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從患者開始談基因檢測的整個流程 題記：幾顆玉米放進(jìn)爆米花機(jī)器，出來便是爆米花；一個智力一般的高中生放到人大附中，三年后出來就是國際一流大學(xué)新生；二兩五花肉和幾個青椒交給一名廚師，出來的便是香噴噴的回鍋肉?？墒沁@中間都發(fā)生了啥？是什么重要步驟將初始原料打磨成了成品？10ml的血液或者一塊腫瘤組織，最終變成了一份20頁的檢測報(bào)告？這是怎么實(shí)現(xiàn)的？中間都發(fā)生了什么？本文旨在回答這個問題?；驒z測的整個流程可分為哪幾個大的步驟？概況性地了解一個事務(wù)的框架是很有必要的，因?yàn)檫@樣我們心里會有“底”。不管別人怎么分，我簡單粗暴地把它分為四個程序：1，檢測前咨詢部分；2，實(shí)驗(yàn)室部分；3，信息分析部分；4，臨床解讀部分。五臟俱全的基因檢測公司應(yīng)該包含以上所有的四個程序，除非存在部分業(yè)務(wù)外包的情況，例如有的公司只做臨床解讀部分。1）檢測前咨詢部分：不是所有的癌癥患者都應(yīng)該檢測，都值得檢測，檢測目的是為了明確是否可以使用靶向藥物，還是僅僅為了玩，選擇哪種產(chǎn)品更加適合，這些都是需要在這部分搞清楚。2）實(shí)驗(yàn)部分：應(yīng)該取多少組織樣本，測序過程中有哪些細(xì)節(jié)步驟，這可是個核心環(huán)節(jié)。3）信息分析：實(shí)驗(yàn)部分做完以后所得到的是一大堆序列，不分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是從這些垃圾中挑選黃金。4）臨床解讀：黃金挑選出來不拿去換成大米然后進(jìn)肚，那也沒什么用，基因檢測的結(jié)果有什么意義，對臨床實(shí)踐又何指導(dǎo)，全在這里了。四個程序，每個程序又包含哪些小工序呢？通過上面的介紹，我們可以大體了解基因檢測分為四個程序，也明白四個程序主要做什么。可是，每一個程序又具體涉及哪些小程序呢？剖析程序的過程，就是知識差異化的過程。1，檢測前咨詢：患者預(yù)期、產(chǎn)品選擇；2，實(shí)驗(yàn)部分：樣本獲取與運(yùn)輸、DNA制備與文庫構(gòu)建、質(zhì)控與上機(jī)測序；3，信息分析部分：數(shù)據(jù)分析、報(bào)告初稿；4，臨床解讀部分：檢測報(bào)告、臨床實(shí)踐、報(bào)告解讀/人文關(guān)懷。總而言之，簡單來說，從明確患者的檢測目的開始（用藥指導(dǎo)，耐藥后尋找新的方案，僅檢測一個基因或多個基因突變狀態(tài)等），到選擇合適的產(chǎn)品，然后獲取規(guī)范的樣本（血液，組織，唾液等），然后合適的運(yùn)輸方式到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，然后一些列的規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作及數(shù)據(jù)分析，最后到科學(xué)的檢測報(bào)告與咨詢服務(wù)。這就是四個程序所包含的內(nèi)容。每一個程序分為許多小工序，每一個小工序又有許多學(xué)問與講究。下面將會詳細(xì)介紹每一個小工序。程序一：檢測前咨詢部分1.1：患者預(yù)期。銷售經(jīng)理、產(chǎn)品經(jīng)理、主治醫(yī)生與患者需要充分溝通，明確該基因檢測的目的，知道檢測技術(shù)的局限性，做好患者的預(yù)期控制。1.2：產(chǎn)品選擇。對于基因檢測產(chǎn)品來說，產(chǎn)品選擇幾乎等同于檢測基因的選擇。哪些基因需要強(qiáng)行檢測、哪些基因推薦檢測、哪些基因有一定的檢測價值，這些需要闡述清楚。最后，根據(jù)患者的經(jīng)濟(jì)情況與病情，綜合選擇（這是理想狀況）。實(shí)際操作過程中，銷售經(jīng)理往往會以經(jīng)濟(jì)利益為導(dǎo)向。1.3：臨床信息?；颊叩呐R床信息對于基因檢測報(bào)告者有重要意義，信息掌握越全面報(bào)告越個性化，咨詢解讀也更有針對性。因此，完整詳實(shí)的臨床申請單需要提供。程序二：實(shí)驗(yàn)部分2.1：樣本類型。需要明確一點(diǎn)，能夠運(yùn)用無創(chuàng)的盡量用無創(chuàng)（唾液與血液），因?yàn)闆]有一個患者希望無緣無故的在自己身上打洞。固體：手術(shù)樣本，穿刺樣本，石蠟包埋組織，石蠟切片組織；液體：全血，血清 血細(xì)胞，胸水，腹水，唾液。1）手術(shù)樣本：（腫瘤組織50mg，癌旁正常組織25mg，收到組織后立即用至少5倍體積的10%中性福爾馬林固定液固定），切片25張以上，厚度5 m，腫瘤細(xì)胞占比50%，壞死組織區(qū)域2）穿刺樣本：穿刺一針以上，腫瘤細(xì)胞占比50%，壞死組織區(qū)域3）石蠟包埋組織：常溫保存運(yùn)輸即可，最好是1年以內(nèi)。4）石蠟切片組織：常溫保存運(yùn)輸即可，最好是6周以內(nèi)。5）全血：6ml-10ml for NGS (Streck管，含有保存液，負(fù)壓真空抽滿)，輕輕垂直平面90旋轉(zhuǎn)10次，6-25（常溫）運(yùn)輸，3（7）日內(nèi)送達(dá)，可用干冰/制熱劑制造維持環(huán)境溫度。6）血漿 血細(xì)胞 （普通試管）：抽血后 2h 內(nèi)將全血4 1600g離心 10min，分別收集上清和沉淀至離心管中；上清再 4C 16000g 離心 10min，收集上清血漿轉(zhuǎn)移至 15mL 離心管中。血漿 血細(xì)胞樣品，均封口膜封口，干冰運(yùn)輸。7）胸水：8）腹水：這兩個情況比較少，至少我們公司很少遇到這樣的樣本。2.2：質(zhì)控。血液樣本是否合格，是否可以進(jìn)行測序上機(jī)，樣本質(zhì)量怎么樣？安捷倫2100生物分析儀或者4200 TapeStation核酸分析儀，通過DNA完整值（DIN）來數(shù)字化基因組DNA的完整性。如果不用這些儀器，可以通過跑膠來實(shí)現(xiàn)這一步。質(zhì)控不合格，只有重新采樣。標(biāo)準(zhǔn)流程只需要0.1-1g DNA，DNA的OD 260/280在1.8-2.0之間，RNA的RIN值8.0。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只要RIN值大于7，就可以獲得比較滿意的結(jié)果。（RIN：RNA完整值）。總的來說，質(zhì)控兩個指標(biāo)：1）足夠的DNA量；2）完整的DNA基因組。這個步驟在構(gòu)建文庫后上機(jī)測序前完成。2.3：文庫構(gòu)建。簡而言之，獲取足夠量的/目的的/前期適合上機(jī)測序而標(biāo)準(zhǔn)處理的DNA。其程序主要有：片段化，連接，擴(kuò)增。1）片段化：我們總不能直接將那么長的DNA去測序吧，測序儀就只能一次測幾百bp的DNA，超聲波片段化等方法，獲得DNA片段為正態(tài)分布200-500bp，通過一定方法（切割瓊脂糖凝膠電泳條帶）選擇所需長度的DNA片段（150-200bp），其它的片段就扔了（不影響覆蓋范圍）。2）末端修補(bǔ)：上面的方法（物理方法）片段化的DNA，一般來說兩端都被破壞了，不再是平平整整的了，而后續(xù)步驟需要在兩端加測序接頭，所以我們得先把這個破壞的兩端修補(bǔ)好。修補(bǔ)所需三種酶：5端延伸的酶，5端連接的酶，3端延伸的酶。3）3端加A：片段化且兩端修補(bǔ)好的DNA，3端加上一個堿基A，而下一步驟的連接接頭3端有一個堿基T，這樣就實(shí)現(xiàn)了堿基互補(bǔ)而連接起來了。這樣做還有以下幾個原因：提供連接效率；防止接頭與DNA片段多種方向連接；減少接頭之間的連接。值得一提的是1）2）3）的步驟可以用WGS Framentation Mix搞定。4）兩端加接頭：首先明確接頭3端有一個突出的堿基T，插入片段3端有一個突出的堿基A；其次，這個工序是在插入片段兩端加入東西；這個東西包括以下幾個部分：測序接頭（P5，P7；測序時用于與種植在Flow Cell上的序列堿基互補(bǔ)配對用），Barcode（用于標(biāo)識該條DNA片段屬于哪個樣本，4個堿基），單分子編碼序列（Index，用于識別是哪條DNA片段，12個隨機(jī)堿基）；其中Y型的序列是已經(jīng)商業(yè)化的試劑盒。5）PCR富集：如果樣本不夠，那么我們就需要擴(kuò)增它才能上機(jī)測序，這就是該環(huán)節(jié)存在的必要。由于每個經(jīng)4）處理的片段兩端都有P5與P7，因此PCR引物只需設(shè)計(jì)與它們配對的就行了。如果樣本足夠，這一步就省了唄。6）文庫定量：這里才應(yīng)該是質(zhì)控，也就是2.2的步驟。7）基因捕獲：我們只將需要的DNA片段去測序，不需要的去測不是浪費(fèi)錢嗎？于是在測序之前，我們就用這個工序?qū)⒛康腄NA挑選出來（為什么要捕獲）；目前目標(biāo)序列捕獲方法有3種，NimbleGesn Sequence Capture array，Agilent SureSelect DNA Capture Array，Agilent SureSelect Target Enrichment System，值得注意的是不同捕獲方法可能測序儀器有不同的要求（捕獲的方法有哪些；羅氏和安捷倫）；我們捕獲的探針設(shè)計(jì)可以自己設(shè)計(jì)，初步設(shè)計(jì)，需要檢測的位點(diǎn)提交到商業(yè)公司，真正的設(shè)計(jì)還是需要專業(yè)的商業(yè)公司來干（捕獲探針的由來）；例如目標(biāo)區(qū)域?yàn)?00Kb，好的探針是100%覆蓋這100Kb，而有的商業(yè)公司達(dá)不到，只能覆蓋到97%，那么意味著有3%的區(qū)域捕獲不到，更談不上對這些區(qū)域測序了，所以覆蓋率很重要；對于這100Kb的目標(biāo)片段，前10Kb探針捕獲了100個片段，第10Kb-20Kb的探針捕獲了10個片段，那么這樣的話就是均一性不好，最終可能會得出結(jié)論10Kb-20Kb這一段突變頻率過高/過低，因此均一性很重要；如果一個探針設(shè)計(jì)出來想捕獲目標(biāo)片段，卻捕獲到了別的垃圾片段，我們還對它測序，這不是浪費(fèi)錢嗎？所以，探針特異性很重要。（好的捕獲是怎么樣的）。8）PCR擴(kuò)增：PCR再次擴(kuò)增捕獲的DNA片段，上機(jī)前再一次加足樣本量。9）文庫再次定量：相當(dāng)于上機(jī)前的再一次質(zhì)量檢測。2.4：上機(jī)測序。通過前面的步驟，我們從患者身上的一塊腫瘤組織或者一管血開始，然后分離提純我們需要的基因組DNA，再把這些DNA打成小片段，然后再在這些DNA小片段兩頭接上識別標(biāo)記和測序接頭，最后再通過基因捕獲技術(shù)篩選出目的DNA，根據(jù)需求PCR擴(kuò)增。通過這么多步驟，就是為上機(jī)測序做準(zhǔn)備。一句話，上機(jī)測序的過程就是讀取這些DNA小片段的序列，如ATCTGGCTT.(160bp)，這樣萬級、億級的DNA片段個數(shù)。至于這些DNA片段是怎么樣在機(jī)器上被測出來的，這又是個大問題，我在液體活檢有哪些這篇文章有簡要說明，這里不管它，畢竟世界上那么多事情，哪有想管就管得了的呢？至此，實(shí)驗(yàn)部分結(jié)束。程序三：信息分析部分3.1：下機(jī)數(shù)據(jù)識別。數(shù)以億計(jì)的DNA小片段，一大餅，雜亂無章，很多情況是幾十個患者的樣本都一起的，更亂。一句話，這個步驟將屬于不同患者的DNA小片段放進(jìn)不同的盒子里，分類。這是怎么實(shí)現(xiàn)的呢？我們在構(gòu)建文庫的加接頭步驟時，同時加上了Barcode序列，同一個患者使用同一個Barcode，不同的患者使用不同的Barcode，那么計(jì)算機(jī)通過這個Barcode輕松識別然后放進(jìn)不同的盒子里。值得注意的是，DNA是兩條鏈，有的公司會兩條鏈同時測序以增加準(zhǔn)確性，因此一個A患者會有兩個盒子屬于他（A1：正義鏈的DNA小片段集合；A2：反義鏈的DNA小片段集合）。還值得注意的是，如果樣本是血液，有的公司會同時檢測cfDNA和gDNA，那么一個B患者就會有四個盒子屬于他（B1，B2，B3，B4）。3.2：圖像轉(zhuǎn)換。下機(jī)的時候那些DNA片段最初其實(shí)是圖像格式的，例如紅色表示堿基A，綠色表示堿基T，需要用專業(yè)工具將圖像格式轉(zhuǎn)換成序列。Illumina公司提供專業(yè)軟件，只需對其調(diào)用就可以完成這一步驟。一句話：圖像轉(zhuǎn)換成序列。3.3：比對到基因圖上。將這些上以億級的DNA小片段歸位，如果你是1號染色體的第500位到第650位之間的片段，就把你歸到這個位置下面。當(dāng)然，1號染色體上的這個位置下面一般不止一條DNA片段，畢竟有一個概念叫做測序深度，如果測序深度為10000，那么理論上該位置下面就應(yīng)該有10000條DNA片段。怎么控制是10000條呢？這在上機(jī)之前構(gòu)建文庫時，通過調(diào)節(jié)PCR擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)。一句話：將散亂的DNA小片段比對到參考基因組上，從而實(shí)現(xiàn)它們的定位。這個參考基因組是國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫給出的，供給全世界所有人使用?；蚪M：/goldenPath/hg19/bigZips/；比對軟件BWA：/；3.4：計(jì)算突變頻率。假如1號染色體的500位到第650位有10000個DNA片段，那么測序深度就真的是10000嗎？在這里需要做一個辨別，如果這10000條DNA片段有9000條是一模一樣的，那么我們認(rèn)為這是一條DNA片段PCR擴(kuò)增出來的，這9000條只能算作1條，這時候有效測序深度為1001。在某個特定的位點(diǎn)，如果這1001條DNA片段有100條發(fā)生同樣的與參考基因組不一樣的變化，我們就認(rèn)為該點(diǎn)的突變頻率為10%。這10%的突變頻率（血液腫瘤驅(qū)動基因突變?yōu)槔┮馕吨貉褐械腸fDNA有10%是ctDNA，從而反應(yīng)患者的腫瘤病灶有一部分癌細(xì)胞發(fā)生了該突變，若有針對該位點(diǎn)的靶向藥，那么可根據(jù)情況推薦使用。值得注意的是，如果有效測序深度只有100，那么就有可能漏掉一些典型的突變，所以有效測序深度足夠是非常重要的。這里有一個問題：某個特定位點(diǎn)的變化，怎么樣才算真正的突變呢？冷泉港實(shí)驗(yàn)室的VarScan軟件來判定SNV和INDEL，順便說一句要判定真正的突變很難，國際上有不同的看法。VarScan：http