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分子生物學復習 張玉蕾 水產(chǎn)0703 2020-1-16分子生物學復習第1頁 共8頁第二章 核酸的結構1、基本概念：增色效應、減色效應、回文結構、DNA的一結構級、二級結構DNA變性（DNA Denaturation）：雙螺旋DNA溶解成單鏈的現(xiàn)象，也稱溶解。DNA復性（DNA Renaturation）：變性DNA在一定條件下重新恢復雙鏈的過程，也稱退火（Anneal）。增色效應：在DNA的變性過程中，紫外吸收（260 nm）值增大減色效應：在DNA的復性過程中，紫外吸收（260 nm）值減小回文序列（inverted repeat，palindrome sequence）（反向重復）：指在雙鏈DNA中某些區(qū)段含有兩個結構相同、但方向相反的序列。DNA的一結構級：DNA分子中核苷酸的排列順序DNA的二級結構：兩條單鏈DNA通過堿基互補配對的原則形成的雙螺旋結構。2、分子雜交：親緣關系相近的不同來源DNA單鏈或DNA單鏈與RNA單鏈之間通過堿基互補形成雜交分子的過程稱為分子雜交。1）Southern雜交（Southern Blotting）：DNA + DNA將DNA固定在濾膜上，用標記好的同位素DNA探針與之雜交，通過放射自顯影顯示與探針互補的區(qū)帶，識別特異序列。2）Northern雜交：RNA + DNA研究對象是mRNA，探針一般是DNA。將RNA固定在濾膜上，用DNA探針與之雜交。3）Western雜交：蛋白質蛋白質抗原與抗體的雜交，研究克隆基因表達產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術。4）原位雜交（in situ bloting）利用標記的已知核酸探針，在組織、細胞及染色體上檢測特異的DNA或RNA序列的核酸雜交技術 3、影響DNA變性、復性的因素 影響DNA變性的因素：Tm（melting temperature）：使DNA雙螺旋結構解開一半的鏈時的溫度。影響 Tm值的因素1）在 A，T，C，G 隨機分布的情況下，GC%愈高Tm值愈大2）GC%含量相同的情況下，AT形成變性核心，變性加快，Tm值小3）片段的長度大片段D.S.DNA分子之間比較：片段長短對Tm值的影響較小，與組成和排列相關小于100bp的D.S DNA分子比較：片段愈短，變性愈快，Tm值愈小4）變性劑（如尿素，酰胺等）尿素，酰胺與堿基間形成氫鍵改變堿基對間的氫鍵Tm值可降至40左右5）介質中的離子強度：離子強度高，Tm高6）極端pH條件的影響：一切減弱氫鍵， 堿基堆積力的因素，均將使Tm值降低 影響DNA復性的因素復性過程依賴于單鏈分子間的隨機碰撞1）陽離子濃度：0.18 0.2M Na+ 可消除poly dNt間的靜電斥力2）溫度：復性反應的溫度 Tm253）S.S.DNA分子的長度S.S.DNA愈長分子擴散愈慢復性愈慢S.S.DNA愈短分子擴散愈快復性愈快4）S.S.DNA 的初始濃度5）DNA分子中，dNt的排列狀況（隨機排列，重復排列）第三章 基因與基因組的結構1、基本概念：重疊基因、割裂基因、內含子、外顯子、假基因、跳躍基因、C值矛盾、持家基因、奢侈基因、選擇性剪接、微衛(wèi)星DNA重疊基因（overlapping gene）：共同使用同一DNA序列，但編碼兩種不同蛋白質的基因。C值矛盾：每個物種單倍體基因組總DNA的含量稱為最大C值，編碼基因信息的總DNA含量稱為最小C值；a生物體進化程度高低與大C值不成明顯相關（非線性）；b親緣關系相近的生物大C值相差較大；c一種生物內大C值與小c值相差極大微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）：由2-6個bp單位組成的串聯(lián)重復序列，分散于整個核基因組。如TGTGTG =（TG）n持家基因（house keeping gene）：在不同種類的細胞中均表達，功能對于每個細胞都必需；占基因總數(shù)90奢侈基因（luxury gene）：僅在特定的細胞類型中表達；占基因總數(shù)10假基因（pseudo gene）：核苷酸序列與編碼某一蛋白質的基因相似，但不具功能，不能轉錄形成成熟mRNA或不能翻譯出功能蛋白質。跳躍基因（jumping gene）從基因組上的一個位置轉移到同一條染色體或另一條染色體的另一個位置，引起相應控制性狀的改變。外顯子（exon）：編碼的DNA序列，即被表達的DNA區(qū)段。內含子（intron）：不編碼的DNA序列。割裂基因（Split Genes）：DNA和mRNA之間形成特殊的RNA-DNA異源雙鏈分子結構。選擇性剪接：同一區(qū)段DNA序列可以加工生成兩條或兩條以上的鏈。2、原核生物、真核生物基因組的特點；線粒體基因組的特點（了解）原核生物基因組的特點：1）基因組較小，編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成，非編碼DNA比例較少，無內含子；2）有操縱子結構， 且為多順反子；3）結構基因多為單拷貝，rRNA基因多拷貝；4）有些基因之間可以形成重疊基因； 真核生物基因組的特點：1）基因組較大，結構復雜，大部分位于細胞核中，為雙鏈線狀，并與蛋白質結合形成染色質，而且染色體數(shù)目往往不是一條，而是多條；2）每條染色體的DNA分子具有多個復制起點，基因內存在內含子，真核基因多為斷裂基因；3）編碼序列僅占基因組DNA的一小部分，絕大多數(shù)為非編碼序列；4）基因組中存在大量的重復序列，重復序列在人基因組中約占50；5）轉錄產(chǎn)物為單順反子mRNA，即一mRNA只能翻譯成一種蛋白質。 線粒體DNA基因組的特點（了解）：1）分子結構簡單；2）mt-DNA的相對分子量低；3）進化速度快（mt-DNA結構基因）4）無組織特異性5）核苷酸組成不均一。第四章 DNA復制1、DNA復制的特點1）半保留復制；2）半不連續(xù)復制2、DNA復制的方式（復制叉復制、形復制、滾環(huán)復制、D形復制）a、新起始方式（de novo initiation）或復制叉式（replication fork）線狀DNA：復制叉（Replication fork）：染色體中參與復制的活性區(qū)域，即復制正在發(fā)生的位點。環(huán)狀DNA：型復制：從復制起點開始，雙向同時進行，形成樣中間物；復制可以是雙向或單向進行，多數(shù)為等速雙向復制。b、滾環(huán)式復制（rolling circle replication）由于復制時產(chǎn)生的滾環(huán)結構形狀象，又稱復制。如病毒、細菌因子c、D環(huán)復制（D-loop replication）特點：復制起點不在雙鏈DNA同一位點。如線粒體或葉綠體DNA的復制方式3、線狀 DNA的復制及避免5末端短縮的模式1）T7噬菌體T7 DNA兩端的DNA序列區(qū)約有100bp長的序列完全相同（正向重復）。而且在T7 DNA復制時，產(chǎn)生的子代DNA分子不是一個單位T7 DNA長度，而是許多單位長度的T7 DNA首尾連接在一起。T7 DNA兩個子代DNA分子都會有一個3 端單鏈尾巴，兩個子代DNA的3 端尾巴以互補結合形成兩個單位T7 DNA的現(xiàn)性連接。然后由DNA聚合酶填充和DNA連接酶連接后，繼續(xù)復制便形成四個單位長度的T7 DNA分子。這樣復制下去，便可形成多個單位長度的T7 DNA分子。這樣的T7 DNA分子可以被特異的內切酶切開，用DNA聚合酶填充與親代DNA完全一樣的雙鏈T7 DNA分子。2） 腺病毒DNA復制腺病毒DNA兩端為反向重復序列，首先末端前體蛋白與ser和dCTP結合形成復制起始復合體，由dCMP提供3 OH引發(fā)復制。3） 真核生物端粒首先端粒酶與端粒DNA結合，端粒酶中的RNA與突出的3 引物配對；以RNA為模板，在DNA3 端從頭合成DNA；延伸6個nt；合成一個重復單位后，端粒酶向DNA模板新合成的3 端移動，引物再和模板配對，就這樣循環(huán)往復周而復始，最后產(chǎn)生端粒。4、引起DNA損傷的機制1）DNA復制產(chǎn)生的損傷a、復制中的堿基錯配；b、堿基的互變異構移位（tautomeric shift）；c、DNA聚合酶的“打滑”；d、堿基的脫氨基作用（deamination）；e、堿基丟失2）物理因素引起的DNA損傷a、紫外線引起b、電輻射引起3）化學因素引起的DNA損傷a、烷化劑對DNA的損傷b、堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷4）嵌入染料：結果產(chǎn)生移框突變5、DNA修復（repair）機制 1）直接修復（direct repair）：光修復（light repair）紫外線損傷：DNA鏈兩個相鄰嘧啶間以共價鍵相連形成嘧啶二聚體。修復機制：在可見光（300600nm）活化之下，由光復活酶（photoreactivating enzyme，PR）催化胸腺嘧啶二聚體分解為單體。2）切除修復（excision repair）：是一種廣泛存在的修復機制，由多種酶參與，可適用于多種DNA損傷的修復。基本過程：將受損的DNA片段切除，然后再以對側鏈為模板，重新合成新鏈進行修復。方式：堿基切除修復和核苷酸切除修復3）重組修復（recombination repair）：復制起始時尚未修復的DNA損傷部位先復制再修復，也稱為復制后修復。復制時由于復制酶系統(tǒng)在損傷部位不能通過堿基配對合成子鏈，因此復制出的子鏈出現(xiàn)一空缺。4）SOS修復SOS反應：細胞DNA受到嚴重損傷或DNA復制系統(tǒng)受到抑制的緊急狀態(tài)下，為求生存而出現(xiàn)的應急反應。修復結果只是能維持基因組的完整性，提高細胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復（error-prone repair）5）錯配修復系統(tǒng)（Mismatch repair system）a識別錯配的堿基對；b對錯配的一對堿基要能準確區(qū)別哪一個是錯的，哪一個是對的；c切除錯誤的堿基，并進行修復合成。第五章 RNA轉錄1、轉錄（transcription）：是指以DNA為模板，在RNA聚合酶催化下，以4種NTP（ATP、CTP、GTP和UTP）為原料，合成RNA 的過程。2、轉錄的特點1）轉錄的不對稱性a以雙鏈DNA中的一條單鏈作為轉錄模板（雜交實驗所證實）b用于轉錄的DNA鏈為模板鏈（template strand），也稱反義鏈（anti-sense strand）c不作模板的鏈為編碼鏈（coding strand），也稱有義鏈（sense strand）d有義鏈與反義鏈并非固定不變。2）轉錄的連續(xù)性且不需要引物3）轉錄的單向性：RNA轉錄合成時，只能向一個方向進行聚合，所依賴的模板DNA鏈的方向為35，而RNA鏈的合成方向為53。 4）有特定的起始和終止位點3、轉錄與復制的不同點區(qū)別轉錄復制模板模板鏈轉錄（不對稱轉錄）兩條鏈均復制原料NTPdNTP酶RNA聚合酶DNA聚合酶產(chǎn)物mRNA，tRNA， rRNA子代雙鏈DNA（半保留）3OH（引物）不需要需要連續(xù)性連續(xù)片段配對A-U，G-CA-T，G-C4、增強子（enhancer）：能使基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列。特點：1）增強效應十分明顯，一般能使基因轉錄頻率增加10-200倍。2）增強效應與其位置和取向無關3）增強效應有嚴格的組織和細胞特異性4）沒有基因專一性，可在不同基因組合上表現(xiàn)增強效應5）沒有生物種屬的特異性，其作用受到細胞發(fā)育和分化的影響6）許多增強子還受外部信號的調控7）增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用。但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性。5、原核生物轉錄如何終止？（真核生物了解） 不依賴因子的終止子終止轉錄在終止回文序列處轉錄出來的RNA形成發(fā)卡結構,這種結構與RNA聚合酶結合，阻礙了RNA鏈從三元復合體中進一步向外釋放，因而造成轉錄作用的高度延宕。GC含量越高，延拓時間越長，單靠發(fā)卡結構并不足以使轉錄終止，還需要模板上回文序列后面的富含A/U序列，在轉錄出若干個U后，由于A和U之間的氫鍵和堿基堆積力很弱，RNA和DNA雜交部分很容易拆開，RNA聚合酶從RNA鏈上解離下來，轉錄的終止。 依賴因子的終止子終止轉錄（1）通讀（read through）：在依賴因子的轉錄終止過程中，RNApol轉錄了IR序列之后，雖發(fā)生一定時間的延拓，但如果沒有因子存在，則RNApol會繼續(xù)轉錄。（2）因子對終止子的作用因子結合在合成的RNA鏈5 端利用水解ATP放出的能量，因子沿RNA從53移動，而RNA聚合酶在終止子處的較長時間的延拓給因子追趕的機會因子與聚合酶相互作用而造成轉錄的終止，聚合酶和因子從核酸分子上釋放出來。第六章 轉錄后加工1、真核生物tRNA的加工 真核生物tRNA前體及其加工的特點：真核tRNA的基因與原核不同：a真核的前體分子 tRNA數(shù)目多、單順反子、成簇排列、有基因間隔區(qū)；b真核的tRNA前體中含有內含子；（位于反密碼子環(huán)下游、長度和序列各異、內含子外顯子交界處無保守序列、剪接有RNase參與、內含子與反密碼子配對）c其加工過程要剪接內含子，都要加CCA 加工過程a剪接：去除初級產(chǎn)物中5端和3端的序列；剪接內含子序列b加CCA-OH 3末端c修飾：甲基化；還原；核苷內的轉位；脫氨2、真核生物mRNA的加工mRNA前體加帽子、加尾巴、剪接、甲基化、編輯成熟mRNApre-mRNAcapping、tailing、splicing 、methylation、editingmature mRNA 1）加帽2）3末端的加尾過程：在前體mRNA的3端距加尾信號（AAUAAA）約20nt處加上20-200個polyA的過程3）mRNA的內部甲基化4）核mRNA前體的剪接（Splicing）5）RNA編輯（editing）：指遺傳信息在mRNA水平上發(fā)生改變的過程。即RNA的編碼序列與轉錄產(chǎn)生它的DNA序列不同，轉錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入，丟失或轉換等現(xiàn)象。編輯在指導RNA（guide RNA，gRNA）作用下完成 gRNA的3OH攻擊mRNA：產(chǎn)生5段3段（5端與gRNA3相連） 5段的3-OH攻擊gRNA的U-U：生成RNA編輯產(chǎn)物（插入一個U），gRNA（少一個U）（插入U的兩步轉酯反應）第七章 蛋白質的合成1、基本概念遺傳密碼：DNA（或mRNA）中的核苷酸序列與蛋白質中氨基酸序列之間的對應關系稱為遺傳密碼。密碼子（codon）：mRNA上每3個相鄰的核苷酸編碼蛋白質多肽鏈中的一個氨基酸，這三個核苷酸就稱為一個密碼子或三聯(lián)體密碼（triplet codon）開放讀碼框：從mRNA5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個蛋白質多肽鏈，稱為開放讀碼框（open reading frame， ORF）。2、遺傳密碼的基本特征1）連續(xù)性編碼蛋白質氨基酸序列的各個三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無間斷也無交叉。如插入或缺失一堿基，可造成移碼突變。2）密碼子的簡并性 同一個氨基酸具有兩個或更多個密碼子的現(xiàn)象稱密碼子的簡并性（degeneracy）。 對應于同一種氨基酸的不同密碼子稱同義密碼子（synonymous codon）。 大多數(shù)簡并性表現(xiàn)在密碼子的第三個核苷酸上，即第一、二個核苷酸確定后，第三個核苷酸可變。3）擺動性（wobble）轉運氨基酸的tRNA的反密碼需要通過堿基互補與mRNA上的遺傳密碼反向配對結合，但反密碼與密碼間不嚴格遵守常見的堿基配對規(guī)律，稱為擺動配對。 4）密碼子的偏愛性（codon usage bias） 同一物種中，編碼同一氨基酸的密碼子的使用頻率不同。 不同物種間（原核和真核生物），編碼同一氨基酸的密碼子的使用頻率也不同。 密碼子的使用頻率與tRNA的數(shù)量有關5）通用性和變異性 蛋白質生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。 動物細胞的線粒體DNA（mtDNA）、支原體及少數(shù)纖毛類原生動物的編碼方式與通用密碼子有所不同。3、蛋白質合成原料mRNA、tRNA、rRNA、酶、蛋白質因子、ATP、GTP、核糖體4、蛋白質的合成步驟，原核生物、真核生物蛋白質合成的異同點a氨基酸的活化；b肽鏈合成的起始；c肽鏈的延伸；d肽鏈合成的終止與釋放 真核細胞蛋白質合成的特點a核糖體為80S，由60S的大亞基和40S的小亞基組成b起始密碼AUGc起始tRNA為MettRNAiMetd起始復合物結合在mRNA 5端AUG上游的帽子結構，真核mRNA無富含嘌呤的SD序列（除某些病毒mRNA外） e由多種起始因子參與（ eIF1， eIF2， eIF3等十多種 ）f真核細胞核蛋白體沒有E位，轉位時卸載的tRNA直接從P位脫落g肽鏈延伸因子（EF1， EF2）及釋放因子（RF可識別3種終止子） 真核生物細胞成熟mRNA的形成過程 內含子：不能編碼蛋白質的核苷酸片段 外顯子：編碼蛋白質的核苷酸片段 轉錄后新合成的mRNA是未成熟的mRNA，需要在特定部位剪接，最后形成較短的有功能的RNA 原核生物中，DNA鏈上不存在內含子第八章 原核生物基因表達調控1、基本概念基因表達（gene expression）：指基因轉錄、翻譯，產(chǎn)生具有特異生物學功能的蛋白質分子的過程。操縱子（operon）：原核生物基因表達和調控的一個完整單元，包括調節(jié)基因、啟動子、結構基因和操縱基因。順式作用元件（cis-acting elements）：調節(jié)基因表達的DNA序列。反式作用因子（trans-acting factors）：調節(jié)基因表達的蛋白質因子。衰減子（attenuator）：一段位于結構基因上游前導區(qū)具有終止子結構的短序列，通過前導序列轉錄產(chǎn)生的 mRNA 形成類似于終止子的二級結構，達到轉錄終止的目的。嚴謹反應（stringent response）：原核生物在氨基酸饑餓狀態(tài)下，自動停止或降低（10-20倍）rRNA， tRNA轉錄，從而調節(jié)蛋白質合成速率的嚴謹現(xiàn)象2、乳糖操縱子調控機制1）lac的結構2）lac的調控機制a、阻遏蛋白的負性調控：當大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中生存時，lac操縱元處于阻遏狀態(tài)。當有乳糖存在時，乳糖受-半乳糖苷酶的催化轉變?yōu)榘肴樘?，與阻遏蛋白結合，是阻遏蛋白構象變化，失去與操縱基因的親和力，與操縱基因解離，基因轉錄開放。b、CAP的正性調控：由于Plac是弱啟動子，單純因乳糖的存在發(fā)生去阻遏使lac操縱元轉錄開放，還不能使細菌很好利用乳糖，必須同時有CAP來加強轉錄活性，細菌才能合成足夠的酶來利用乳糖。lac操縱元的強誘導既需要有乳糖的存在又需要沒有葡萄糖可供利用。通過這機制，細菌是優(yōu)先利用環(huán)境中的葡萄糖，只有無葡萄糖而又有乳糖時，細菌才去充分利用乳糖。無乳糖時有乳糖時無葡萄糖cAMP濃度高Lac阻遏蛋白封閉轉錄時，CAP對該系統(tǒng)不發(fā)揮作用Lac阻遏蛋白不封閉轉錄，CAP+ cAMP加強轉錄。有葡萄糖cAMP濃度低Lac阻遏蛋白不封閉轉錄時，沒有CAP存在，也無高效轉錄活性。3、色氨酸操縱子（tryptohane operon，trp）調控機制trp操縱子屬阻遏型操縱子，主要調控一系列用于色氨酸合成代謝的酶的轉錄合成。 a、當色氨酸濃度高時Trp-tRNATrp存在核糖體通過片段1（2個Trp密碼子）封閉片段2片段3，4形成發(fā)夾結構類似于不依賴因子的轉錄終止序列RNA聚合酶停止轉錄，產(chǎn)生衰減子轉錄產(chǎn)物轉錄、翻譯偶聯(lián)，產(chǎn)生前導肽b、當色氨酸濃度低時Trp-tRNATrp 沒有供應核糖體翻譯停止在片段1（2個Trp密碼子）片段2，3形成發(fā)夾結構轉錄不終止RNA聚合酶繼續(xù)轉錄第九章 真核生物基因表達調控1、基本概念啟動子（promoter）：RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列。增強子（enhancer）：能使基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列。沉默子（Silencer）：某些基因含有負性調節(jié)元件沉默子，當其結合特異蛋白因子時，對基因轉錄起阻遏作用。鋅指結構（zinc finger，ZF）：一個蛋白質結構域，長約30個aa，其中4個氨基酸（4個Cys或2個Cys，2個His）與一個Zinc原子相結合，形成一個四面體結構。與Zinc結合后鋅指結構較穩(wěn)定。與DNA雙螺旋大溝結合。2、真核生物從哪些方面對基因的表達進行調控？1）DNA水平：基因丟失、基因擴增、基因重排、甲基化修飾、染色質的結構狀態(tài)2）RNA水平：轉錄水平調控【順式作用元件（cis-acting element）：包括啟動子、增強子和沉默子等；反式作用元件（trans-acting element）：激活因子、阻遏因子等】、RNA的轉錄后加工、mRNA轉運、mRNA穩(wěn)定性3）蛋白質水平：翻譯過程、翻譯后加工、蛋白質的穩(wěn)定性3、甲基化引起哪些生物學效應？（基因印記、親本印記）X染色體失活、親本印跡、腫瘤發(fā)生、個體發(fā)育 基因組印跡是兩個親本等位基因的差異性甲基化造成了一個親本等位基因的沉默，另一個親本等位基因保持單等位基因活性 腫瘤發(fā)生：抑癌基因甲基化不表達4、小RNA干擾調控 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指當細胞中導入與內源性mRNA同源的雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉錄后水平，又稱為轉錄后基因沉默。 RNA干擾的作用機制 長片段dsRNA在細胞內被Dicer酶切成長度大約為19-23nt的小片段干擾 RNA （small interfering RNA，siRNA），由siRNA參與構成復合物RISC（RNA-induced silence complex）。siRNA通過與同源mRNA的特異配對，引導RISC特異地降解同源mRNA，導致基因表達的抑制。因此小片段的siRNA也可以誘導高效的基因沉默。第十章 基因工程1、基因克隆（流程）上游：獲得目的基因、構造重組DNA分子、轉化或轉染下游：表達、蛋白質產(chǎn)物的分離純化2、受體細胞的選擇 限制性內切酶缺陷型防止降解 DNA重組缺陷型避免重組 遺傳互補型有利于篩選轉化親和型較高的可轉化性3、克隆基因的鑒定（藍白斑篩選）重組子的篩選與鑒定藍白篩選（互補的檢測）4、基因組文庫 基因組文庫（genomic library）：指整套由基因組DNA片段插入克隆載體獲得的克隆子總和。 特點：提供全套遺傳信息，即完整的基因組DNA，可以研究基因組中5端控制基因轉錄的調控序列，內含子的分布和作用，以及重復序列的數(shù)量分布及大小。 構建流程：抽提基因組DNA制備DNA片段DNA片段與載體重組轉化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法等）5、PCR 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）：利用DNA片段旁側兩個短的