臨床免疫學和免疫學檢驗總論

1 臨床免疫學與免疫學檢驗 2 第一章概論免疫學 Immunology 是研究免疫系統(tǒng)的結構與功能 并通過對其在免疫應答過程中所產生的免疫保護與免疫損傷機制的研究 探討有效的免疫措施 實現以防病 治病為目的的一門現代醫(yī)學學科 3 免疫學經驗時期 11 17世紀 中國醫(yī)生發(fā)明了用人痘苗預防天花將天花痂粉吹入正常人鼻孔來預防天花不十分可靠仍然有感染的危險 免疫學的形成與發(fā)展 4 經典免疫學時期 18世紀末到20世紀中葉 抗感染免疫英國醫(yī)生創(chuàng)造出牛痘苗接種法為人類戰(zhàn)勝了天花做出了貢獻1880年 法國微生物學家L Pasteur偶然發(fā)現接種陳舊的雞霍亂桿菌培養(yǎng)物可使雞免受毒性株的感染 成功地創(chuàng)制了炭疽桿菌減毒疫苗和狂犬病疫苗 并開始了免疫機制的研究 1883年 俄國動物學家發(fā)現了白細胞的吞噬作用并提出了細胞免疫學說 1890年 德國醫(yī)師和日本學者北里發(fā)現了白喉抗毒素 1894年比利時血清學家J Bordet發(fā)現了補體 5 1896年H Durham等人發(fā)現了凝集反應 1897年R Kraus發(fā)現了沉淀反應 1900年K Landsteiner發(fā)現了人類ABO血型 J Bordet發(fā)現了補體結合反應 1901年 免疫學 一詞首先出現在 IndexMedicus 中 1916年 JournalofImmunology 創(chuàng)刊 此后的幾十年中 血清學研究代表了免疫學發(fā)展的主流 6 近代免疫學時期 20世紀中葉 1945年R Owen發(fā)現同卵雙生的兩只小牛的不同血型可以互相耐受 1948年C Snell發(fā)現了組織相容性抗原 1953年R Billingham等人成功地進行了人工耐受試驗 1956年Witebsky等人建立了自身免疫病動物模型 這些免疫生物學現象迫使人們必須跳出抗感染的圈子 甚至站在醫(yī)學領域之外去看待免疫學 7 克隆選擇學說 cloneselectiontheory 于1958年由澳大利亞學者F Burnet提出 該學說認為 體內存在識別各種抗原的免疫細胞克隆 抗原通過細胞受體選擇相應的克隆并使之活化和增殖 變成抗體產生細胞和免疫記憶細胞 胚胎時期與抗原接觸的免疫細胞可被破壞或抑制 稱為禁忌細胞株 forbiddenclone 部分免疫細胞可因突變而與自身抗原起反應 這個理論雖不十分完善 但解釋了大部分免疫現象 為多數學者所接受并被后來的實驗所證明 可以說是一個劃時代的免疫學理論 8 現代免疫學時期 器官 細胞和分子水平1956年B Glick發(fā)現了腔上囊的作用1961年J Miller發(fā)現了胸腺的功能1966年H Claman等人區(qū)分出B細胞與T細胞 并且發(fā)現了它們的免疫協(xié)同作用 以后又相繼發(fā)現了T細胞中不同的亞群及其鑒定方法 1950年R Porter用蛋白酶水解獲得了抗體的片段 G Edelman用化學斷裂法得到了抗體的多肽鏈 共同證明了抗體的分子結構 1957年G K hler和C Milstein等人用B細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體 1978年S Tonegawa發(fā)現了免疫球蛋白的基因重排 80年代以來 眾多的細胞因子相繼被發(fā)現 9 基本概念 免疫 機體識別 自身 與 非己 抗原 對自身抗原形成天然免疫耐受 對 非己 抗原產生排異作用的一種生理功能 免疫功能 免疫系統(tǒng)在識別和清除 非己 抗原過程中所產生的各種生物學作用的總稱 主要包括三方面的內容 免疫防御 免疫自穩(wěn) 免疫監(jiān)視 10 免疫防御 immunologicaldefence 指機體排斥外源性異物的能力 免疫自穩(wěn) immunologicalhomeostasis 指機體識別和清除自身衰變殘損的組織細胞的能力 以維持正常內環(huán)境穩(wěn)定 免疫監(jiān)視 immunologicalsurveillance 指機體殺傷和清除異常突變細胞的能力 以監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內生長 免疫系統(tǒng)的三大生理功能 11 免疫應答反應 immuneresponse 是指機體免疫系統(tǒng)接受抗原刺激發(fā)生一系列反應 并以排出或分解該抗原為目的的反應過程 免疫應答的過程主要分為 識別階段 recognitionphase 活化階段 activationphase 效應階段 responsephase 抗原識別處理傳遞信息 免疫細胞活化增殖產生效應細胞 分子 執(zhí)行效應功能 12 免疫應答效應大多為生理性 是機體對外來抗原或自身變性抗原的清除效應 免疫應答反應過強時 可致機體組織或器官發(fā)生病理損傷 出現臨床疾病 如 自身免疫性疾病 超敏反應性疾病等 13 免疫系統(tǒng)功能的生理和病理表現 14 二 免疫組織與器官 免疫系統(tǒng) immunesystem 由免疫器官 免疫細胞和免疫分子構成 免疫器官按功能不同 分為中樞免疫器官和外周免疫器官 15 通過免疫網絡 免疫細胞能及時到達機體各臟器及皮膚粘膜的病原微生物入侵部位 又能將機體各部位的抗原成分經抗原遞呈細胞攜帶至相應淋巴組織及淋巴器官 活化T淋巴細胞與B淋巴細胞 執(zhí)行特異性免疫應答功能 單核細胞和淋巴細胞經血液循環(huán)及淋巴循環(huán) 進出于外周淋巴組織及淋巴器官 形成機體免疫系統(tǒng)的免疫網絡 16 一 中樞免疫器官 免疫細胞產生 分化和成熟的場所 骨髓 1 是造血干細胞生成 分化發(fā)育的場所 2 是功能性B細胞分化成熟的唯一場所 3 提供各種免疫細胞的前體細胞 T細胞分化成熟的場所胸腺 T細胞分化成熟的場所 二 外周免疫器官 免疫應答的場所 淋巴細胞定居和發(fā)揮功能的場所 淋巴結 脾臟 粘膜相關淋巴組織 17 淋巴結的功能 主要有以下3個方面 生成淋巴細胞 淋巴細胞可以在淋巴結內進一步分化 轉化和增殖 過濾淋巴液 由淋巴結內巨噬細胞的吞噬來完成 淋巴液中衰老的細胞及顆粒物質都可被吞噬 例如 人體吸入的塵埃顆粒 通過呼吸道進入支氣管淋巴結 被巨噬細胞吞噬 以致此淋巴結成為黑色 免疫作用 通過淋巴結內的各種細胞本身具有的殺傷作用及其產生的抗體 即免疫球蛋白 來防御 殺滅和消除體內的病原菌 腫瘤細胞等 18 三 淋巴細胞再循環(huán)與歸巢淋巴細胞通過淋巴循環(huán)和血液循環(huán)往返于全身器官組織 通過循環(huán)可增加與抗原接觸的機會 并將被抗原激活的淋巴細胞引流入局部淋巴組織及器官 完成防御 自穩(wěn) 監(jiān)視等免疫功能 19 外周免疫器官及外周淋巴組織既是淋巴細胞再循環(huán)的起點和中途站 也是淋巴細胞歸巢的終點 淋巴細胞在發(fā)揮免疫效應的同時 被歸巢受體引導回該類細胞的原定居處 進行修整 增殖和發(fā)育 以提高該類淋巴細胞的數量和功能 這是保證淋巴細胞功能健全的重要環(huán)節(jié) 20 三 免疫細胞 凡參與免疫應答或與免疫應答有關的細胞統(tǒng)稱為免疫細胞 按免疫細胞在體內的作用不同分為三大類 21 T細胞 Thymus dependentcell 淋巴細胞B細胞 Bonemarrowdependentcell NK細胞 NaturalKillercell 能增殖分化并產生免疫效應 淋巴細胞分類 22 單核細胞巨噬細胞 免疫輔助細胞 參與輔助淋巴細胞的活化 中性粒細胞嗜酸性粒細胞免疫應答細胞嗜堿性粒細胞肥大細胞 參與免疫應答中的某一環(huán)節(jié) 23 表1 1不同淋巴細胞及功能簡介 24 四 免疫分子 免疫分子是由一些免疫活性細胞或相關細胞分泌的蛋白質及小分子多肽物質組成 它們參與機體的免疫反應或免疫調節(jié) 25 免疫球蛋白 Immunoglobulin Ig 補體系統(tǒng) Complement C 細胞因子 Cytokine 細胞粘附分子 CellAdhesionMolecules CAM 白細胞分化抗原 ClusterDifferentiationantigen CD 主要的免疫分子 26 抗體和免疫球蛋白抗體 antibody Ab 由抗原刺激B細胞活化 增殖 分化成漿細胞而產生的能與相應抗原特異性結合的糖蛋白 主要存在于血清等體液中 是介導體液免疫的重要效應分子 免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白的統(tǒng)稱 27 抗體與免疫球蛋白的關系1 所有的抗體都是免疫球蛋白 2 免疫球蛋白并非都是抗體 免疫球蛋白是化學結構上的概念 抗體是生物學功能上的概念 28 免疫球蛋白的基本結構 四肽鏈分子 即由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的免疫球蛋白單體 呈 Y 形 29 重鏈和輕鏈 重鏈 heavychain H鏈 根據H鏈恒定區(qū)抗原性的差異可將其分為 五類 與L鏈組成完整的Ig分子 分別稱為IgM IgG IgA IgD和IgE 輕鏈 lightchain L鏈 分為 和 兩型 30 31 免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶水解片段胃蛋白酶水解片段 32 33 F ab 2片段的意義 既保留了結合雙價抗原的生物學活性 又避免了Fc段作為抗原的免疫原性和免疫結合性 用于治療時 可以避免或減輕可能引起的毒副作用 用于免疫檢測時 可以避免標本中抗抗體對檢測結果的干擾 34 第二節(jié)臨床免疫學 35 臨床免疫學 clinicalimmunology 是將免疫學基礎理論 臨床醫(yī)學疾病與免疫學技術相結合 用于研究疾病的免疫病理機制 診斷與鑒別診斷 評價治療效果和判斷愈后的多個分支學科的總稱 36 臨床免疫學發(fā)展的主要方向 是將基礎免疫學研究所取得的理論成果應用于臨床疾病的診治 探討新的免疫現象與臨床疾病的關系 37 免疫病理學 immunopathology 通過研究免疫細胞 炎性細胞 免疫分子 了解當這些細胞或分子的功能失衡或缺陷與導致自身免疫性疾病 免疫缺陷病 免疫增殖病之間的相互關系 探討免疫相關性疾病患者疾病發(fā)生發(fā)展過程中的免疫病理改變 對治療與預后評價有著重要的臨床意義 一 免疫病理與免疫性疾病 38 移植免疫學 transplantationimmunology 通過組織 細胞或器官移植 以替代機體喪失功能的組織器官或細胞 移植后保證移植物存活 不發(fā)生排斥反應的一門科學 二 移植免疫 39 腫瘤免疫學 tumorimmunology 是研究腫瘤相關抗原和腫瘤的免疫診斷 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫狀況 機體對腫瘤的免疫應答和抗腫瘤免疫效應機制的一門分支學科 三 腫瘤免疫 40 感染免疫學 infectionimmunology 是研究病原生物與宿主相互關系的學科 是傳統(tǒng)免疫學的基礎與核心 當前感染免疫研究的重點 掌握免疫系統(tǒng)在殺傷被病原體感染的宿主細胞時對宿主的損傷程度 免疫應答過程中激活或抑制的效應細胞當病原體被清除后所發(fā)揮的作用 固有性免疫與獲得性免疫間的相互調節(jié)關系 生物疫苗在免疫防御中的特點 四 感染免疫 41 第三節(jié)臨床免疫學與免疫檢驗 42 一 免疫學技術的發(fā)展 免疫學檢驗 laboratoryimmunology 是研究免疫學技術及其在醫(yī)學檢驗領域的重要學科 43 發(fā)展進程的主要階段 自然的肉眼觀察的抗原抗體反應 沉淀反應 凝集反應 加速的肉眼觀察的抗原抗體反應 電泳技術 分離技術 標記性免疫技術提高抗原抗體反應的特異性 敏感性半自動 自動化檢驗儀器與免疫反應原理結合 加快了反應過程標記技術 單克隆技術 高智能自動化技術的最佳組合 44 免疫檢驗可分為兩部分 一部分為利用免疫檢測原理與技術檢測免疫活性細胞 抗原 抗體 補體 細胞因子 細胞粘附分子等免疫相關物質 另一部分是利用免疫檢測原理與技術檢測體液中微量物質如激素 酶 血漿微量蛋白 血液藥物濃度 微量元素等 二 臨床免疫學與免疫檢驗 45 放射免疫技術化學發(fā)光免疫技術熒光免疫技術流式細胞免疫技術酶聯免疫技術免疫印跡技術速率散射免疫技術單克隆抗體技術 免疫檢驗涉及的主要技術 46 確定診斷分析病情調整治療方案判斷預后 提供有效實驗依據 臨床應用 47 丙型肝炎的免疫檢驗 1974年 紐約血液中心的工作人員發(fā)現除乙肝外 還有另一種因子能引起輸血后肝炎 當時稱為非甲非乙型 nonA nonB 肝炎 但顯微鏡下看不到病毒 分離培養(yǎng)不成功 常規(guī)制作EIA和RIA試劑 檢測均無結果 感染動物成功 能做理化性質測定 分子量 沉降系數 對酸堿環(huán)境的耐受能力等 48 用分子克隆的方法來甄別和鑒定病毒 建立特異性的免疫及基因檢測方法 用含病毒的血液感染黑猩猩 并對其進行免疫抑制 使感染加重 病毒滴度提高 從高滴度的病毒濃縮物中提取總RNA 采用隨機引物逆轉錄合成cDNA 插入載體中表達 用表達的蛋白作為抗原 與患者血清反應 對構建的cDNA文庫進行免疫學篩選 1989年得到第一個特異性的陽性克隆 逆轉錄PCR 擴增并克隆cDNA 完成了HCV全基因組序列克隆和序列測定 進行抗原表位的預測 合成多肽抗原進行免疫篩選 集中選擇特異性好 免疫原性高的表位 據此建立特異性的免疫和基因診斷 49 人類第一次在還沒有看到病毒 沒辦法分離 培養(yǎng)病毒 沒有免疫學方法確認病毒的情況下 利用分子生物學技術 克隆了丙肝病毒 并進行測序及表達病毒抗原 發(fā)展了特異性的診斷試劑 這一成就 開創(chuàng)了反向基因工程學第一個成功的范例 有著巨大的實用價值和應用前景 是分子生物學和醫(yī)學診斷學成功結合范例 50 HCV感染者血清中抗原含量極低 培養(yǎng)極為困難 HCV電鏡圖 51 學習要求 了解檢測原理 方法和影響因素 掌握常用檢驗的參考值和臨床意義 辯證地 全面的分析問題 注意實驗的局限性 52 第二章抗原抗體反應 53 抗原抗體反應 抗原和相應抗體間的特異性結合反應 既可發(fā)生在體內 也可發(fā)生在體外 體外發(fā)生的抗原抗體反應是我們開展免疫檢測的物質基礎 根據反應抗原的物理性狀和反應的條件不同 抗原抗體反應可有不同的現象 如沉淀 凝集 細胞溶解 補體結合 毒素中和等 這些現象就是我們免疫檢驗的檢測信號和判斷結果的依據 54 抗原抗體反應的原理結合的部位 抗原表位和抗體超變區(qū) 結合的條件 二者之間緊密接觸 結構互補 抗原抗體結合力的存在 靜電引力 范登華引力 氫鍵結合力 疏水作用力 55 靜電引力 electrostaticforces 范德華引力 作用最小 vanderWaalsinteractions 氫鍵 最具特異性 hydrogenbond 疏水作用力 作用最大 hydrophobicinteractions 抗原抗體結合力示意圖 一 抗原抗體結合力 56 抗原抗體的親和性和親和力親和性 affinity 抗體分子單一抗原結合部位 VH VL 與一個相應抗原決定簇之間互補而存在的引力 親和力 avidity 抗體結合部位與抗原表位之間結合的強度 與抗體結合價直接相關 親和性和親和力越高 抗原抗體結合速度越快 結合越牢固 57 親水膠體轉化為疏水膠體未結合的抗原 抗體為親水膠體 不會發(fā)生自然沉淀 結合后的抗原抗體復合物轉化為疏水膠體 可形成較大塊的沉淀物 可見反應 抗原抗體復合物 疏水膠體 電解質 抗原 親水膠體 抗體 親水膠體 表面電荷減少 水化層變薄 失去親水性能 58 第二節(jié)抗原抗體反應的特點 特異性可逆性比例性階段性 59 抗原抗體反應的特點1 特異性 抗原抗體結合的專一程度 由抗原表位和抗體超變區(qū)之間空間結構的互補吻合程度所決定 共同抗原與交叉反應不同抗原分子具有不同的表位 因此各具特異性 但有時相同或類似的表位也會出現在不同的抗原上 帶有相同或類似表位的抗原互稱共同抗原 commonantigen 由某一共同抗原誘導產生的抗體 也可以與其共同抗原結合 這種現象稱為交叉反應 在免疫檢驗中 交叉反應與檢測的特異性密切相關 是引起假陽性結果的最主要的原因 60 二 可逆性 可逆性 抗原與相應抗體結合成復合物后 在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性 抗原抗體復合物的形成是結合和解離同時進行的動態(tài)過程 影響因素 抗體對相應抗原的親合力 親合力越高 結合越牢固 越不易解離環(huán)境因素對復合物的影響 pH 離子強度 61 前帶 prezone 抗體過量后帶 postzone 抗原過量等價帶 equivalencezone 抗原抗體比例合適 抗原抗體反應比例性示意圖 比例性 抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比關系 抗原抗體比例適合時才能形成大塊的聚合物及肉眼可見反應 三 比例性 62 4 階段性第一階段 特異性結合階段 反應快 不可見 第二階段 反應可見階段 反應慢 出現凝集 沉淀和細胞溶解等現象 63 影響抗原抗體反應的因素 一 反應物自身因素1 抗原免疫反應性和特異性 免疫反應性好 結合速度快 結合牢固 特異性高 結合的專一程度也高 免疫反應性和特異性由抗原分子表位的性質和數目決定 理化因素 顆?？乖纬赡?可溶性抗原形成沉淀等 64 2 抗體 來源 1 多克隆抗體 來源于不同動物的多克隆抗體親和力 等價帶范圍等均有差異 對免疫檢測的準確性有直接影響 2單克隆抗體 只針對同一位點的均一抗體 不適合用于沉淀和凝集反應 濃度 合適的濃度才能出現可見的反應結果 特異性與親和力 決定抗原抗體結合的專一性 結合的速度和牢固程度 65 二 反應環(huán)境條件 電解質 促進抗原 抗體復合物由親水向疏水的轉換 生理鹽水或緩沖液酸堿度 抗原 抗體均是有生物活性的蛋白質 強酸強堿均能使蛋白質變性 降低抗原抗體的活性甚至使之失活 酸堿度 pH6 pH9溫度 在一定范圍內 提高溫度能加速抗原抗體反應 溫度 15 40 37 最適 66 免疫學檢測技術的類型沉淀反應 凝集反應 細胞溶解反應 中和反應 標記免疫的抗原抗體反應等 分類的目的是便于我們能在免疫檢測時識別免疫反應是否發(fā)生及發(fā)生的程度 來進行免疫檢測結果的判斷 67 衡量免疫檢驗水平的指標 靈敏度特異性準確度精確度線性可以了解該方法的最高檢測值和最低檢測值 可確定該方法的檢測范圍 以防止含量過低或過高樣品的檢測誤差 穩(wěn)定性簡易性安全性價格 68 第三章免疫原和抗血清的制備 69 免疫診斷試劑 用于檢測相應抗原 抗體或機體免疫狀態(tài)的試驗診斷制劑 免疫學檢測 用已知抗原檢測抗體 或用已知抗體檢測抗原 免疫試劑主要的生物原材料是抗原和抗體 70 天然抗體 未經明顯自然感染或人工免疫而在體內產生的血清抗體 如針對ABO紅細胞血型物質的抗體等 多屬IgM類 特異性抗體 抗原激發(fā)免疫細胞產生的抗體特異性抗體是免疫應答的重要產物 也是免疫檢測中的試劑 人工制備抗體 多克隆抗體 單克隆抗體 基因工程抗體 71 多克隆抗體 polyclonalantibody pAb 抗原表位刺激機體多個B細胞克隆 產生針對抗原分子上一種或多種表位的抗體的混合物 免疫原 完全抗原 既能刺激機體產生免疫應答 也能與免疫應答產物特異性結合 72 抗血清 含有針對特定抗原的多克隆定向抗體的動物血清 可來源于用免疫原免疫的動物血液 也可來源于病原微生物感染者的血液 多克隆抗體制備 1 免疫原免疫動物 2 抗血清的獲取及多克隆定向抗體的純化鑒定 73 第一節(jié)免疫原的制備 多克隆抗體的制備必須有高純度的免疫原 否則無法獲得特異 高效多克隆抗體 制備單克隆抗體對免疫原純度的要求相對低 除人工模擬抗原外 含天然抗原的物質多數成份復雜 需要提取 純化后方能作為免疫原應用 可作為免疫原的抗原 顆粒性抗原 細胞 細菌 寄生蟲可溶性抗原 蛋白質 糖蛋白 脂蛋白 核酸 74 一 顆粒性抗原的制備細菌 病毒 細胞 寄生蟲等 不同的顆?？乖兓椒ú煌?一般較為簡單 如生理鹽水洗滌 甲醛處理等 75 二 可溶性抗原的制備和純化 蛋白質 細菌毒素都是良好的可溶性抗原1 組織細胞抗原的制備 材料新鮮低溫保存 以防蛋白質變性 去除包膜 結締組織 大血管 清洗灌注 剪成小塊 粉碎 機械搗碎 研磨等 低溫離心取上清 76 2 培養(yǎng)細胞可溶性抗原的制備組織細胞或培養(yǎng)細胞可溶性抗原的制備 反復凍融法 20 凍結 然后室溫融化超聲破碎法 超聲波 1 20kHz 自溶法 自身酶系酶處理法 溶菌酶 纖維素酶 蝸牛酶表面活性劑處理法 SDS 去氧膽酸鈉 二乙基十六烷基溴 77 免疫球蛋白片段的制備 非共價鍵解離法 改變pH 利用強變性劑使肽鏈亞單位解離共價鍵解離法 氧化法和還原法 解離二硫鍵 使輕鏈和重鏈分開溴化氰裂解法 斷開肽鏈酶解法 木瓜酶 胃蛋白酶 78 超速離心法 差速離心法 低速和高速離心交替進行 分離大小差別較大的抗原密度梯度離心法 區(qū)帶離心法分離具有不同沉降速度的物質 二 可溶性抗原的純化 79 差速離心 低速離心和高速離心交替進行 逐步分級加大離心力 分步獲取沉淀系數不同的物質 兩種物質粒子的沉降系數相差一個數量級 10倍 以上 用差速離心反復多次可達到良好的分離效果 按轉速 普通 500 4000 高速 8000 25000 超速 25000 80000 超高速 150000rpm 蛋白質沉降系數在2 25之間 一般需要60000rpm以上才能分離 80 2 沉降平衡法 用于分離密度不同的物質 密度梯度離心 離心時離心管中的介質是不均一的 從近中心到遠中心密度不斷增加形成梯度 分離物在離心力作用下 各自停留在與其密度相同的區(qū)域 分層收集 達到分離效果 常用的梯度介質有蔗糖 甘油 氯化銫等 最大密度各不相同 選用介質要注意浮力密度范圍合適 被分離物質的密度不能大于介質的最大密度 81 選擇性沉淀法 核酸去除法 氯化錳 硫酸魚精蛋 鏈霉素 組織細胞提取的抗原含有大量核酸 可用氯化錳等沉淀劑去除 也可用DNA和RNA酶將其降解 鹽析法 硫酸銨 硫酸鈉有機溶劑沉淀法 乙醇 丙酮有機溶劑能破壞蛋白質的水化膜 暴露疏水性氨基酸殘基 增加蛋白質上不同電荷引力 引起使蛋白質沉淀 尤其在等電點的條件下 沉淀更快速更完全 聚合物沉淀法 聚乙二醇 82 四 凝膠過濾根據物質分子量大小進行分離 凝膠層析的支持介質由惰性的多孔顆粒組成 在層析過程中 被分離物質不僅隨洗脫液均勻向下運動 而且無定向在顆粒小孔中擴散 大分子不能進入顆粒 只能沿顆粒間的空隙隨洗脫液向下移動 較快到達底部并從柱中流出 小分子物質可以進入凝膠顆粒的孔隙內 在顆粒內及顆粒間擴散 從一個顆粒進入另一個顆粒 因此向下流動的速度慢 83 五 離子交換層析離子交換劑以一種惰性物質為支持物 通過化學反應共價引入帶電基團 可以靜電吸附離子 以靜電作用結合在離子交換劑上的離子稱為平衡離子 蛋白質分子在偏等電點的pH值時可以帶不同的電荷 因此可以置換離子交換劑上的平衡離子 和離子交換劑結合 不同蛋白質有不同的pI 在同一pH下 各種蛋白質所帶的電荷種類和數量不同 因此置換平衡離子的能力不同 利用這個原理 可以將帶有不同電荷的蛋白質分開 離子交換劑的支持物 樹脂 纖維素和葡聚糖凝膠 84 親和層析法 利用生物大分子之間具有的專一性親和力 1 親和層析支持物的選擇 非特異性吸附低 液體流速快 在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定 有合適豐富的化學基團 與蛋白質或其它化合物結合 有豐富的微孔 以增加結合容量 最常用的支持物是Separose4B 85 2 配體的選擇條件 配體指具有親和力的雙方 這里指抗原和抗體 抗原或抗體必須單一特異性 抗原與抗體必須具有較高的親和力 配體必須有一個適當的化學基團 86 3 抗原或抗體與支持物的結合 活化支持物的功能基團 溴化氰 接 手臂 抗原或抗體與支持物結合 87 4 親和層析條件的選擇 封閉活性基團 用無關蛋白質或三乙醇胺過柱 除去未結合和結合不牢的蛋白 先用NaHCO3洗脫 再用解脫劑處理 解脫劑 3mol L硫氰酸鉀 或鈉 0 1mol LpH2 4甘氨酸緩沖液 88 電泳法 利用分子量和電荷量不同進行分離 89 蛋白質種類繁多性質各異 可采用的純化方法也很多 無論何種方法 都是根據蛋白質以下幾種性質設計的分離方法 1 溶解度不同 2 分子大小不同 3 帶電荷的性質不同 4 物理吸附性不同 5 生物學親和性不同 90 蛋白質分離純化的策略 了解純化對象 明確純化目的 調查所具備的實驗條件 設計純化方案 91 三 純化抗原的鑒定 蛋白含量測定 紫外吸收法 雙縮脲法 酚試劑法分子量測定 SDS PAGE 凝膠過濾純度鑒定 醋酸纖維膜電泳 SDS PAGE 毛細管電泳 等電聚焦 高效液相層析免疫活性鑒定 雙向免疫擴散 免疫電泳 ELISA 92 三 半抗原性免疫原的制備 半抗原 hapten 僅有抗原性而無免疫原性的物質如多肽 甾體激素 核苷 某些藥物等 載體 carrier 賦予半抗原以免疫原性的物質 93 常用載體 蛋白質缺點 載體本身也是免疫原 其分子量遠遠大于半抗原 因此刺激機體產生的抗體大部分為抗載體的抗體 抗半抗原的載體效價和純度皆不理想 多肽聚合物 多抗原肽 MAP 常用多聚賴氨酸 多聚賴氨酸只起連結作用 本身沒有免疫原性 采用MAP作為免疫原 較易獲得高效價 高純度的抗多肽半抗原的抗血清 大分子聚合物常用羥甲基纖維素等 可與半抗原結合 加入弗氏佐劑可誘導動物產生良好的抗體 94 物理方法 通過電荷和微孔吸附半抗原吸附的載體有CMC PVP 硫酸葡聚糖等 二 半抗原與載體的連接方法 化學方法 利用某些功能基團將半抗原連接到載體上帶有游離氨基或羧基以及兩種基團都有的半抗原 碳二亞胺法戊二醛法混和酸酐法過碘酸氧化法不帶氨基和羧基的半抗原 用化學方法使其轉變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物 再與載體連接 95 三 半抗原性免疫原的鑒定 一個載體分子至少要連接20個以上的半抗原分子 才能刺激產生抗體 測定半抗原與載體比例的方法 1 吸收光譜分析法2 放射性核素標記半抗原滲入法 96 第二節(jié)免疫佐劑 免疫佐劑 immunoadjuvant 預先或與抗原同時注入體內 可增強機體對該抗原的免疫應答或改變免疫應答的類型的物質稱為免疫佐劑 簡稱佐劑 adjuvant 97 第二節(jié)免疫佐劑 一 佐劑的種類化合物 氫氧化鋁 明礬 礦物油 吐溫 80 弗氏不完全佐劑等生物制劑 如卡介苗 短小棒狀桿菌 百日咳桿菌細胞因子等 用于人體的佐劑 氫氧化鋁 明礬 polyI C 胞壁酰二肽 細胞因子 熱休克蛋白常用于動物實驗的佐劑 弗氏佐劑 Freund sadjuvant 98 二 佐劑的生物學作用增強免疫原性 使免疫原性弱的物質變?yōu)閺娒庖咴?增加抗體的滴度 包括初次和再次免疫應答的抗體滴度 改變抗體類型 可由產生IgM轉變?yōu)镮gG 或由IgG轉變?yōu)镮gE等其它類型抗體 99 三 佐劑增強免疫應答的機制1 改變抗原物理形狀 使抗原在體內滯留或緩慢釋放 延長抗原與免疫細胞作用的時間 增強抗原免疫原性 2 抗原經佐劑作用后 易被巨噬細胞吞噬 加工處理 3 刺激單核 巨噬細胞活化 釋放細胞因子 4 刺激淋巴細胞增生分化 100 第三節(jié)抗血清的制備 抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動物 該動物在含有多種抗原表位的抗原刺激下 體內多個B細胞克隆被激活并產生針對某一抗原多種不同表位的抗體 其混合物為多克隆抗體目的 獲取高質量的多克隆特異性抗體 需要高質量的免疫原 合適的動物和有效的免疫方案 101 抗原來源與動物種屬的關系種屬差異越遠 免疫原性越強動物個體的選擇適齡 健康 體重符合要求抗原的性質不同性質的免疫原 適用的動物有所不同 一 免疫動物的選擇 102 二 免疫方法和途徑抗原劑量 在一定范圍內 抗原量與免疫強度成正相關 抗原量過大或過小均易產生免疫耐受 注射途徑 抗原的進入途徑決定了抗原吸收 分布和代謝的速度 常用的注射途徑及對抗原的吸收速度 靜脈 脾臟 淋巴結 腹腔 肌肉 皮下 皮內 103 免疫間隔時間 根據免疫原的強弱 代謝情況等決定 一般情況下 第一次加強免疫應在基礎免疫后的2 3周 以后每7 10天加強一次 加強免疫的次數 應檢測血清中的抗體滴度 決定加強免疫的次數 104 免疫動物血清中的抗體滴度合格后即可放血 頸動脈采血法 家兔 綿羊 山羊心臟采血法 家兔 豚鼠 大鼠 雞靜脈采血法 家兔 山羊 綿羊血液自然凝固后離心 采集血清 三 動物采血法 105 抗體特異性的鑒定 雙向免疫擴散法抗體效價的鑒定 凝集試驗 雙向免疫擴散試驗 ELISA抗體純度的鑒定 SDS PAGE 雙向免疫擴散試驗 免疫電泳抗體親合力的鑒定 平衡透析法 ELISA RIA競爭結合試驗 一 抗血清的鑒定 106 第四節(jié)抗血清的鑒定和保存 一 抗血清的鑒定鑒定的目的 確定有無目的抗體的存在 含量高低 親和力如何 主要鑒定指標 效價 特異性 抗體純度 抗體親合力等 鑒定方法 單擴 雙擴 ELISA等 二 抗血清的保存2 8 保存 短期保存冰凍保存 保存5年真空干燥保存 保存5 10年反復凍溶會嚴重影響抗體的活性 107 第五節(jié)抗血清的純化抗原免疫動物制備的抗血清是成分復雜的混合物 除含有特異性抗體外 還存在與目的抗體不相關的成分 純化目的是除去這些不相關成分 防止抗血清中其他雜質干擾試驗結果 108 鹽析法 硫酸銨鹽析法 硫酸鈉鹽析法凝膠過濾法 常結合鹽析法離子交換層析法 DEAE纖維素 QAE sephadex QAE纖維素親和層析法 純化抗原或SPA交聯Sepharose4B制成親和層析柱 一 特異性IgG抗體 109 單價特異性是指血清只與其特異性抗原發(fā)生反應 親和層析法 雜抗原交聯Sepharose4B柱吸附劑方法 借助雙功能試劑用不含特異抗原的抗原混合液制成固相吸附劑 吸附抗血清中的雜抗體 二 單價特異性抗血清 110 第四章 單克隆抗體和基因工程抗體的制備 111 1975年Kohler和Milstein成功地將綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合 制備出小鼠抗綿羊紅細胞的單克隆抗體 單克隆抗體在醫(yī)學生物學的各個領域有著廣泛的用途 免疫檢驗由于單克隆抗體的出現 取得了巨大的進展 112 單克隆抗體 monoclonalantibody McAb 借助B細胞雜交瘤技術 由單個B細胞增殖而成的細胞克隆所產生的 高度均一的 單一特異性的抗體 單克隆抗體的特點 結構均一 純度高 特異性強 效價高 交叉反應少或無 易于制備 113 單克隆抗體制備的基本原理致敏的B淋巴細胞能分泌特異性抗體 但不能在體外長期存活 骨髓瘤細胞可以在體外大量繁殖 但不能分泌特異性抗體 將小鼠的骨髓瘤細胞和能分泌抗體的B淋巴細胞融合 則融合的雜交瘤細胞既具有腫瘤細胞易繁殖的特性 又具有B淋巴細胞分泌抗體的能力 由于每個致敏的B淋巴細胞只針對單一的抗原表位產生抗體 所以克隆化的雜交瘤細胞能夠分泌針對單一表位的單克隆抗體 114 一 B淋巴細胞雜交瘤技術 一 細胞的選擇和融合制備B淋巴細胞雜交瘤的目的是生產特異性的單克隆抗體 融合細胞的一方必須是能產生抗體的B淋巴細胞 通常來源于免疫小鼠的脾細胞 融合細胞的另一方是為了保持細胞的不斷增殖 只有腫瘤細胞才有這種特性 同時這種細胞本身不分泌免疫球蛋白 選擇同一體系的細胞能增強融合的成功率 骨髓瘤是B淋巴細胞系的惡性腫瘤 是脾細胞最理想的融合對象 細胞融合的方法多采用化學試劑助融 最常用的細胞融合劑為PEG 115 二 選擇培養(yǎng)基的應用在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合液中 細胞融合是隨機的 可能出現的細胞形式 融合的脾細胞和瘤細胞 融合的瘤細胞和瘤細胞 融合的脾細胞和脾細胞 未融合的脾細胞 未融合的瘤細胞 細胞的多聚體 融合及未融合的脾細胞體外不能長期存活 細胞的多聚體也容易死亡 融合和未融合的瘤細胞則需篩選去除 116 選擇性培養(yǎng)基 只有雜交瘤細胞才能生長 HAT選擇性培養(yǎng)基的原理 骨髓瘤細胞為HGPRT缺陷株 或TK缺陷株 HGPRT和TK是細胞合成DNA和RNA旁路途徑上兩種重要的酶 如果缺乏其中任何一種 在正常合成途徑受阻的情況下 細胞將不能利用旁路途徑而死亡 HAT的A為氨甲喋呤 是一種正常途徑的阻斷劑 H和T分別為次黃嘌呤和胸腺嘧啶 它們分別是HGPRT和TK的底物 具備HGPRT和TK的細胞在正常途徑受阻時 可利用H和T依靠旁路途徑合成DNA和RNA繼續(xù)生存 在雜交瘤的制備中 致敏的B淋巴細胞含有HGPRT和TK 可彌補骨髓瘤細胞缺陷 因此只有雜交的細胞能在HAT選擇性培養(yǎng)基中長期存活 其余未雜交的細胞都將死亡 117 流程 一 雜交瘤技術 118 三 有限稀釋與抗原特異性選擇克隆化 一種抗原有多個表位 一個B細胞只分泌針對一個表位的抗體 一個動物在受到抗原刺激后的體液免疫應答 是眾多B細胞克隆針對不同表位的抗體分泌 針對目的抗原表位的B細胞只是少數 所以并非所有的雜交細胞都能分泌針對目的表位的特異性抗體 需要進行用單細胞分離培養(yǎng)的方法進行篩選 119 篩選過程 融合細胞的克隆化 將融合細胞充分稀釋 使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細胞數理論上為一個 細胞培養(yǎng)至覆蓋10 20 孔底時 吸取培養(yǎng)上清檢測抗體分泌情況 篩選出高抗體分泌孔 將高抗體分泌孔中的細胞再克隆化 ELISA再次鑒定 選出高分泌特異性細胞株擴大培養(yǎng)或凍存 120 防止污染避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡 細胞冷凍的意義 121 配制方案 雜交瘤細胞 1 5 x106 ml 細胞凍存液 30 40 牛血清 50 60 RPMI 1640培養(yǎng)液 10 DMSO 慢凍 分步冷凍 30 70 液氮 快融 取出立即浸入37 40 水浴中 使其迅速融化 復蘇 雜交瘤細胞的凍存與復蘇 122 三 陽性雜交細胞的克隆化培養(yǎng) 雜交瘤形成的初期很不穩(wěn)定 在最初幾天染色體容易丟失 雜交瘤細胞丟失了目的抗體表達的基因 仍能生長繁殖 必須將陽性雜交瘤細胞進行多次的單細胞分離培養(yǎng) 以確保單克隆抗體的純一性 避免陰性細胞對其生長的影響 123 第二節(jié)單克隆抗體的制備技術 大量制備單克隆抗體的方法有兩類 動物體內誘生法 1 腹水型McAb的制備 接種雜交瘤細胞至小鼠腹腔 待小鼠腹部明顯膨大到一定程度時 抽取腹水 離心取上清 2 血清型McAb的制備 將對數生長期的雜交瘤細胞于小鼠背部皮下多點注射 待腫瘤到達一定大小后采血分離血清 體外培養(yǎng)法 體外培養(yǎng)雜交瘤細胞分泌McAb 收集離心培養(yǎng)上清 124 二 單克隆抗體的純化無論是腹水還是培養(yǎng)上清 均含有脂蛋白 脂質 細胞碎片等雜質 通常采用過濾的方法去除脂質和大顆粒 用離心的方法去除細胞碎片和大的蛋白聚合物 初步處理后 再按要求采用合理的純化步驟 親和層析 125 Ig類型 亞類測定 雙擴法或ELISA法特異性測定 抗原類似物的交叉反應效價測定 用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示表位測定 幾株單抗是否為不同表位特異的 用競爭抑制法 相加指數法及微機集群分析親和性測定 測定親和常數K雜交瘤細胞染色體 秋水仙素裂解法 小鼠B細胞染色體40條 SP2 0細胞68條 雜交瘤細胞一般100多條McAb靶抗原分子量 常用westernblot 三 單克隆抗體的性質鑒定 126 單克隆抗體的特性 高度特異性高度的均一性弱凝集反應和不呈現沉淀反應對環(huán)境敏感性 單克隆抗體的特性 127 優(yōu)點 在體外 永久 地存活并傳代用相對不純的抗原 獲得大量高度特異的 均一的抗體 適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療 二 單克隆抗體的優(yōu)點與局限性 局限性 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應強度不如多克隆抗體制備技術復雜 費時費工 價格較高 128 第三節(jié)基因工程抗體技術 根據研究者的意圖 采用基因工程方法 在基因水平 對免疫球蛋白基因進行切割 拼接或修飾后導入受體細胞進行表達 產生新型抗體 主要包括嵌合抗體 單鏈抗體 人源化抗體 雙價抗體和雙特異性抗體 129 一 人源化抗體鼠源單克隆抗體的編碼基因經DNA重組改造 其部份氨基酸序列為人源序列所代替 保留原來鼠單抗的特異性和親和力 最大限度地降低鼠單抗的異源性 從而有利于診斷和治療 130 方法 從雜交瘤細胞分離出功能性可變區(qū)基因 與人Ig恒定區(qū)基因連接 插入適當表達載體 轉染宿主細胞 表達人 鼠嵌合抗體特點 減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結合抗原的能力 一 嵌合抗體 131 嵌合抗體 1