腫瘤分子病理學研究進展.pdf

腫瘤分子病理學研究進展腫瘤分子病理學研究進展 陳忠陳忠 基因數(shù)量片斷大小 基因數(shù)量片斷大小 kb 片斷大小 片斷大小 Mb 人類基因組 人類基因組 40 0003 000 0003 000 染色體染色體2 000150 000150 中期染色體條帶中期染色體條帶 500 個個 806 0006 前中期染色體條帶前中期染色體條帶 1 000個個 403 0003 熒光原位雜交 熒光原位雜交 FISH 分辨率 分辨率11 10 PCR Southern blot1 1 基因組大小和分辨率基因組大小和分辨率 衡量學科發(fā)展的重要指標 主要領域 腫瘤 感染性疾病 遺傳性疾病 分子病理學分子病理學 分子細胞遺傳學技術(shù) 分子細胞遺傳學技術(shù) 熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù) FISH 多色多色 FISH SKY 和和 M FISH 比較基因組雜交 比較基因組雜交 CGH 基因微陣列 基因微陣列 aCGH 熒光原位雜交 熒光原位雜交 熒光原位雜交 熒光原位雜交 Fluorescence in situ HybridizationFluorescence in situ HybridizationFluorescence in situ HybridizationFluorescence in situ Hybridization FISHFISHFISHFISH 基本原理 應用熒光染料標記探針DNA 變性成 單鏈后與變性后的染色體或細胞核靶DNA雜交 在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果 基本原理 應用熒光染料標記探針DNA 變性成 單鏈后與變性后的染色體或細胞核靶DNA雜交 在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果 生命科學中的生命科學中的 釣魚釣魚 技術(shù)技術(shù) Cy3Cy3Cy3Cy3 Cy5Cy5Cy5 Cy5 比值比值比值比值 實驗組實驗組實驗組實驗組 實驗組實驗組實驗組實驗組對照組對照組對照組對照組對照組對照組對照組對照組 Cy3Cy3Cy3Cy3Cy5Cy5Cy5Cy5Cy5Cy5Cy5Cy5Cy3Cy3Cy3Cy3 實驗實驗實驗實驗2 2 2 2 樣本制備及數(shù)據(jù)分析 檢測樣本檢測樣本 實驗實驗實驗實驗1 1 1 1 熒光交換實驗 分子遺傳學技術(shù)分子遺傳學技術(shù) PCR SSCP PCR RFLP REAL TIME PCR DHPLC DNA SEQUENCING 除常規(guī)的一對引物以外 PCR反應體系中另加有一條能與PCR產(chǎn)物雜交的 熒光雙標記探針 該探針5 端標記熒光報告基團 3 端標記熒光淬滅基團 探針完整時5 端報告基團吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給3 端淬滅基團 正 常情況下儀器檢測不到5 端報告基團發(fā)出的熒光信號 當溶液中有模板時 模板變性后低溫退火 引物與探針同時與模板結(jié)合 在引物的介導下 沿模板向前延伸至探針結(jié)合處 發(fā)生鏈的置換 激 活Taq酶的5 外切酶活性 將探針5 端連接的熒光報告基團從探針上切 割下來 游離于反應體系中 從而受光刺激激發(fā)出熒光 切割的熒光基 團數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例 根據(jù)PCR反應液的熒光強度即可計算出初 始模板的數(shù)量 REAL TIME PCR 雙脫氧末端終止測序法 利用大腸桿菌DNA聚合酶 以單鏈DNA為模板 以與模板 事先結(jié)合的寡聚核苷酸為引物 根據(jù)堿基配對原則將脫氧核 苷三磷酸 dNTP 底物的5 磷酸基團與引物的3 OH末端 生成3 5 磷酸二酯鍵 這種磷酸二酯鍵的不斷形成 新的互補DNA得以從5 3 延伸 引入了雙脫氧核苷三磷酸 ddTNP 作為鏈終止劑 ddTNP比普通的dNTP在3 位置缺少一個羥基 通過其5 三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中 由于缺少3 OH 不能同后續(xù)的dNTP形成3 5 磷酸二酯鍵 正在增長的DNA鏈不再延伸 終止于這個異常的核苷酸處 在4組獨立的酶反應體系中 分別終止于模板鏈的每一個A 每一個C 每個G和每一個T位置上 高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 從放射自顯影膠片上直 接讀出DNA上的核苷酸順序 DNA Sequencing 分子病理臨床應用 分子病理臨床應用 Application of Molecular Pathology in Oncology 1 診斷 診斷 Diagnosis 淋巴瘤分子診斷淋巴瘤分子診斷 淋巴瘤不同類型鑒別診斷淋巴瘤不同類型鑒別診斷 套細胞淋巴瘤 mantle cell lymphoma MCL 的母細胞亞型與其它大細胞性B細胞淋 巴瘤 尤其是CD5陽性的彌漫性大B細胞淋巴 瘤 diffuse large B cell lymphoma DLBCL 相鑒別 分子標記 t 11 14 FISH PCR 小細胞性B細胞淋巴瘤不同類型相鑒別 如 FL 黏膜相關(guān)淋巴組織 mucosa associated lymphoid tissue MALT 淋巴瘤與MCL 分子標記 t 14 18 t 11 18 t 11 14 FISH PCR 子宮頸癌檢查 細胞非典型性發(fā)育異常細胞非典型性發(fā)育異常 細胞癌變細胞癌變 阻止細胞正常凋亡阻止細胞正常凋亡 高危型高危型HPV持續(xù)性感染持續(xù)性感染 人類染色體端粒酶基因人類染色體端粒酶基因 hTERC 擴增擴增 致癌基因致癌基因E6 E7編碼的原癌蛋白表達編碼的原癌蛋白表達 TERC 人類染色體末端酶 基因定位在 人類染色體末端酶 基因定位在3q26 3 該基因的擴 增可阻止細胞凋亡 導致腫瘤產(chǎn)生 該基因的擴 增可阻止細胞凋亡 導致腫瘤產(chǎn)生 CIN2 and CIN3區(qū)分正常區(qū)分正常 ASCUS and CIN1的靈敏度和特異性達到的靈敏度和特異性達到90 預測從預測從 CIN1 CIN2 發(fā)展到發(fā)展到CIN3的風險 在 的風險 在 52 96 其預測靈敏度是 其預測靈敏度是100 特異性是 特異性是 70 7271例有組織病理學檢查結(jié)果 組織病理學和hTERC基因異常擴增情況見下表7271例有組織病理學檢查結(jié)果 組織病理學和hTERC基因異常擴增情況見下表 表 宮頸病理學分類與hTERC基因異常擴增的相關(guān)性表 宮頸病理學分類與hTERC基因異常擴增的相關(guān)性 病理學分 級 正常 炎癥 濕 疣 宮頸上皮 內(nèi)瘤變 CIN 1 CIN2CIN3浸潤癌 hTERC基 因擴增率 6 6 10 6 26 8 65 4 83 0 93 5 病理學分 級 正常 炎癥 濕 疣 宮頸上皮 內(nèi)瘤變 CIN 1 CIN2CIN3浸潤癌 hTERC基 因擴增率 6 6 10 6 26 8 65 4 83 0 93 5 除正常和炎癥除正常和炎癥 濕疣組外 其余各組間濕疣組外 其余各組間hTERC基因異常擴增率均有明顯差異 基因異常擴增率均有明顯差異 p 0 01 以上結(jié)果與國外文獻報道相似 以上結(jié)果與國外文獻報道相似 FDA 美國食品和藥品管理局 批準的 無創(chuàng)傷性膀胱癌尿液檢測方法 尿核基質(zhì)蛋白22 NMP22 膀胱腫瘤抗原 BTA 免疫細胞檢查法 ImmunoCyt 纖維素和纖維蛋白原降解產(chǎn)物 熒光原位雜交 FISH 具有診斷潛力的腫瘤標記物 如端粒酶 存活素 survivin 透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸酶 黏液素 7 核基質(zhì)蛋白 BLCA 4 微衛(wèi)星序列分析和單核苷 酸多態(tài)性分析等 其臨床實用價值還有待于進一步 研究觀察 FISH技術(shù)與其它非創(chuàng)傷性檢查的比較 膀 胱 癌 的 尿 中 標 志 物膀 胱 癌 的 尿 中 標 志 物 Clin Chim Acta 2004 340 57 65 FISH技術(shù)與其它非創(chuàng)傷性檢查的比較 FISH與尿細胞學檢查比較與尿細胞學檢查比較 報道者 病例數(shù) 敏感度報道者 病例數(shù) 敏感度 特異度特異度 尿細胞學檢查尿細胞學檢查 Glas et al 3444 55 94 Eissa et al 110 58 100 Melissourgos et al 274 44 96 Shariat et al 174 52 91 Shariat et al 191 54 90 衛(wèi)生部課題 衛(wèi)生部課題 31 9 94 1 FISH檢查檢查 Friedrich et al 103 68 89 Skacel et al 120 85 97 衛(wèi)生部課題 衛(wèi)生部課題 83 2 94 5 FISH 檢查 靈敏度靈敏度遠高 于尿細胞學 檢查 而特 異度 特 異度接近尿 細胞學檢查 Glas et al J Urol 2003 169 1975 1982 Eissa et al Anticancer Res 2003 23 4347 4356 Melissourgos et al Urology 2003 62 362 367 Shariat et al J Urol 2004 171 626 630 Shariat et al J Urol 2003 170 2244 2247 Friedrich et al BJU Int 2003 92 911 914 Skacel et al J Urol 2003 169 2101 2105 Note 衛(wèi)生部課題衛(wèi)生部課題 3999例 FISH 血尿鑒別診斷血尿鑒別診斷 移行上皮細胞腫瘤早期診斷移行上皮細胞腫瘤早期診斷 可考慮取代尿細胞學檢查可考慮取代尿細胞學檢查 移行上皮細胞腫瘤術(shù)后評估及治療后病程監(jiān)測 腎盂癌鑒別診斷 移行上皮細胞腫瘤術(shù)后評估及治療后病程監(jiān)測 腎盂癌鑒別診斷 2 治療與預后 治療與預后 Treatment and Prognosis 靶向治療 靶向治療 Target Therapy 1998 1998 年美國年美國FDA FDA 批批 準第一個專門針對準第一個專門針對 p185p185高表達乳腺癌高表達乳腺癌 的抗體治療藥物的抗體治療藥物 HerceptinHerceptin上市上市 在在 全世界開創(chuàng)了單抗全世界開創(chuàng)了單抗 類分子靶向藥物治類分子靶向藥物治 療腫瘤的新時代 療腫瘤的新時代 HERHER 2 2過表達與生物靶向治療過表達與生物靶向治療 免疫組化FISH陰性FISH陽性陽性率 0892565 9 1 51421129 1 2 32741555 9 3 7466089 9 總計1807134242 6 FISH 與與 IHC 相關(guān)性研究相關(guān)性研究 HER 2檢測推薦方法檢測推薦方法 免疫組化 免疫組化 IHC FISH 金標準金標準 Standard of Care in HER2 positive Stomach Cancer Approximately 22 of stomach cancer being HER2 Advanced stomach cancer associated with a poor prognosis median survival after diagnosis approximately 10 months Adding Herceptin to standard chemotherapy Xeloda or intravenous 5 FU and cisplatin in patients with inoperable locally advanced recurrent and or metastatic HER2 gastric cancer increased the median overall survival time by 2 7 months to 13 8 months increased the response rate by 34 5 to 47 3 high levels of HER2 associated with greater benefit Herceptin for HER2 positive Stomach Cancer American Society for Clinical Oncology Annual Meeting in Orlando Florida 2009 EGFR基因檢測與 EGFR基因檢測與 Iressa Tarceva 國外國外 突變型突變型NSCLC用用Iressa Tarceva有效率 有效率 80 無突變無突變NSCLC用用Iressa Tarceva有效率約有效率約10 國外國外 NSCLC病人病人EGFR基因拷貝數(shù)增加與基因拷貝數(shù)增加與Iressa Tarceva 用藥相關(guān)性的研究目前正在進行 目前研究結(jié)果 用藥相關(guān)性的研究目前正在進行 目前研究結(jié)果 用藥有效率用藥有效率 拷貝數(shù)增加拷貝數(shù)增加病人的用藥有效率約在病人的用藥有效率約在38 9 拷貝數(shù)不增加病人的用藥有效率約在拷貝數(shù)不增加病人的用藥有效率約在9 8 K RAS基因檢測 與 基因檢測 與Cetuxamab 西妥昔單抗 和 西妥昔單抗 和Panitumumab 相關(guān)藥物及療效相關(guān)藥物及療效 PR 少量少量CR Ref drugsptsWT K RASM K RAS 56panitumumab20817 0 57cetuximab2753 10 58cetuximab10841 0 59cetuximab5927 9 0 60cetuximab3138 1 20 61P C4831 25 6 25 63cetuximab11443 6 0 與與EGFR單抗治療有關(guān)的其它發(fā)現(xiàn)單抗治療有關(guān)的其它發(fā)現(xiàn) KRAS BRAF W KRAS BRAF V600E 無效無效 KRAS EGFR配體 EGFR配體 表皮調(diào)節(jié)素 雙調(diào)蛋白 W KRAS EREG or AREG高表達 更有效更有效 PIK3CA基因突變 PTEN蛋白表達缺失 耐藥耐藥 TS DNA合成所需嘧啶核苷合成的關(guān)鍵酶 含氟尿嘧啶類藥物 如5 FU 作用的靶酶 TS表達與預后 TS高表達高表達的組織增殖較快 惡性度較高 TS高表達高表達是化療療效差 預后差的指標 如TS的表達與結(jié)直腸癌 膀胱癌的分期成正相關(guān) TS表達與5 FU類的化療相關(guān)性 低表達低表達大腸癌對5 Fu的敏感性優(yōu)于高表達高表達組 預后也明顯 優(yōu)于高表達組 有待進一步研究 表達檢測 RT PCR IHC TS 胸苷酸合成酶胸苷酸合成酶 與腫瘤靶向藥物治療與腫瘤靶向藥物治療 腫瘤藥物敏感 性腫瘤藥物敏感 性 Drug Sensitivity 紫杉類和長春堿類化療藥物 作用于微管蛋白異二聚體形成的微管 破壞腫瘤細 胞的有絲分裂 耐藥機制 tubulin 表達增加 微管的動態(tài)不穩(wěn)定性增 加 表達增加 微管的動態(tài)不穩(wěn)定性增 加 tubulin變異變異 Beta tubulin與紫杉類和長春堿類化療藥物與紫杉類和長春堿類化療藥物 微管蛋白與耐藥 tubulin 的表達程度表達程度影響肺癌肺癌對紫杉醇和長春瑞 濱的敏感性 表達水平的增高與對紫杉醇的耐藥性呈正相關(guān) 低表達者對紫杉醇敏感性較