DNA重組技術(shù)的基本工具 (2).ppt

1 專題1基因工程 1 1DNA重組技術(shù)的基本工具 基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程 科技探索之路 1 基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2 工具酶的發(fā)現(xiàn)3 DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4 DNA體外重組的實現(xiàn)5 重組DNA表達實驗的成功6 第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7 PCR技術(shù)的發(fā)明 角似鹿鼻似獅目似虎唇似牛爪似鷹髭似馬鱗似魚身似蛇 設(shè)想一 能否培養(yǎng)出具有抗蟲性狀的抗蟲棉呢 藍色玫瑰 能生產(chǎn)胰島素的大腸桿菌 轉(zhuǎn)基因鼠 能發(fā)熒光的轉(zhuǎn)基因豬 9 是指按照人們的意愿 進行嚴格的設(shè)計 通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù) 賦予生物以新的遺傳特性 創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品 由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的 又叫DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù) 什么叫基因工程 生長激素 胰島素 10 基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù) 生物體外 基因 DNA分子水平 人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品 或基因產(chǎn)物 剪切 拼接 導(dǎo)入 表達 實質(zhì) 原理 基因重組 對基因工程概念的理解 一種定向改造生物的新技術(shù) 第1節(jié) 12 1 1DNA重組技術(shù)的基本工具 13 基因工程培育抗蟲棉的簡要過程 普通棉花 無抗蟲特性 蘇云金芽孢桿菌 提取 抗蟲基因 與載體DNA拼接導(dǎo)入 棉花細胞 含抗蟲基因 棉花植株 有抗蟲特性 14 關(guān)鍵步驟一 抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取 關(guān)鍵步驟二 抗蟲基因與載體DNA連接 關(guān)鍵步驟三 抗蟲基因進入棉細胞 基因的分子手術(shù)刀 限制性內(nèi)切酶 基因的分子縫合針 DNA連接酶 基因的分子運輸車 載體 如何解決 抗蟲棉培育 閱讀課本4 5頁 限制性核酸內(nèi)切酶 分子手術(shù)刀 的相關(guān)內(nèi)容 填寫下表 自主學(xué)習(xí)一 主要從原核生物中分離純化而來 已經(jīng)分離出大約4000種 1 識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列 2 使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開 形成兩種末端 黏性末端或平末端 脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu) G A 3 5 磷酸二酯鍵 3 端 5 端 3 端 5 端 磷酸二酯鍵 18 仔細觀察各限制酶識別的特定序列有何特點 限制酶的識別序列 限制酶所識別的序列的特點是 找到一條中心軸線 中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 稱為回文序列 中軸線 在G與A之間切割 大腸桿菌的一種限制酶 EcoR 只能識別GAATTC序列 并在G和A之間切開 EcoRI限制酶的作用 黏性末端 黏性末端 EcoRI限制酶的切割 被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口 帶有幾個伸出的核苷酸 他們之間正好互補配對 這樣的切口叫黏性末端 錯位切 SmaI只能識別CCCGGG序列 并在C和G之間切開 中軸線 SmaI限制酶的作用 在G與C之間切割 平末端平末端 SmaI限制酶的切割 當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時 切開的DNA兩條單鏈的切口 是平整的 這樣的切口叫平末端 限制酶作用特點 1 限制酶識別特定的核苷酸序列 回文序列 回文序列 在切割部位 一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致 2 限制酶斷開磷酸二酯鍵 你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎 原核生物 主要是細菌 易受自然界外源DNA 噬菌體DNA 的入侵 但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制 以防止外來病原物的侵害 限制酶就是細菌的一種防御性工具 當(dāng)外源DNA侵入時 會利用限制酶將外源DNA切割掉 以保證自身的安全 所以 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 使之失效 從而達到保護自身的目的 尋根問底 尋根問底 為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA 通過長期的進化 細菌中含有某種限制酶的細胞 其DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列 或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上 使限制酶不能將其切開 這樣 盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷 并且可以防止外源DNA的入侵 26 1 要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口 可產(chǎn)生幾個黏性末端 要切兩個切口 產(chǎn)生四個黏性末端 3 如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割 會怎樣呢 會產(chǎn)生相同的黏性末端 然后讓兩者的黏性末端黏合起來 就似乎可以合成重組的DNA分子了 2 要把目的基因插入運載體的前提是什么 必須用同一種限制酶來切割目的基因和運載體 思考 27 類型 來源 功能 相同點 差別 E coliDNA連接酶 T4DNA連接酶 大腸桿菌 T4噬菌體 催化形成磷酸二酯鍵 只能連接黏性末端 能連接黏性末端和平末端 效率較低 閱讀課本第5頁 分子縫合針 DNA連接酶 的相關(guān)內(nèi)容 填寫下表 自主學(xué)習(xí)二 28 DNA連接酶 將兩段DNA片段連接 1 分類 根據(jù)酶的來源不同 可分為E coliDNA連接酶和T4DNA連接酶兩類2 功能 恢復(fù)被限制酶切開了的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵 兩種DNA連接酶 E coliDNA連接酶和T4DNA連接酶 的比較 相同點 都縫合磷酸二酯鍵 區(qū)別 E coIiDNA連接酶來源于大腸桿菌 只能使黏性末端之間連接 T4DNA連接酶能縫合兩種末端 但連接平末端之間的效率較低 把切下來的DNA片段拼接成新的DNA 即將脫氧核糖和磷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵 DNA連接酶的作用 兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來 DNA連接酶的縫合作用 可把黏性末端之間的縫隙 縫合 起來 注意 DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口 但不能連接單鏈DNA DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎 T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙 縫合 起來 但效率較低 DNA連接酶的縫合作用 AATTG C A A T T A A T T DNA聚合酶的作用 都能催化形成磷酸二酯鍵 都是蛋白質(zhì) 不需要 需要 形成完整的重組DNA分子 形成DNA的一條鏈 基因工程 DNA復(fù)制 DNA連接酶與DNA聚合酶的比較 只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上 形成磷酸二酯鍵 在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵 34 DNA連接酶的種類 35 36 2個 4個 1 每連接兩個相同的黏性未端要連接幾個磷酸二酯鍵 2 用限制酶切一個特定基因要切斷幾個磷酸二酯鍵 思考 2 為什么限制酶和DNA連接酶在微生物中能夠分離到 而高等植物和動物中沒有 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵 但是生物在長期的進化過程中形成了完善的防御機制 以防止外來病原物的侵害 限制性核酸內(nèi)切酶就是細菌的防御性工具 當(dāng)外源DNA侵入時 限制性核酸內(nèi)切酶會將外源DNA切割掉 以保證自身的安全 所以 限制性核酸內(nèi)切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 使之失效 從而保護自身的作用 載體的作用 載體的必要條件 載體的種類 閱讀課本第6頁 分子運輸車 運載體 的相關(guān)內(nèi)容 填寫下表 自主學(xué)習(xí)三 1 能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存 2 具多個限制酶切點 以便與外源基因連接 3 具有某些標(biāo)記基因 便于進行鑒定和選擇 4 必須是安全的 對受體細胞無害 5 載體DNA分子應(yīng)大小適中 以便于提取和操作 1 作為運載工具 將目的基因?qū)胧荏w細胞中2 在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制 細菌的質(zhì)粒 由天然的改造而成 病毒 噬菌體衍生物 動植物病毒等 39 基因工程的載體 目的基因 指某些小型DNA分子 能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存 具有多個限制酶切點 每種限制酶切點最好只有一個 具有標(biāo)記基因 便于進行篩選 條件 40 常用的運載體主要有兩類 1 細菌細胞質(zhì)的質(zhì)粒2 噬菌體或某些動植物病毒 有標(biāo)記基因的存在 可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別 有切割位點 能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制 質(zhì)粒 裸露的 結(jié)構(gòu)簡單的 獨立于細菌擬核DNA之外 并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子 最常用運載體 質(zhì)粒 實際上在基因工程操作中 真正被用作載體的質(zhì)粒 都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的 42 質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的裸露的 結(jié)構(gòu)簡單的 雙鏈環(huán)狀DNA分子 現(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細菌 酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子 質(zhì)粒 Plasmids 質(zhì)粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性作用 但復(fù)制只能在宿主細胞內(nèi)完成 43 大腸桿菌的質(zhì)粒 最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒 其中常含有抗藥基因 如四環(huán)素 氨芐青霉素的標(biāo)記基因 復(fù)制的形式 1 獨立自我復(fù)制2 整合到染色體上 隨染色體DNA同步復(fù)制 質(zhì)粒 人工改造的質(zhì)粒 是基因工程最常用的運載體 44 外源基因 45 46 例 已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因 現(xiàn)探討某細菌的質(zhì)粒中有無標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么 請設(shè)計實驗 預(yù)期實驗結(jié)果 并得出相應(yīng)的實驗結(jié)論 對照組 不添加抗生素 實驗組1 添加一定濃度的四環(huán)素 實驗組2 添加一定濃度的氨芐青霉素 實驗組3 添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素 47 既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因 只含有抗四環(huán)素基因 只含有抗氨芐青霉素基因 既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因 48 重組DNA分子的模擬操作 注意 這兩條DNA分子的堿基對不是隨意亂寫的 首先 每個DNA分子上的兩條鏈上的堿基要互補配對 第二 每個DNA分子中每條鏈都存在一個G A A T T C的堿基序列 也就是說是EcoRI限制酶的識別位點 并存在G A的切割位點 49 天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎 為什么 提示 基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒 plasmid 即獨立于細菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制 雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子 是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢 不是作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件 50 1 載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點 以便目的基因可以插入到載體上去 這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置 還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外 這樣才不至于因目的基因的插入而失活 2 載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力 或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制 3 載體DNA必需帶有標(biāo)記基因 以便重組后進行重組子的篩選 4 載體DNA必需是安全的 不會對受體細胞有害 或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去 5 載體DNA分子大小應(yīng)適合 以便提取和在體外進行操作 太大就不便操作 實際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件 都要進行人工改造后才能用于基因工程操作 51 DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎 迄今為止 所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力 至于原因 現(xiàn)在還不清楚 也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶 52 思考 一 質(zhì)粒是基因工程中最常用的運載體 它的主要特點是 1 能自我復(fù)制2 不能自我復(fù)制3 結(jié)構(gòu)很小4 成分是蛋白質(zhì)5 是環(huán)狀DNA分子6 是環(huán)狀RNA分子7 鏈狀DNA分子8 能友好地借居在宿主細胞中二 質(zhì)粒上會存在某些標(biāo)記基因 這些標(biāo)記基因有什么用途 1 3 5 8 便于篩選 識別 三 要想將某個特定基因與質(zhì)粒相連 需要用幾種限制性內(nèi)切酶和幾種DNA連接酶處理 為什么 一種 53 例1 以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段 試分析 GC AATTC GC CTTAACG G CG G 1 其中 和是由一種限制酶切割形成的末端 兩者要重組成一個DNA分子 所用DNA連接酶通常是 2 和是由另一種限制酶切割形成的末端 兩者要形成重組DNA片段 所用的連接酶通常是 平 T4DNA連接酶 黏性 E coliDNA連接酶 54 例2 某科學(xué)家從細菌中分離出耐高溫淀粉酶 Amy 基因a 通過基因工程的方法 將a轉(zhuǎn)到馬鈴薯植株中 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)Amy在成熟塊莖細胞中存在 這一過程涉及A 目的基因進入受體細胞后 可隨著馬鈴薯的DNA分子的復(fù)制而復(fù)制 傳給子代細胞B 基因a導(dǎo)入成功后 將抑制細胞原有的新陳代謝 開辟新的代謝途徑C 細菌的DNA分子較小 可直接作為目的基因 導(dǎo)入受體中不需要整合到馬鈴薯的DNA分子中D 目的基因來自細菌 可以不需要運載體直接導(dǎo)入受體細胞 A 例 限制性內(nèi)切酶 的識別序列和切點是 G GATCC 限制性內(nèi)切酶 的識別序列和切點是 GATC 在質(zhì)粒上有酶 的一個切點 在目的基因的兩側(cè)各有一個酶 的切點 1 請畫出質(zhì)粒被限制酶 切割后所形成的黏性末端 2 請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶 切割后所形成的黏性末端 3 在DNA連接酶作用下 上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接 為什么 可以連接 因為由上述兩種不同限制酶切割后形成相同的黏性末端 或是可以互補的 小試身手 隨堂練習(xí) 1 關(guān)于限制酶的說法中 正確的是 A 限制酶是一種酶 只識別GAATTC堿基序列B EcoRI切割的是G A之間的氫鍵C 限制酶一般不切割自身的DNA分子 只切割外源DNAD 限制酶只存在于原核生物中 答案 C 57 2 以下說法正確的是 A 所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B 質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C 載體必須具備的條件之一是 具有多個限制酶切點 以便與外源基因連接D 基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來 C 58 3 下列不是基因載體具備的條件的是 A 能自我復(fù)制B 有多個限制酶切點C 具有標(biāo)記基因D 它是環(huán)狀DNA D 59 4 有關(guān)基因工程的敘述中 錯誤的是 A DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B 限制性核酸內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C 目的基因須由載體導(dǎo)入受體細胞D 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶 A 60 5 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A 限制酶只在獲得目的基因時才用B 重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C 質(zhì)粒都可作為載體D 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料 D 61 6 基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的 在基因工程操作的基本步驟中 不進行堿基互補配對的步驟是 A 人工合成目的基因B 目的基因與載體結(jié)合C 將目的基因?qū)胧荏w細胞D 目的基因的檢測和表達 C A 7 在將胰島素的基因與質(zhì)粒形成重組DNA分子的過程中 下列哪組是所需要的 同一種限制酶切割兩者 不需同一種限制酶切割兩者 加入適量的DNA連接酶 不需加DNA連接酶A B C D 8 多選 有關(guān)基因工程的敘述中 錯誤的是A 基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀 培育生物新品種B 重組DNA的形成在細胞內(nèi)完成C 目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞D 質(zhì)粒都可作為運載體 答案 BD 9 下列四條DNA分子 彼此間具有粘性末端的一組是A B C D 答案 D 10 下列黏性末端屬于同種內(nèi)切酶切割而成的是 A B C D TCGAGCTTAA AGGTTCCA AGCTTCAG AATTCG 11 下列哪一種酶是基因工程的工具酶A DNA連接酶B DNA酶C RNA酶D 運載體 13 下列說法正確的是 A 限制酶的切口一定是GAATTC堿基序列B 質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C 重組技術(shù)所用的工具酶是限制酶 連接酶 運載體D 利用運載體在宿主細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制的過程可稱為 克隆 14 在基因工程中 切割運載體和含有目的基因的DNA片段 需使用 同種限制酶B 兩種限制酶同種連接酶D 兩種連接酶15 基因工程常用的受體細胞有 1 大腸桿菌 2 枯草桿菌 3 支原體 4 動植物細胞A 3 4 B 1 2 4 C 2 3 4 D 1 2 3 16 如圖為大腸桿菌及質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)模式圖 據(jù)圖回答下列問題 3 氨芐青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上稱為 其作用是 4 下列常在基因工程中用作載體的是 A 蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因B 土壤農(nóng)桿菌中的RNA分子C 大腸桿菌的質(zhì)粒D 動物細胞的染色體 思路點撥 本題通過質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的模式圖考查質(zhì)粒的功能和特點 分析如下 17 2011年北大附中高二檢測 下列關(guān)于DNA連接酶的敘述正確的是 催化相同黏性末端的DNA片段之間的連接 催化不同黏性末端的DNA片段之間的連接 催化兩個黏性末端互補堿基間氫鍵的形成 催化DNA分子兩條鏈的脫氧核糖與磷酸之間磷酸二酯鍵的形成A B C D 嘗試解答 D 18 2011年雅禮中學(xué)高二檢測 基因工程中 須使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒 便于重組和篩選 已知限制酶 的識別序列和切點是 G GATCC 限制酶 的識別序列和切點是 GATC 根據(jù)圖示判斷下列操作正確的是 A 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶 切割B 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶 切割C 質(zhì)粒用限制酶 切割 目的基因用限制