（分析化學專業(yè)論文）動力學液相色譜法.pdf

中文摘要 隨著生命科學的發(fā)展，眾多復雜生物樣品的分析、分離與純化為現(xiàn)代分離科學提出 了許多熱點研究課題。色譜分離技術(shù)仍然是生物工程下游技術(shù)中的核心步驟，如何盡可 能獲得良好分離效果是分離科學工作者追求的的個重要目標之一。近年來出現(xiàn)了一類 全新的色譜分離方法，其分離機理與傳統(tǒng)的基于熱力學理論的分離模式不同，溶質(zhì)在動 力學因素，如流動相流速、填料顆粒的型狀、大小的影響下具有不同的色譜保留特性， 利用動力學因素對溶質(zhì)進行分離，我們將其稱之為動力學色譜法。已有的工作多集中在 理論研究，實際應(yīng)用多限于分離一些標準小分子和d n a 分子片段，因此該方法有待進 一步發(fā)展和開拓其用途。本文以反相液相色譜( r p l c ) 為載體，研究了溶質(zhì)的動力學 色譜規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了溶質(zhì)普遍遵循的動力學方程式，提出了兩個描述溶質(zhì)動力學色譜行為 的動力學參數(shù)，并將其用于實際樣品分離。 論文包括以下六個部分： 1 文獻綜述：簡單地討論了色譜動力學的發(fā)展、基礎(chǔ)理論和主要內(nèi)容，包括塔板理論、 速率理論、非平衡理論和質(zhì)量平衡理論四部分。闡述了動力學色譜和色譜動力學的 主要區(qū)別。重點綜述了兩種動力學色譜，即流體動力色譜和障礙色譜的分離原理、 模型、儀器、應(yīng)用和二者之間的異同點及聯(lián)系。共引用文獻7 5 篇。 2 以細胞色素c 肽譜為研究對象，初步研究了反相液相色譜中動力學因素對其分離效 果的影響。重點討論了流動相流速對分離度、峰容量和溶質(zhì)洗脫順序的影響。同時 研究了溶質(zhì)分子量與溶質(zhì)相對保留值之間的關(guān)系、發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)相對保留值與流速之間 存在雙對數(shù)的線性關(guān)系l o g ( r r t ) = a + 6l o g ( d ) 以及溶質(zhì)分子量與方程式中二經(jīng)驗常 數(shù)口值和6 值之間的關(guān)系，并將該雙對數(shù)的線性關(guān)系方程式與s d t 里的兩組線性方 程式進行了比較。 3 探討了小分子、多肽和大分子蛋白質(zhì)在反相液相色譜中的動力學色譜行為。提出了 溶質(zhì)普遍遵循的動力學色譜方程式，即l o g ( r r t ) = a + 6l o g ( v ) 。詳細地探討了該動力 學色譜方程式中的兩參數(shù)a 、6 。在分離中的的意義，即參數(shù)a 的意義定義為在流動相 流速為1 o m l m i n 時溶質(zhì)的相對保留值的對數(shù)值，6 值用來描述溶質(zhì)相對保留值隨流 速變化的趨勢大小。由于口、6 均是在動力學因素流速變化的條件下描述溶質(zhì)保留情 況的，因此，a 、6 是兩個與熱力學無關(guān)的動力學色譜參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)的相對保 留值與分量之間無特定關(guān)系，也不符合s c 或t - i d c 機理。a 、b 之間具有一定的線 性關(guān)系，但其相關(guān)系數(shù)不是很好。 4 r p l c 中溶質(zhì)相對保留值和流動相流速之間存在雙對數(shù)線性關(guān)系，本章以l y s 中4 種較難分離的組分為研究目標，根據(jù)動力學色譜方程式中的兩參數(shù)a 、b 的意義，對 該4 種組分的分離進行了動力學流速條件的優(yōu)化。由動力學色譜參數(shù)a ，b 值推測了 溶質(zhì)在不同流速時色譜圖中的分離情況，驗證了動力學參數(shù)a ，b 值所代表意義的合 理性，并預測了分離的最佳流速。 5 溶質(zhì)在r p l c 中滿足動力學色譜方程式l o g ( r r t ) = a + bl o g ( u ) ，實驗證實小分子的 動力學參數(shù)b 值普遍地小于大分子蛋白質(zhì)的b 值，因此流動相流速對小分子相對保 留值的影響趨勢大于大分子蛋白，小分子在色譜柱中比大分子蛋白遷移速度的快。 本章?lián)颂岢隽藘煞N分離復雜樣品的動力學色譜策略，即：a ：在流速增大到一定程 度時，小分子組分會和大分子組分在進行梯度洗脫時會快速分成兩大部分，簡化了 分離程序。b 小分子洗脫濃度是一個范圍，而蛋白質(zhì)大分子洗脫濃度很窄，可以認 為是一個點，洗脫復雜樣品時，可以先進行一個適宜濃度的等度洗脫小分子，然后 進行梯度洗脫大分子。采用上述兩種動力學色譜策略對蟾蜍卵子細胞組分進行了快 速分離純化，并對高豐度多肽組分進行了去除，同時富集了低豐度蛋白組分。預計 該動力學色譜策略將為蛋白質(zhì)組學從復雜樣品中將高豐度組分去除同時檢測低豐度 組分的提出了一個新的實用方法。 6 利用動力學色譜方程式兩個動力學色譜參數(shù)a 、b 在不同熱力學條件下的相對穩(wěn)定性 提出了動力學色譜指紋圖譜的初步構(gòu)建。 關(guān)鍵詞：動力學液相色譜法，高效液相色譜，肽譜，動力學指紋圖譜，動力學色譜參數(shù) a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n ti nl i f es c i e n c e ，al a r g e rn u m b e ro fh o tr e s e a r c h i n gt o p i c sf o r m o d e r ns e p a r a t i o ns c i e n c eh a v e b e e nr e p o r t e d c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nt e c h n o l o g yi ss t i l l t h ek e yp r o c e s so fd o w n s t r e a mb i o t e c h n o l o g y h o wt oo b t a i nt h eb e s tl cr e s o l u t i o nh a sb e e n a l l i m p o r t a n ti n v e s t i g a t e dh o tp o i n t i nr e c e n ty e a r s , an o v e lc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n m e t h o db a s i n go nh y d r o d y 7 n a m i cf a c t o r s ，s u c ha sm o b i l ef l o wr a t e ，t h es h a p ea n ds i z eo f p a c k i n gb e i n gd i f f e r e n tf r o mt h et r a d i t i o n a le q u i l i b r i u mt h e r m o d y n a m i c sw a se x p l o r e d a p a r t i c u l a rf e a t u r eo ft h i sc h r o m a t o g r a p h yi sf i r s t l yn a m e da sd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y m a n y c o r r e l a t i v ep u b l i c a t i o n sh a v e b e e nc o n c e n t r a t e di nt h e o r e t i c a lr e s e a r c h , t h e p r a c t i c a l a p p l i c a t i o n sa r eo f t e nl i m i t e dt ot h es e p a r a t i o no fs o m es t a n d a r ds m a l lm o l e c u l e sa n dd n a m o l e c u l a rf r a g m e n t s , s om o r ej o b ss h o u l db en e e dt op r o m o t ei t sf u r t h e rd e v e l o p m e n ta n d e x p a n di t sa p p l i c a t i o n i nt h i sp a p e r , t h er u l eo fs o l u t er e t e n t i o nb yd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y i nr e v e r s ep h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) h a sb e e ns t u d i e d a ne q u a t i o nt h a ti so b e y e d u n i v e r s a l l yb y s o l u t e si sf o u n da n dt w op a r a m e t e r su s e dt od e s c r i b et h e d y n a m i c c h r o m a t o g r a p h yb e h a v i o ra r ef i r s t l yp r o p o s e d i nt h ee n d ，t h em e t h o di su s e df o rt h e s e p a r a t i o no ft h ea c t u a ls a m p l e s p a p e r si n c l u d et h ef o l l o w i n gs i xp a r t s ： 1 l i t e r a t u r er e v i e w ：ab r i e fd i s c u s s i o na b o u tt h ed e v e l o p m e n t ，b a s i ct h e o r ya n dt h em a i n c o n t e n t so fc h r o m a t o g r a p h i cd y n a m i c si si n t r o d u c e d i ti n c l u d e st h ep l a t et h e o r y , r a t et h e o r y , n o n e q u i l i b r i u mt h e o r y a n dm a s sb a l a n c et h e o r y t h em a i nd i f f e r e n c eb e t w e e n c h r o m a t o g r a p h i cd y n a m i c sa n dd y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y i s e x p l a i n e d t w od y n a m i c c h r o m a t o g r a p h i e s ，h y d r o d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y ( s d c ) a n ds l a l o mc h r o m a t o g r a p h y ( s c ) w e r ei n t r o d u c e da n dr e v i e w e di nt h i sp a p e r , m a i n l yf o rt h er e c e n td e v e l o p m e n to fs e p a r a t i o n p r i n c i p l e ，t h e o r e t i c a lm o d e l ，a p p l i c a t i o n sa n d 7 5r e f e r e n c e sa r ec i t e d 2 b yt a k i n gt h ep e p t i d em a p p i n go fc y t o c h r o m e - ca sa ne x a m p l e ，t h ee f f e c to fd y n a m i c f a c t o r si nr p l ci si n v e s t i g a t e d i ti sm a i n l yf o rt h ee f f e c to nt h er e s o l u t i o n ，p e a kc a p a c i t ya n d s o l u t ee l u t i o no r d e rt os t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ea n d r e t e n t i o n s ，w ef o u n dt h el o g a r i t h mo ft h er e l a t i v er e t e n t i o nt i m e ( r r t ) o fp e p t i d e st ob e t t t p r o p o r t i o n a lt ot h el o g a r i t h mo f t h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s e 加) ，巴 l o g ( r r t ) = a + bl o g ( u ) ( 1 ) t h e t w ol i n e a rp a r a m e t e r sw e r ea l s of o u n dt oo b e yt h ee q u a t i o n ： 口= c + db w h e r e ，釓ba r ee m p i r i c a lc o n s t a n t s ( 2 ) t h es i m i l a r i t i e sa n dd i f f e r e n c e so fl o g l o gl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h et w ol i n e a re q u a t i o n s i ns t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r y ( s d t ) a r ea l s oc o m p a r e d 3 t h ed y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o ro fs m a l ls o l u t e s ，p e p t i d e sa n dt h ep r o t e i n si n r p l ci sa l s os t u d i e d t h ee q ( 1 ) i sa l s ot e s t e da n df o u n di tt ob eu n i v e r s a la n dd i s c u s s e di n d e t a i l b o t h 口ba g et h et w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i sp a r a m e t e r st h a th a v en o ta n y t h e r m o d y n a m i c sm e a n i n g as p e c i f i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em o l e c u l a rm a s so fp e p t i d e s a n dr e t e n t i o nv a l u e si sn o tf o u n da n dt h es o l u t ee l u t i o no r d e rd o e sn o to b e yt h em e c h a n i s mo f s co rh d c b o t haa n dbh a v eal i t t l el i n e a rr e l a t i o n s h i p ，b u tt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ti sn o t v e r yg o o d 4 i nt h i sc h a p t e r , t h eo p t i m i z a t i o nf l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ef o rt h es e p a r a t i o no ff o u r c o m p o n e n t so fl y sp e p t i d em a p p i n gi si n v e s t i g a t e da n df o u n dt h a ti ti sd i f f i c u l tt os e p a r a t e u s i n gc o m m o nm e t h o d h o w e v e r , t h es e p a r a t i o no fs o l u t e sa td i f f e r e n tf l o wr a t e so fm o b i l e p h a s ei sp r e d i c t e df r o mt h et w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cp a r a m e t e r s ，aa n db t h e o p t i m i z a t i o nf l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ew a sa l s op r e d i c t e da n di tv e r i f yt h em e a n i n ga b o u ta ， bi ns e p a r a t i o n 5 t h ee x p e r i m e n tc o n f i r m e dt h a tt h ebv a l u eo fi sg e n e r a ls m a l l e rt h a nt h a to fp r o t e i n m a c r o m o l e c u l e s t h e r e f o r e ，t h es m a l lm o l e c u l e s r r tc h a n g ei sg r e a t e rt h a nt h a to f m a c r o m o l e c u l a rp r o t e i n sa st h ef l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ec h a n g e d t h em o v ev e l o c i t yo f s m a l lm o l e c u l e si sg r e a t e rt h a nt h a to fm a c r o m o l e c u l a rp r o t e i n si nc o l u m n a c c o r d i n gt ot h i s p r i n c i p l e ，t w od y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g i e sf o rt h es e p a r a t i o no fc o m p l e xs a m p l e sa r e p r e s e n t e d t h eo n ei st h a tt h ec o m p l e xs a m p l e sw i l lb eq u i c k l yd i v i d e di n t ot w om a j o r c o m p o n e n t s ，t h es m a l lm o l e c u l e sg r o u pa n dt h em a c r o m o l e c u l e sg r o u p ，w h e nt h ef l o wr a t eo f m o b i l ep h a s ei si n c r e a s eu pt oac e r t a i nv a l u ed u r i n gg r a d i e n te l u t i o na n dt h et w og r o u p sw i l l s i m p l i f yt h es e p a r a t e d t h es m a l lm o l e c u l e sh a saw i d t he l u t i o nc o n c e n t r a t i o nr a n g eb u tt h a t o fm a c r o m o l e c u l e si sv e r yn a r r o wt h a tc a nb es i m p l yr e g a r d e da s “ap o i n t ”，s ot h eo t h e r d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g yc a nb ea d a p t e d ：as u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n f o ri s o c r a t i c e l u t i o nt oe l u t es m a l lm o l e c u l e sf i r s t l y , a n ds u b s e q u e n t l yag r a d i e n te l u t i o nt os e p a r a t e m a c r o m o l e c u l e s c o m p o n e n t so fh o p t o a do v u mc e l lw e r er a p i d l ys e p a r a t e da n dp u r i f i e db y t h i sw a y h i g ha b u n d a n c eo fp e p t i d ec o m p o n e n t sw e r er e m o v e dw i t ht h el o w - e n r i c h e d p r o t e i n s i tw o u l db ee x p e c t e dt h a tt h et w od y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cs t r a t e g i e sw i l lb ea n e w p r a c t i c a lm e t h o du s e df o rp r o t e o m i c s 6 t h et w od y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cp a r a m e t e r s 口 bh a s m o r es t a b i l ec h a r a c t e ri n d i f f e r e n tt h e r m o d y n a m i cc o n d i t i o n s ad y n a m i c a l l yc h r o m a t o g r a p h i cf i n g e rc h r o m a t o g r a m w a sc o n c e i v e ds i m p l y k e yw o r d s ：d y n a m i cl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ，p e p t i d e m a p p i n g , d y n a m i c c h r o m a t o g r a p h yf i n g e rc h r o m a t o g r a m , d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h yp a r a m e t e r v 西北大學學位論文知識產(chǎn)權(quán)聲明書 本人完全了解西北大學關(guān)于收集、保存、使用學位論文的規(guī)定。學校 有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版。本人允許 論文被查閱和借閱。本人授權(quán)西北大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi) 容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存 和匯編本學位論文。同時授權(quán)中國科學技術(shù)信息研究所等機構(gòu)將本學位論 文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫或其它相關(guān)數(shù)據(jù)庫。 保密論文待解密后適用本聲明。 學位論文作者簽名：笸建薈指導教師簽名：i 僉鳋芰墮 八_ 、1 撕7 年多月，9 日 年6 月io 日 西北大學學位論文獨創(chuàng)性聲明 本人聲明：所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及 取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，本 論文不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得西北大 學或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對 本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 學位論文作者簽名：唐壹聾 兩7 年6 月10 日 西北大學博士學位論文 1 1 前言 第一章文獻綜述 隨著生命科學的發(fā)展，眾多復雜生物樣品的分析、分離與純化為現(xiàn)代分離科學提 出了眾多熱點研究課題。如何實現(xiàn)對細胞、組織或體液所包含的成千上萬種組分的有效 分離，是現(xiàn)代分離科學研究所要解決的首要問題，同時也是難點問題。理想的分離方法 首先應(yīng)具備高分辨率，能夠快速將復雜組分同時分離并與后續(xù)的鑒定技術(shù)有效銜接。高 效液相色譜( 玎p l c ) 作為目前最為有效的分離方法之一，在蛋白質(zhì)的多級純化過程中， 發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 如何盡可能獲得高的色譜分離度是分離科學工作者追求的的一個重要目標之一。色 譜的分離過程，受熱力學因素和動力學因素的同時控制。為了得到滿意的分離效果，首 先應(yīng)考慮填料的性質(zhì)及其與溶質(zhì)相互作用的強弱，這主要表現(xiàn)在色譜柱和色譜模式的選 擇上。同時由于流動相的種類與使用條件既影響動力學因素，又影響熱力學因素，故必 須正確地選擇并優(yōu)化色譜分離條件。上述這些問題，都涉及到色譜的基本理論。 色譜技術(shù)的理論基礎(chǔ)可以大致歸納為色譜熱力學和色譜動力學兩大部分。色譜熱力 學的問題，眾多色譜工作者研究的很多。這里，擬簡單地討論色譜動力學的幾個問題， 主要討論一種新的色譜模式一動力學色譜。 1 2 色譜動力學 色譜過程動力學理論研究是色譜分析實現(xiàn)高效、快速的理論基礎(chǔ)。色譜動力學理論 主要研究在色譜過程中物質(zhì)在柱內(nèi)的輸運現(xiàn)象【。其研究的主要目的是解釋穿透曲線的 形狀，探求影響色譜峰擴張的原因和機理，為獲得高效能色譜柱系統(tǒng)提供理論指導，為 選擇色譜分離條件奠定理論基礎(chǔ)。在物料平衡原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)物質(zhì)在柱內(nèi)的傳輸、 分配狀況，可以推導出溶質(zhì)遷移必須遵守的規(guī)律，即色譜動力學方程。求解動力學方程 可以獲知色譜流出曲線的形狀。進而研究柱效率、峰形與各種參數(shù)之間的關(guān)系。 色譜動力學理論可分成塔板理論【2 1 ，速率理論，非平衡理論【3 1 和質(zhì)量平衡理論四部 分。塔板理論中引出的塔板數(shù)和塔板高度的概念在表征柱效時是很有用的參數(shù)，但塔板 理論不能把柱效與色譜參數(shù)定量地關(guān)聯(lián)起來。速率理論和非平衡理論分別從微觀和宏觀 1 第一蘋文獻綜述 的基點出發(fā)研究色譜分離動力學過程，而且能把柱效與色譜參數(shù)關(guān)聯(lián)起來，這對改善色 譜柱結(jié)構(gòu)，提高柱效是有指導意義的，但不能給出色譜流出曲線形狀。質(zhì)量平衡理論能 從物理意義上描述各種機理的色譜分離過程，也能有效地給出色譜柱效與參數(shù)的關(guān)系和 色譜流出曲線的信息，但是其數(shù)學推導和求解特別復雜。 1 2 1 塔板理論( p l a t et h e o r yo f c h r o m a t o g r a p h y ) 塔板理論是m a r t i n 和s y n g e 于1 9 41 年首先提出的，是對色譜過程進行描述的初次 嘗試。在m a r t i n 之后，s a i d 等學者也對這一理論做了補充和完善，使塔板理論為色譜 界所接受。塔板理論將一根色譜柱看作是一根精餾柱，它由許多單級蒸餾的小塔板和小 短柱組成，每一個單級蒸餾的小塔板或小短柱很小，但允許溶質(zhì)在其中有足夠的時間達 到兩相間的平衡。就像在精餾塔內(nèi)進行精餾一樣，這種假想的踏板或小短柱越小或越短， 就意味著在一個精餾塔或分離柱上允許進行反復平衡的次數(shù)就越多，即具有更高的分離 效率。 塔板理論基于以下幾個基本假設(shè)：l 、色譜柱內(nèi)徑和柱內(nèi)填料填充均勻，色譜柱由 若干小段組成，每一小段的高度為h ，這樣一小段稱為一個理論塔板。2 、溶質(zhì)分子在 塔板內(nèi)固定相和流動相之間的分配瞬間達到平衡，且縱向分子擴散可以忽略。3 、溶質(zhì) 在各塔板上的分配系數(shù)是一個常數(shù)，與溶質(zhì)在每個塔板上的量無關(guān)，即呈線性分布等溫 線。4 、流動相通過色譜柱是不連續(xù)的，而是脈沖式的間歇過程。5 、溶質(zhì)開始時加載色 譜柱零塊塔板上。 塔板理論將色譜過程看作是一個平衡分配的不連續(xù)過程，這是一種理想的極限狀 態(tài)。實際的色譜過程是一個動態(tài)過程，很難實現(xiàn)真正的平衡。塔板理論忽略了色譜過程 中分子擴散等因素，其理論假設(shè)不能全面反映色譜分離本質(zhì)，色譜過程不僅與分配平衡 有關(guān)，而且與分子擴散、傳質(zhì)，即分子速率有關(guān)。 1 2 2 速率理論( r a t et h e o r yo fc h r o m a t o g r a p h y ) 鑒于塔板理論的局限性，v a nd e e m t e r 于1 9 5 6 年在前人工作的基礎(chǔ)上，研究了擴散、 傳質(zhì)等于色譜過程物料平衡或質(zhì)量平衡的關(guān)系，根據(jù)物料平衡方程，考察溶質(zhì)通過色譜 體系總的濃度變化，導出速率理論方程。其后g i d d i n g s 將色譜過程看作分子無規(guī)則運 動的隨機過程，用隨機行走( r a n d o m w a l k ) 模型來描述它，根據(jù)隨機理論導出速率理 論方程。 速率理論運用流體分子規(guī)律研究色譜過程中產(chǎn)生色譜峰擴張的因素。總結(jié)起來包括 2 西北大學博士學位論文 兩大部分：柱外譜帶展寬效應(yīng)和柱內(nèi)譜帶展寬效應(yīng)，而柱內(nèi)譜帶展寬效應(yīng)主要有4 種， 即多路徑效應(yīng)( m u l t i p a t he f f e c t ) 、縱向擴散( 1 0 n g i t u d i n a ld i f f u s i o n ) 、流動相中的傳質(zhì)阻 力( t h er e s i s t a n c et om a s st r a n s f e ri nt h em o b i l ep h a s e ) 以及固定相中的傳質(zhì)阻力( t h e r e s i s t a n c et om a s st r a n s f e ri nt h es t a t i o n a r yp h a s e ) 。 在總結(jié)了上述各種引起峰展寬的效應(yīng)的基礎(chǔ)上，v a nd e e m t e r 于1 9 5 6 年提出了填充 氣相色譜柱內(nèi)總理論塔板高度的方程，即 一2 d p + 孕+ 警 ) 其中 五= 砉志 ( 1 2 ) 根據(jù)這一表達式，可以比較精確地預測給定的色譜柱在優(yōu)化的流動相速度下的柱效 率，以及各種因素對總理論塔板高度的影響。這對于色譜柱的優(yōu)化設(shè)計是十分重要的。 從v a nd e e m t e r 方程中可以得到一個最佳流速。 v a n d e e m t e r 方程雖然比較滿意地描述和解釋了發(fā)生于色譜過程中的譜帶展寬過程。 但是，在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有時試驗值偏離公式。于是，后續(xù)學者繼續(xù)對其進行了廣泛而 深入的研究，并提出了一些修正的v a nd e e m t e r 方程，如g i d d i n g s 方程、h u b e r 方程、 h o r v a t h l i n 方程、k n o x 方程和描述開管柱的g o l a y 方程。 1 2 3 質(zhì)量平衡理論( m a s sb a l a n c em o d e l ) 質(zhì)量平衡理論能從物理意義上描述各種機理的色譜分離過程，可以有效地給出色譜 柱效與參數(shù)的關(guān)系和色譜流出曲線的信息。許多色譜工作者【5 1 對該理論的發(fā)展和應(yīng)用 做了大量的工作。但他們的工作都僅僅考慮了色譜柱內(nèi)的動力學過程。鄒漢法【2 】等人在 前人的工作基礎(chǔ)上，考慮到柱外效應(yīng)的影響，建立了整個液相色譜系統(tǒng)的質(zhì)量平衡模型， 導出了色譜流出曲線的一級矩和二、三級中心矩的表達式，并給以了一定的討論。 1 2 4 色譜動力學模型( c h r o m a t o g r a p h yd y n a m i cm o d l e ) 色譜分離過程的動力學研究可用來分析流出曲線的形狀，探求引起色譜峰區(qū)域?qū)挾?擴張的眾多因素和機理，可以建立適宜的色譜模型來對某分離單元的分離過程進行數(shù) 學模擬。色譜技術(shù)和計算機的發(fā)展為動力學色譜模型的建立提供了便利，目前研究者們 已經(jīng)提出了許多色譜模型用于色譜分離過程動力學的研究。其中最常用的幾種模型包括 普遍化速率模型( a r ) 、集總孔擴散模型( p o r ) 、平衡擴散模型( e d ) 和傳遞擴散模型( t d ) 第一章文獻綜述 1 3 動力學色譜( d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y ) 近年來出現(xiàn)了一類新的色譜分離方法，其分離機理與傳統(tǒng)的基于熱力學理論的分離 模式不同，溶質(zhì)在動力學因素，如流動相流速、填料顆粒的型狀、大小的影響下具有不 同的色譜特性，利用動力學因素等對溶質(zhì)進行分離。這種方法最大的特點就是溶質(zhì)的分 離是依靠于流體力學現(xiàn)象而非傳統(tǒng)的熱力學中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間的化學平 衡，顯著影響溶質(zhì)保留值的是各種流體力學因素，如固定相顆粒的大小、流動相的流速、 溫度和黏度以及溶質(zhì)的空間構(gòu)型，而化學因素，如固定相顆粒的化學性質(zhì)、孔徑和溶劑 的疏水性并不是影響分離的關(guān)鍵因素。其主要研究內(nèi)容是研究動力學因素對溶質(zhì)的保留 值、分離度、峰容量等色譜行為的影響。 1 4 動力學色譜和色譜動力學 色譜動力學研究的主要目的是解釋穿透曲線的形狀，探求影響色譜峰擴散的原因和 機理，為獲得高效能色譜柱系統(tǒng)提供理論指導，為選擇色譜分離條件奠定理論基礎(chǔ)，并 在物料平衡原理的基礎(chǔ)上，根據(jù)物質(zhì)在柱內(nèi)的傳輸、分配狀況，推導出物質(zhì)輸運必須遵 守的規(guī)律，即色譜動力學方程。求解動力學方程可以獲知色譜流出曲線的形狀。進而研 究柱效率、峰形與各種參數(shù)之間的關(guān)系。 動力學色譜研究的主要內(nèi)容是研究動力學因素對溶質(zhì)色譜遷移行為的影響，探求溶 質(zhì)在動力學因素影響下的相關(guān)遷移規(guī)律，建立溶質(zhì)分離的動力學模型，為選擇最佳的色 譜分離的動力學條件奠定理論基礎(chǔ)。 1 5 兩種動力學色譜( h d c 、s c ) 的發(fā)展和應(yīng)用 液相色譜的分類依據(jù)溶質(zhì)與固定相之間的作用特征，可分為離子交換色譜，疏水相 互作用色譜和反相色譜，親合色譜及尺寸排阻色譜等。近年來出現(xiàn)的兩種色譜模式，即 流體動力色譜( h y d r o d y n a m i cc h r o m a t o g r a p h y , h d c ) 和障礙色譜( s l a l o m c h r o m a t o g r a p h y , s o ) ，其溶質(zhì)均與固定相之間的作用特征無關(guān)，或關(guān)系甚小，而主要是 與流動相的流動特征有關(guān)，或是基于動力學因素發(fā)展起來的兩種新的色譜方法，二者通 稱為動力學液相色譜法。目前已經(jīng)在測定和分離聚合物、多肽、d n a 和生物大分子方 面有廣泛的應(yīng)用。耿信篤曾經(jīng)在一篇綜述中，從與s e c 做比較的角度簡要地介紹了 4 西北大學博士學位論文 t s i h d c 和s c 的分離原理及二者之間的不同點，下文詳細并系統(tǒng)地說明了h d c 和s c 的分離原理、模型、理論發(fā)展、儀器設(shè)備和最新應(yīng)用，也探討了h d c 與s c 之間的聯(lián) 系及相互轉(zhuǎn)化。 1 5 1 流體動力色譜( 皿c ) h d c 是s m a l l 等在7 0 年代初就己開發(fā)的一種可同時測定聚合物或膠體乳膠粒的 直徑及其分布的方法【1 9 m 】。他們采用了無孔剛性固體顆粒填充色譜柱，待分離乳液在高 壓下通過色譜柱時，由于不同大小的溶質(zhì)所受到的水動力效應(yīng)的不同，其乳液在流動相 中的移動速度也不同，因此實現(xiàn)了聚合物或膠體懸浮液的分離。m o i l 2 2 l 等研究者進一 步發(fā)展和完善了h d c ，并將其引伸到某些天然高分子的分離。后來科學家發(fā)現(xiàn)在一根直 徑為幾百微米的毛細管中同樣也可實現(xiàn)不同粒徑混合物的分離【2 3 , 2 4 l 。這種采用毛細管， 而不是填充柱作為分離柱的分離方法拓寬了h i ) c 的應(yīng)用范圍，這在理論研究和實際應(yīng) 用上都有著非常重要的意義。e l i e 和r e h a u d 曾利用管徑為1 5 m m 的毛細管成功地對 紙纖維懸浮液中的纖維顆粒進行了分離【2 5 1 。用內(nèi)徑小于1 0 “m 的毛細管，稱其為微毛 細管，其分離機理與內(nèi)徑大于1 0 岬的毛細管略有不同，s i l e b i t 2 6 l 和d o s r a m o s 2 7 1 以及 t i j s s e n 2 8 1 和b o s 2 9 】對微毛細管h d c 進行了詳細的理論探討和應(yīng)用研究。 1 5 1 1 皿c 的原理 1 5 1 1 1h d c 柱 毛細管h d c 和填充柱h d c 所需色譜裝置大體相同。二者的不同之處在于毛細管 h d c 采用管徑不同的毛細管作為分離色譜柱，而填充柱h d c 則使用無孔剛性固體顆 粒填充的色譜柱。相對于毛細管h d c ，填充柱h d c 的設(shè)備相對簡單，操作也更為簡便， 尤其是檢測手段的簡化，使用一般的紫外檢測器便能滿足要求。而毛細管h d c 受到進 樣量和檢測濃度的限制，要求檢測器較為靈敏，通常使用高靈敏度紫外檢測器或其它手 段，如電位分析、激光激發(fā)熒光法及激光光散射法等f 3 們。 1 5 1 1 2h d c 分離模型 盡管h d c 包括了前述的兩種主要模式，毛細管t t d c 和填充柱h d c ，而大部分有 關(guān)h d c 的理論都以前者為主【3 1 , 3 2 l ，由于可將填充h d c 顆粒間的間隙視為毛細管體系， 故填充h d c 有與毛細管h d c 相同的分離模型。 h d c 的分離機理可描述為：當流動相從填料顆粒間經(jīng)過時，由于水動力效應(yīng)的存 在使其流型為層流拋物面型，溶質(zhì)在這種情況下的分離主要是借助于靠近填料顆粒表面 第一蘋文獻綜述 的低流速區(qū)域所產(chǎn)生的排斥效應(yīng)，大的溶質(zhì)分子由于受到的排斥效應(yīng)大于小的溶質(zhì)分 子，更容易遠離填料顆粒表面而進入高流速區(qū)域，這樣大分子溶質(zhì)的移動速度大于小分 子溶質(zhì)，從而先于小分子被洗脫出來。有多個模型描述了溶質(zhì)在h d c 中的保留行為， 最簡單的僅考慮了幾何學效應(yīng)，而常用的模型是d i m a r z i o 和g u t t m a n l 3 3 3 4 及b r e n n e r 和 g a y d o s l 3 2 1 依據(jù)幾何學原理而提出的保留時間和溶質(zhì)大小的關(guān)系，如圖1 1 所示，溶質(zhì)分 子在毛細管內(nèi)的遷移可用方程( 1 3 ) 來表示： r = ( 1 卅執(zhí)一c ”。1 ( 1 3 ) 式中，r = t m t o 為溶質(zhì)的保留值與無限小的標記物的保留值之比，也稱之為相對 保留值；x - - d e ，以為溶質(zhì)的有效直徑，是毛細管的直徑。占和c 均為與幾何學 有關(guān)的常數(shù)；c 值介于0 5 5 之間【3 5 l ，在填充柱里c 值介于2 7 - 2 8 之間。 從式( 1 3 ) 看出，對于粒徑不同的顆粒來說，其相對停留時間是不同的，這樣具有 不同大小顆粒的溶質(zhì)便可用皿c 法進行分離。由于大分子先于小分子被洗脫出來，因 此，雖然它所用分離原理與常講的尺寸排阻色譜( s e c ) 不同，但其洗脫順序卻與s e c 相同。 然而這里需要指出的是，在式( 1 3 ) 的推導過程中假定被測粒子作為剛性的不旋 轉(zhuǎn)微球來處理，而實際上對于流動體系中的粒子來說，其上下所受的力是不平衡的，在 力矩的作用下將發(fā)生旋轉(zhuǎn)，反過來將會影響其流動速度。這個現(xiàn)象最早由d i m a r z i o 和 g u t t m a n l 3 1 1 以及b r e n n e r 和g a y d o s 3 2 l 論及。 圖1 1 大溶質(zhì)分子移動快于小分子的h d c 分離原理示意圖 f i g u r e l - lp r i n c i p l eo fh d cs e p a r a t i o n l a r g e ra n a l y t e sc a n n o ts a m p l el o wf l u i dv e l o c i t i e sn e a rt h e c h a n n e lw a l la n dt h e r e f o r em o v ef a s t e r 1 5 1 2h d c 的發(fā)展和應(yīng)用 用h d c 分離時要求溶質(zhì)分子的大小與流經(jīng)管道直徑的比值不是太小，應(yīng)大于 o o l ，一般介于0 0 1 0 3 5 之洲3 們。在t - d c 提出的初期，人們使用小孔徑的毛細管( i d 5 0 - 5 0 0 p m ) ，或者使用填充1 0 2 0 1 m a 填料的填充柱，其內(nèi)部管道相對較大，因此它們僅 6 西北大學博士學位論文 局限于分析較大的一些溶質(zhì)，如纖維和固體顆粒【2 1 , 3 7 , 3 引。一般來說，采用小內(nèi)徑的毛細 管，或非常小的粒徑均勻的微球作為填料時可顯著提高h d c 柱的柱效，因此后來人們 使用內(nèi)徑更小的( - 5 i u n ) 的毛細管和更小顆粒的填料( 1 1 5 9 m ) 3 5 , 3 9 】來提高h d c 的 分離度，如，s t e g e m a n 等 4 0 , 4 1 】利用粒徑范圍在( 1 4 2 7 ) g r n 單分散s i 0 2 微球為填料分 離聚苯乙烯顆粒、膠體s i 0 2 顆粒和蛋白質(zhì)等，取得了良好的分離效果。考慮到r d c 的 分離機理在體積排除色譜( s e c ) q 口同樣存在，故可將h d c 與s e c 結(jié)合，從而拓寬所分 離溶質(zhì)分子量的范圍。c h e n g 4 2 j