實驗七、兔腎原代細胞的分離與培養(yǎng)ppt課件.ppt

兔腎原代細胞的分離與培養(yǎng) 岳續(xù)朋2013 12 27 如何獲得體外培養(yǎng)的細胞 肺癌A549 結腸癌colo320 人腎上皮細胞293T 肝癌HepG2 原代培養(yǎng)是從供體取得細胞 組織或器官后在體外進行首次培養(yǎng)直至成功地進行首次傳代之前的培養(yǎng) 因此 較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng) 此時的細胞保持原有細胞的基本性質 如果是正常細胞 仍然保留二倍體數(shù) 但實際上 通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞 材料與方法 實驗動物出生3天的家兔 SPF級 雌雄不限儀器超凈工作臺 恒溫培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 水浴槽 離心機 酒精燈 解剖剪 眼科剪 鑷子 尖頭 平頭和有鉤鑷 不銹鋼濾網(wǎng) 100目 200目 燒杯 培養(yǎng)皿 培養(yǎng)瓶 離心管 吸管 試劑 75 乙醇PBS緩沖液 pH7 2 D HanKs液 無鈣鎂離子 消化液 0 5 胰蛋白酶 0 02 EDTA1 1混合 0 4 臺酚藍RPMI 1640培養(yǎng)基 酚紅指示劑 原代培養(yǎng)方法流程圖 組織塊培養(yǎng)法 消化培養(yǎng)法 處死 取材 接種 培養(yǎng) 剪切清洗 消化 計數(shù) 培養(yǎng) 處死 取材 剪切清洗 組織塊培養(yǎng)法 動物處死取新生的家兔 出生2 3天 一只 用頸椎脫臼將其處死 浸入盛有75 乙醇的燒杯中5 10秒鐘 然后取出放在解剖平皿中送入超凈工作臺 取材用碘酒和75 的乙醇再次消毒一次 打開消毒器械包 用鑷子扯開腹部皮膚 用解剖剪剪開腹腔 暴露腹腔臟器 用另一個鑷子夾起腸管翻向一側 暴露出位于腹腔背側脊柱兩側的腎臟 左高右低 將其取下 放于消毒的培養(yǎng)皿中 組織塊培養(yǎng)法 剪切剪開腎膜 剝向腎門 去除腎膜 用吸管吸取滅菌PBS HnaKs液 將腎臟清洗3次 去除血污 將腎臟移入另一平皿中 將腎沿縱軸切開 減去腎盂 用眼科剪將腎組織反復剪切 直至0 5 1mm3組織塊 清洗剪切后的組織塊再用滅菌的PBS HanKs液 沖洗數(shù)次 直到PBS澄清為止 組織塊培養(yǎng)法 接種用彎頭吸管小心吸取組織塊 將其均勻分布在培養(yǎng)瓶底部 控制組織塊間距在0 5cm左右 每個25ml培養(yǎng)瓶可排布15 20塊 輕輕翻轉培養(yǎng)瓶 使瓶底向上 注意不要讓組織塊滑動 加入3 5ml培養(yǎng)基 蓋好瓶蓋 置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 3小時 此時組織塊略干燥 能夠附著于瓶底部 培養(yǎng)慢慢翻轉培養(yǎng)瓶 使培養(yǎng)基浸泡附著于瓶底的組織塊 置培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 操作過程動作要輕柔 觀察24小時后取出觀察 在顯微鏡下觀察已貼壁的組織塊有無細胞長出 組織塊去除組織塊貼壁培養(yǎng)4 7d后 在鏡下觀察可見大量細胞爬出 用吸管將組織塊吹下 去除 繼續(xù)放置于37 5 CO2培養(yǎng)箱中 消化培養(yǎng)法 處死動物 取材 剪切以及組織塊的清洗都與組織塊培養(yǎng)法相同 將組織塊移入無菌的離心管中 靜置數(shù)分鐘 使組織塊自然沉降到管底 棄上清 消化及分散組織塊向盛有組織塊的離心管中加入含EDTA的0 25 的胰蛋白酶 體積約為組織塊體積的5 8倍 與組織塊混勻后 置于37 的水浴槽中消化10 20分鐘 其間每隔5分鐘搖動一次 當組織塊變得疏松 顏色發(fā)白時 從水浴槽中取出離心管 加入2 3ml培養(yǎng)基 終止消化 用吸管反復吹打 直到大部分組織塊分散成單細胞或細胞團狀態(tài)為止 1000rpm離心5分鐘 棄去上清 再加入新鮮的培養(yǎng)基 將此細胞懸液用100目 200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾至燒杯中 消化培養(yǎng)法 細胞活性檢測取9滴細胞懸液滴入另一清潔試管 加0 4 臺酚藍1滴染色2 3min 鏡下觀察 以細胞核拒染作為活性良好的細胞 拒染率 95 細胞計數(shù)及稀釋對過濾的細胞懸液進行計數(shù) 根據(jù)計數(shù)結果 用培養(yǎng)基稀釋 稀釋密度以5x105 1x106 ml為宜 接種培養(yǎng)將稀釋好的細胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中 25ml培養(yǎng)瓶分裝5ml為宜 瓶上標記時間 細胞名稱以及培養(yǎng)基種類 置于37 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 消化培養(yǎng)法 觀察接種培養(yǎng)后要每天觀察培養(yǎng)基是否污染 染色變化以及細胞生長狀況 培養(yǎng)基呈黃色且渾濁表示已污染 紫紅色表示細胞生長不良 桔紅色表明細胞生長狀態(tài)良好 污染 良好 生長不良 注意事項 無菌操作培養(yǎng)瓶 吸管在清洗干凈之后 裝在鋁盒和鐵筒中 120 2小時干烤滅菌備用 手術器材 瓶子瓶塞 配好的緩沖液高壓鍋121 20mi