離子淌度質(zhì)譜.doc

離子淌度質(zhì)譜離子淌度質(zhì)譜是離子淌度分離與質(zhì)譜聯(lián)用的一種新型二維質(zhì)譜分析技術(shù)，離子淌度分離原理是基于離子在飄移管中與緩沖氣體碰撞時(shí)的碰撞截面不同，離子可按大小和形狀進(jìn)行分離。經(jīng)過30多年的發(fā)展，離子淌度質(zhì)譜已配有多種最新的離子源及質(zhì)量分析器，理論研究也日漸成熟，并在蛋白質(zhì)、多肽及復(fù)雜化合物異構(gòu)體分析方面越發(fā)顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，正在發(fā)展成為一種新型的重要分析工具。 20世紀(jì)80年代后，由于各種軟電離技術(shù)相繼問世，質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)的應(yīng)用拓展到對(duì)高極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的生物大分子的分析研究，發(fā)展成為生物質(zhì)譜，并迅速成為現(xiàn)代分析化學(xué)最前沿的領(lǐng)域之一 。離子淌度質(zhì)譜(ion mobility mass spectrometry，IMMS)是離子淌度光譜(ion mobility spectrometry，IMS)技術(shù)與質(zhì)譜的聯(lián)用。是一種新型的二維分離質(zhì)譜技術(shù)。IMS技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，由于其具有多樣性的分析能力、良好的檢測(cè)限及實(shí)時(shí)的檢測(cè)能力，在當(dāng)時(shí)受到人們廣泛關(guān)注，但由于IMS分辨率較低且不能給出離子質(zhì)量信息，加之當(dāng)時(shí)人們對(duì)離子組成的重要性缺乏理解，因此在1976年以后，有關(guān)離子淌度的研究逐漸減少。直到20世紀(jì)80年代末，特別是以MALDI和ESI 為代表的各種軟電離方法應(yīng)用以來，IMS在化合物異構(gòu)體分離方面具有的獨(dú)到優(yōu)勢(shì)才又引起了人們的關(guān)注，相繼推出了配備各種新型離子源的IMSMS聯(lián)用技術(shù)，精確的離子幾何形狀和淌度計(jì)算方法得到飛速發(fā)展，IMMS技術(shù)有了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。目前，IMMS已經(jīng)用來檢測(cè)化學(xué)戰(zhàn)劑、爆炸物 、環(huán)境污染 、麻醉劑 、半導(dǎo)體及生物大分子(如肽和蛋白質(zhì)類)，并顯示出其強(qiáng)大的分析能力。 1 原理與儀器組成 11 IMMS基本原理 離子淌度(ion mobility，IM)，又稱離子遷移率，是指在電場(chǎng)強(qiáng)度為1 Vm或電場(chǎng)力為1N時(shí)正離子或負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)速度，單位為m V。在IMS中，離子受電場(chǎng)力加速的作用向前運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)中又與飄移區(qū)緩沖氣體分子發(fā)生碰撞產(chǎn)生阻力使速度降低。碰撞過程中離子失去的動(dòng)能可轉(zhuǎn)化為內(nèi)能使離子溫度升高，再次的碰撞又可將升高的內(nèi)能傳遞給氣體分子，回復(fù)到系統(tǒng)溫度 。因此，離子在運(yùn)動(dòng)過程中溫度和速度并不保持恒定。離子之間、離子與緩沖氣體之間也可能存在著靜電引力與庫(kù)侖斥力，決定了離子在飄移區(qū)的運(yùn)動(dòng)過程是極其復(fù)雜的，只能由其平均速度(即離子淌度 )或離子通過飄移區(qū)的時(shí)間td來計(jì)量。這種分離過程與色譜的分離過程類似，因此IMS在早期又被稱為等離子體色譜(plasmachromatography，Pc)。為了使不同實(shí)驗(yàn)條件下的測(cè)量值能夠相互比較，在實(shí)際應(yīng)用中通常將離子淌度轉(zhuǎn)換為折合離子淌度(reduced ionmobility， )，即在溫度為273 K，壓力為760 Tort的條件下的離子淌度，離子的大小和形狀可用離子與緩沖氣體發(fā)生碰撞時(shí)的平均可用截面即碰撞截面(collision Cross section，n)來衡量。由上述可知，離子淌度分離主要是基于離子的形狀和大小。因此，對(duì)于用常規(guī)質(zhì)譜方法不能區(qū)分的異構(gòu)體或復(fù)合物等分析，這種分離手段具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。離子按淌度預(yù)分離后，再通過每一組分質(zhì)荷比求得質(zhì)量數(shù)，便可獲得離子淌度質(zhì)譜二維圖譜或三維圖譜(圖1)。 12 儀器組成 離子淌度質(zhì)譜儀與常規(guī)質(zhì)譜儀的主要區(qū)別在于前者在離子源和質(zhì)量分析器之間增加了一個(gè)離子飄移管。離子飄移管通常由不導(dǎo)電的高純度氧化鋁制成，中間鑲嵌若干不銹鋼環(huán)，不銹鋼環(huán)之間以高溫電阻相連，兩端不銹鋼環(huán)之間施加驅(qū)動(dòng)離子前進(jìn)的電場(chǎng)。質(zhì)量分析器可采用四極質(zhì)量分析器或飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，由于四極分析器掃描離子費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，現(xiàn)在IMMS分析器多為飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOFMS)。儀器中飄移管部分通以緩沖氣體，質(zhì)量分析器部分采用高真空，二者之間配以由錐體和離子透鏡組成的接口。典型的離子淌度質(zhì)譜的組成見圖2。由于離子在飄移管中通過的時(shí)間為毫秒級(jí)，在飛行管中通過時(shí)間為微秒級(jí)，在下一組分到來前有充足的時(shí)間求得離子的質(zhì)量數(shù)，因此對(duì)每一組分可在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)求得淌度和質(zhì)量數(shù)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可在1 min內(nèi)完成。 有時(shí)為了獲得更多的離子信息，可在飄移管前和(或)后串聯(lián)使用幾種質(zhì)量分析器，如離子阱或四極濾質(zhì)器等。 2 離子淌度理論的研究進(jìn)展 21 緩沖氣體對(duì)碰撞截面的影響 IMS區(qū)分離子是通過與緩沖氣體分子碰撞過程而實(shí)現(xiàn)的，緩沖氣體的種類直接影響分離過程。氮?dú)夂秃馐亲畛Ｓ玫膬煞N氣體，氮?dú)庖话阌糜诔Ｒ?guī)分析，氦氣常用于結(jié)構(gòu)分析。其他氣體還有二氧化碳、六氟化硫、氨 和四氟化碳 。使用不同緩沖氣體的理論研究在1975年之后便很少，即使是現(xiàn)在也還沒有引起人們足夠的重視，但在實(shí)際應(yīng)用中，使用不同的氣體對(duì)獲得良好的分辨率和檢測(cè)靈敏度相當(dāng)重要。 離子的碰撞截面不僅與緩沖氣體的質(zhì)量數(shù)有關(guān)，而且取決于緩沖氣體極化率的大小 。Matz等 研究6種苯丙胺(安非他明)衍生物在氦氣、氬氣、氮?dú)馀c二氧化碳4種不同緩沖氣體下的碰撞截面，結(jié)果顯示碰撞截面隨緩沖氣體質(zhì)量數(shù)的上升而上升，但并無嚴(yán)格的線性關(guān)系。而極化率與碰撞截面之間有良好的線性關(guān)系，碰撞截面隨極化率的上升而上升，這也說明碰撞截面更依賴于緩沖氣體的極化率而不是質(zhì)量數(shù)。Els等 研究了不同濃度的氮?dú)舛趸蓟旌蠚怏w作為緩沖氣體在l0 水平分離5種氯代和溴代乙酸的情況，使用100 氮?dú)猓?種組分淹沒在其他峰中，若在緩沖氣體中加入3二氧化碳，則能達(dá)到完全分離，表明載氣的組成明顯影響峰形的檢出。 22 離子淌度與質(zhì)荷比的關(guān)系 IMS分辨率較低，即使是高分辨IMS也只能達(dá)到與常規(guī)HPLC相同或稍高的分辨能力，這使其單獨(dú)分離復(fù)雜混合物變得困難。在IMS發(fā)明之初，研究者就試圖通過建立 與mz的關(guān)系，由 推知離子的質(zhì)量數(shù)。但大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明， 與mz之間只是一種粗略的線性趨勢(shì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)離子質(zhì)量數(shù)的精確要求，IMS在質(zhì)荷比(mz) IMMS中只能作為一種前質(zhì)量分析器。盡管有的物質(zhì)能夠通過單一的離子淌度技術(shù)快速鑒別開來，但I(xiàn)MMS能夠提供的二維“淌度質(zhì)量”模式能夠達(dá)到對(duì)復(fù)雜混合物的高分辨分離。在二維IMMS(2-D IMMS)中，不同電荷的離子其“淌度質(zhì)量”線性趨勢(shì)明顯不同，通過對(duì)復(fù)雜產(chǎn)物的2-D數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出其不同的“淌度質(zhì)量”關(guān)系已經(jīng)成為鑒定和解釋這些產(chǎn)物的一種重要技術(shù)。Clemmer等已經(jīng)通過 與mz趨勢(shì)關(guān)系鑒別了低淌度(單電荷)和高淌度(雙電荷)的兩組肽混合物 J。Russel等使用內(nèi)標(biāo)作為參照標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù) 與mz關(guān)系將蛋白質(zhì)酶解后的肽混合物分開 。Stciner 利用ESIAPIIMTOFMS分析水溶性化學(xué)戰(zhàn)劑降解產(chǎn)物，使用相同系列的n一烷基胺作為基線標(biāo)準(zhǔn)，利用不同降解產(chǎn)物的與mz趨勢(shì)使其得到鑒定。 離子淌度的測(cè)定受各種因素的影響，如電噴霧溶劑組成、飄移區(qū)溫度、噴霧電壓、溶劑流速、緩沖氣體流速、冷卻氣體流速等諸多因素影響。 23 離子電荷、取代基與碰撞截面的關(guān)系 盡管還沒有方法證明氣相離子和溶液中離子的結(jié)構(gòu)之間有如何緊密的關(guān)系，但精確測(cè)量離子的碰撞截面還是能提高對(duì)肽、蛋白質(zhì)等復(fù)雜物質(zhì)結(jié)構(gòu)的理解。離子中原子間氫鍵和范德華力使其呈現(xiàn)折疊和緊湊狀態(tài)，電荷和庫(kù)侖斥力則克服離子內(nèi)的相互吸引而使分子呈現(xiàn)松散狀態(tài)。Kindy等利用同位素標(biāo)記研究了3種蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)單乙酰化肽段的碰撞截面比未乙?；囊叱?5 35 ；雙乙?；脑黾痈?，這種增加(特別對(duì)大的肽段)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于乙?；捏w積增大因素，表明乙?；哂袑?duì)肽離子整體結(jié)構(gòu)改變的特殊作用。Badman等 叫研究了泛素從ESI進(jìn)入IM管過程中碰撞截面的變化過程，認(rèn)為離子進(jìn)入飄移管的初期均為緊湊結(jié)構(gòu)，受加速電壓的作用才快速伸展成開放結(jié)構(gòu)。 離子中電荷的位置和數(shù)量是影響氣相離子碰撞截面的重要參數(shù)。Wu等 研究了強(qiáng)啡肽A的3個(gè)片段F7(TyrGlyGlyPheLeuArgArg)、F8(TyrGlyGlyPheLeuArgArg一e)、F、9(TyrGlyGlyPheLeuArgArgHeArg)帶13個(gè)電荷時(shí)的碰撞截面變化情況，結(jié)果見表1。單電荷和雙電荷的碰撞截面從F7至F、9增加值穩(wěn)定在約9 ，這可用在C端增加一個(gè)氨基酸的“大小效果”很好地解釋。另外，所有3種肽從單電荷到雙電荷碰撞截面的增加都保持在相似的7 一8水平。隨著電荷的增加，庫(kù)侖斥力增加使肽呈現(xiàn)更松散狀態(tài)。然而，在F7和F8中引入第3個(gè)電荷，卻使碰撞截面急劇上升，這是因?yàn)樵谶@些肽中只存在3個(gè)堿性位點(diǎn)，相鄰的兩個(gè)精氨酸殘基必須同時(shí)質(zhì)子化，急劇增加的庫(kù)侖斥力能使得離子以一種更加伸展的狀態(tài)存在，而使碰撞截面急劇增加。F、9離子增加不顯著是因?yàn)槟┒司彼釟埢拇嬖诳梢员苊鈨蓚€(gè)相鄰氨基酸均被質(zhì)子化。Badman等 總結(jié)了19962001年間發(fā)表的細(xì)胞色素e氣態(tài)離子碰撞截面的數(shù)據(jù)，所帶電荷從+3至+20，雖然同電荷離子的碰撞截面數(shù)值稍有不同，但均表現(xiàn)為隨電荷的增加而增加，增加幅度也極為相似。 利用碰撞截面最具優(yōu)越性的地方在于區(qū)別具有相同電荷、相似質(zhì)量的不同離子或質(zhì)量數(shù)相同的異構(gòu)體離子。Henderson等 研究了細(xì)胞色素c兩個(gè)酶解碎片IFVQKCAQCHTVEK(相對(duì)分子質(zhì)量為1 633820)和hemeCAQCHTVEK(相對(duì)分子質(zhì)量為1 633615)，二者具有極為相似的質(zhì)量數(shù)，在序列已知的情況下，利用軟件模擬其電荷分布情況，分別計(jì)算其所需的碰撞截面和加速電壓，測(cè)量其離子淌度，求出碰撞截面并與計(jì)算值相比較，從而區(qū)分兩種碎片，結(jié)果顯示兩個(gè)碎片均帶兩個(gè)電荷，分別為I rVQKCAQCHTVEK 和hemeC“AQCHTVEK (上標(biāo)為質(zhì)子化位置)。 文獻(xiàn)35列出了34種常見蛋白質(zhì)酶解后的660種肽離子的碰撞截面數(shù)據(jù)，并從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度在理論上分析了氨基酸殘基的內(nèi)在形狀參數(shù)與碰撞截面的關(guān)系，從而可通過氨基酸序列預(yù)測(cè)肽離子的碰撞截面。文獻(xiàn)36也有類似報(bào)道。 3 展望 質(zhì)譜技術(shù)是當(dāng)今分析化學(xué)領(lǐng)域最重要的技術(shù)之一。離子淌度質(zhì)譜結(jié)合了離子淌度技術(shù)靈敏、快速、能夠提供離子結(jié)構(gòu)信息和質(zhì)譜能夠提供準(zhǔn)確質(zhì)量信息的特點(diǎn)，在化合物異構(gòu)體分析、生物大分子相互作用分析等方面正顯示出越來越多