高中生物《第五章 第二節(jié) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增NDA片段》課件3 新人教版選修1.ppt

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) pcr技術(shù) 是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或dna序列的方法 故又稱為dna體外擴(kuò)增技術(shù) 課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片段 1 dna分子的組成成分和結(jié)構(gòu) dna分子的基本組成單位是 共有種 每個基本單位是由一分子的 一分子的 和一分子的構(gòu)成 脫氧核甘酸 4 磷酸 堿基 脫氧核糖 那么dna分子的平面結(jié)構(gòu)怎樣呢 二 基礎(chǔ)知識 a g c t 1 dna的基本單位 脫氧核苷酸 2 dna分子的平面結(jié)構(gòu) 5 端 3 端 識別 dna分子的3 端與5 端 oh端為3 磷酸基團(tuán)的末端為5 2 dna分子復(fù)制的過程 解旋酶 dna母鏈 4種脫氧核苷酸 dna聚合酶 引物 rna 打開dna雙鏈 模板 合成子鏈原料 催化子鏈合成 使dna聚合酶能從引物3 端開始連接脫氧核苷酸 思考 體內(nèi)dna復(fù)制的條件是什么 體外擴(kuò)增dna如何提供相似環(huán)境 變性 80 100 taq聚合酶 耐高溫 20 30個核苷酸構(gòu)成dna或rna dna雙鏈 單鏈 變性 加熱80 100 復(fù)性 緩慢冷卻 4 dna分子的熱變性原理 變性的目的 復(fù)性的目的 解開雙鏈 有利于引物 和引物 與兩條單鏈的結(jié)合 一 pcr的原理 pcr的技術(shù)原理 時間 min 溫度 適溫延伸 高溫變性 低溫復(fù)性 重復(fù)1 3步30輪 3 dna復(fù)制的方向 dna的合成方向總是從子鏈的5 端向3 端延伸 2 步驟 變性 復(fù)性 延伸 pcr技術(shù)的原理總結(jié) 利用dna分子的熱變性原理 通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合 從而完成體外dan分子的擴(kuò)增 體外dna復(fù)制的條件 四種脫氧核苷酸 耐高溫的dna聚合酶 引物 模板 緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備 復(fù)制的方向 子鏈的5 端向3 端延伸 二 pcr的反應(yīng)過程 變性95oc 5 引物1 5 引物2 5 5 模板dna 25 30次循環(huán) 復(fù)制 后 模板dna的含量可以擴(kuò)大100萬 220 倍以上 每個循環(huán)包括 變性 復(fù)性 延伸 從第二輪循環(huán)開始 上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng) 并且由引物 延伸而成的dna單鏈會與引物 結(jié)合 進(jìn)行dna的延伸 這樣 dna聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的dna序列 使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增 pcr的反應(yīng)過程總結(jié) 三 pcr反應(yīng)的實驗操作 1 pcr儀 設(shè)備及用具 2 微量離心管 一種薄壁塑料管 總?cè)莘e為0 5ml 3 微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移pcr配方中的液體 其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次 實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器 三 pcr反應(yīng)的實驗操作 1 按配方將所需試劑擺放在實驗桌上 準(zhǔn)備 2 用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分 移液 3 蓋嚴(yán)離心管口的蓋子 用手指輕輕彈擊管壁 混合 4 將微量離心管放在離心機上 離心 5 將離心管放入pcr儀上 設(shè)置好pcr儀的循環(huán)程序 反應(yīng) 四 結(jié)果分析與評價 dna含量的測定 稀釋 對照調(diào)零 測定 計算 公式見p63 波長260nm處讀數(shù) 蒸餾水做對照 50倍 一 理論上dna擴(kuò)增數(shù)目的計算 四 課題成果評價 1 一條dna 復(fù)制n次 dna為2n 2 a條dna 復(fù)制n次 dna為ax2n 二 實驗中dna含量的測定 1 原理 可以通過測量dna含量來評價擴(kuò)增的效果 dna在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰 峰值的大小與dna的含量有關(guān) 2 過程 稀釋 2 lpcr反應(yīng)液 加入98 l蒸餾水 即將樣品進(jìn)行50倍稀釋 對照調(diào)零 以蒸餾水作為空白對照 在波長260nm處 將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零 取dna稀釋液100 l至比色杯中 測定260nm處的光吸收值 測定并計算 dna含量 g ml 50 260nm的讀數(shù) 稀釋倍數(shù) 50 在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1 dna的含量為50 g ml的 體內(nèi)dna復(fù)制與pcr的技術(shù)區(qū)別 課堂小結(jié) 練習(xí)鞏固 1 關(guān)于pcr技術(shù)的應(yīng)用 錯誤的一項是a古生物學(xué) 刑偵破案 dna序列測定b診斷遺傳疾病 基因克隆 古生物學(xué)cdna序列測定 基因克隆 刑偵破案 d診斷遺傳疾病 合成核苷酸 dna序列測定 2 dna的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸 3 pcr技術(shù)最突出的優(yōu)點是a原理簡單b原料易找ctaqdna聚合酶有耐熱性d快