范圍 操作準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)液的加入量必須準(zhǔn)確無(wú)誤 應(yīng)經(jīng)多次試驗(yàn) 二 精密度試驗(yàn) 目前常以重復(fù)性試驗(yàn)來(lái)衡量一個(gè)方法的精密度 一般來(lái)說(shuō) 標(biāo)準(zhǔn)差 變異系數(shù) CV s x 100 小的實(shí)驗(yàn)方法精密 1 批內(nèi)精密度試驗(yàn)取一份樣品 用欲測(cè)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作 反復(fù)測(cè)定20次以上 計(jì)算每一次的測(cè)定結(jié)果 然后計(jì)算x s CV 2 批間精密度試驗(yàn)這種試驗(yàn)也是同一份標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定 至少為20次 但是重復(fù)測(cè)定不是在一天內(nèi)完成 而是每天隨患者標(biāo)本一起測(cè)定 再計(jì)算x s CV 三 靈敏度試驗(yàn) 靈敏度是單位濃度變化所引起的指示物理量的變化 在定量分析中是指被檢測(cè)物單位濃度的變化所引起的物理量的變化 所選用的方法 應(yīng)進(jìn)行線性試驗(yàn) 選用線性范圍寬度適宜的方法 線性檢驗(yàn)所得結(jié)果 可用回歸方程 Y a bX 處理 回歸系數(shù) b 為靈敏度大小的指標(biāo) 回歸系數(shù)大 靈敏度高 反之亦然 不同方法也可用回歸系數(shù)進(jìn)行比較 回歸系數(shù)大的靈敏度高 四 線性試驗(yàn) 線性試驗(yàn)是衡量一個(gè)方法的檢測(cè)范圍的一種實(shí)驗(yàn) 通過(guò)線性試驗(yàn) 可以了解該方法的最高檢測(cè)值和最低檢測(cè)值 超出上下限值的結(jié)果是不可靠的 為使結(jié)果可靠 遇到這種情況應(yīng)加大樣品用量或稀釋樣品后再次檢測(cè) 線