（環(huán)境科學專業(yè)論文）麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響.pdf

bio tr a n s f o r m a tio no fp a raiy tics h ei if is ht o xib sin s h eiifis ha n de f f e c to n it sim m u n es y s t e m a b s t r a c t p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ( p s p ) i sag r o u po fi m p o r t a n tm a r i n eb i o t o x i n s p r o d u c e db yt h eh a r m f u ld i n o f l a g e l l a t e e a t i n gp s pc o n t a m i n a t e ds e a f o o dc a r lc a u s e h u m a np o i s o n i n g p s pt o x i n sc a na l s ob es e r i o u sp o l l u t i o no ff i s h e r y r e s o u r c e s ， c a u s e i n gh u g ee c o n o m i cl o s s e st ot h es h e l l f i s hm a r i c u l t u r e i nr e c e n ty e a r s ，p s p sn e w c o m p o u n d sm 1 一m 4i sd e t e c t e di ns o m eo ft h et o x i c d i n o f l a g e l l a t ec o n t a m i n a t e d s h e l l f i s hs a m p l e s i ti sk n o w nt h a tt h et o x i n - p r o d u c i n gd i n o f l a g e l l a t e sd on o tp r o d u c e s u c hc o m p o u n d s ，i n d i c a t i n gt h a tt h e s ec o m p o u n d sm a yb et h em e t a b o l i t e so rc h e m i c a l d e g r a d a t i o np r o d u c t si n t h e p r o c e s so fp s pd e t o x i f i c a t i o ni ns h e l l f i s h t h em c o m p o u n d sa l s od e t e c t e di nt h es c a l l o p ( p a t i n o p e c t e ny e s s o e n s i s ) a n dc l a m ss a m p l e s c o l l e c t e df r o mt h en o r t h e my e l l o ws e ai no u rc o u n t r y t h e r e f o r ei th a s g r e a t s i g n i f i c a n c et oi n v e s t i g a t et h eb i o t r a n s f o r m a t i o np r o c e s sa n dv a r i a t i o no ft h ei m m u n e s y s t e ma c t i v i t ya f t e rs h e l l f i s ha c c u m u l a t ep s pt o x i n s ，f o rr e v e a l i n gt h ed e t o x i f i c a t i o n o fs h e l l f i s hp s pt o x i nm e c h a n i s m i nt h i ss t u d y , t h ef o o dc h a i no f s c a l l o p sa n dm u s s e l se a t i n ga l e x a n d r i u m t a m a r e n s e ( p r o d u c i n gp s pt o x i n s ) a r es i m u l a t e di n d o o r s t h ea c t i v i t yo fr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) a n dg l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e ( g s h - p x ) i nt h es h e l l f i s hd i g e s t i v eg l a n d a n dm u s c l et i s s u e sa r e m o n i t o r e d a tt h es a m et i m et h et r a n s f o r m a t i o np r o c e s so ft h et o x i n si nt h es c a l l o p t i s s u ed u r i n gt h es h e l l f i s ha c c u m u l a t ep s pt o x i n si sm o n i t o r e du s i n gl c - m s m s m e t h o di no r d e rt oe x p l o r et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et r a n s f o r m a t i o no ft o x i na n d t h ea c t i v i t yo ft h ei m m u n es y s t e mr e s p o n s ed u r i n gt h e p r o c e s so f s h e l l f i s h a c c u m u l a t i o np s pt o x i n a c c u m u l a t et h ed a t af o rr e v e a l i n gp o s s i b l es h e l l f i s hp s p t o x i nd e t o x i f i c a t i o nm e c h a n i s m t h er e s u l ts h o w st h a tt h e f e e d i n g p r o c e s so fs c a l l o p sa n dm u s s e l sw i t h t o x i n - p r o d u c i n gd i n o f l a g e l l a t e sc a np r o d u c er o so x i d a t i v ed a m a g e ，l e a d i n gr o s c o n c e n t r a t i o nr i s e t h ea n t i o x i d a n ts y s t e mo fs c a l l o p sa n dm u s s e l ss h o wc e r t a i n d i f f e r e n c e si nt h ep r o c e s so fr e m o v a lt h er o s ，i n c l u d i n gt h es o da c t i v i t yo fs c a l l o p t i s s u ei si n h i b i t e d ，b u tt h ed i g e s t i v eg l a n dt i s s u ew i t hh i g hc a ta c t i v i t y , w h i c hc a l l b eu s e dt oc l e a ru pt h eh 2 0 2i nt h eb o d y ；h o w e v e rt h es o da n dc a te n z y m e a c t i v i t i e so fm u s s e l st i s s u ea l ea c t i v a t e d ，e f f e c t i v e l ys c a v e n g i n gs u p e r o x i d ea n i o n f r e er a d i c a la n dh 2 0 2 t h eg s h p xa c t i v i t yo fs c a l l o pa n dm u s s e l st i s s u ei sa l s o a c t i v a t e db yr o s a n dt h ev a r i a t i o na n dt h e v a r i a t i o nr a n g eo ft h ea c t i v i t y a r e s i m i l a r i t y , m a yr e s t r i c t b yt h ep r o c e s so fg l u t a t h i o n ed e p l e t i o n a n dr e g e n e r a t i o n t o x i na n a l y s i sr e s u l t ss h o wt h a t ，a f t e rs c a l l o pf e e d i n gw i t hal e x a n d r i u mt a m a r e n s e ， p s pt o x i n sc a nr a p i d l ya c c u m u l a t e di nt h es c a l l o pd i g e s t i v eg l a n dt i s s u e ，b u tp s p t o x i n sa l en o td i s t r i b u t e di n t ot h em u s c l et i s s u ed u r i n g9 6h o u r se x p o s u r ea n d7 2 h o u r sd e t o x i f i c a t i o n p s pt o x i n si nt h es c a l l o p st a k eb i o t r a n s f o r m a t i o na n dp r o d u c t l o wt o x i cm e t a b o l i t e sm 1 ，m 3 ，m 5 ，m 7 a n dm 9 ，s h o w st h a tt h ec 一11b i to fc l 2 a n d c 3 4t o x i ni sm o r ep r o n e dt ot h es u l f a t i o nr e a c t i o n k e y w o r d s ：p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ；r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ；s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ；c a t a l a s e ；l c - m s m s 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 u 刖舌 隨著我國工農業(yè)的蓬勃發(fā)展，國民生活水平的提高，大量含有氮磷等營養(yǎng)元 素的工業(yè)廢水、農業(yè)廢水和生活污水直接或間接經由河流排入大海，海洋藻類在 在這些營養(yǎng)元素充足的情況下，迅速地生長，從而引發(fā)赤潮，對海洋生態(tài)環(huán)境造 成了嚴重的破壞。同時，沿海水產養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模和養(yǎng)殖強度的不斷提高，更加劇了 這一污染過程。 近年來，有毒赤潮在全球范圍內頻繁爆發(fā)，赤潮毒素的研究成為赤潮研究的 熱點之一。有毒甲藻赤潮所占比例和發(fā)生頻率逐年增加，嚴重威脅海洋生態(tài)安全 和人類健康，給世界經濟帶來巨大損失。在世界各地已報道的4 0 0 0 種微藻中能 引發(fā)赤潮的種類有3 3 7 種，大約占微藻總數的8 ，其中甲藻門( p y r r o p h y t a ) 種 類最多共1 8 4 種，占赤潮生物總種數的5 5 左右；已知能夠產生毒素的赤潮藻約 有7 6 種，其中有毒甲藻5 7 種，占有毒赤潮種類總數的7 5 ( 梁珊，2 0 0 7 ) 。海 洋濾食性貝類通過濾食有毒藻類累積藻毒素，并沿食物鏈向高營養(yǎng)級傳遞，導致 高營養(yǎng)級的生物及人類中毒，嚴重的可致死亡。貝類毒素和西加毒素是最重要的 海洋藻類毒素。到目前為止，人們將主要的貝類毒素分為五種，它們分別是：麻 痹性貝毒( p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，p s p ) 、記憶缺失性貝毒( a m n e s i cs h e l l f i s h p o i s o n i n g ，a s p ) 、腹瀉性貝毒( d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，d s p ) 、神經性貝 毒( n e u r o t o x i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，n s p ) 以及原多甲藻酸毒素( a z a s p i m c i d p o i s o n i n g ，a z p ) ( l i n d a h l ，1 9 9 8 ) 。近二十多年來，有害赤潮的頻率、強度和地 理分布有所增加，同時在海洋食物鏈中發(fā)現的毒素的數量也在不斷增加。加拿大、 美國、日本、西班牙、挪威、荷蘭、瑞典和智利等世界上多個沿海國家和地區(qū)都 發(fā)生過大大小小的貝類中毒事件，我國沿海從南至北均有p s p 和d s p 污染的貝 類分布( 李偉才，2 0 0 0 ) 。在全球由藻毒素引起的中毒事件中，8 7 是由麻痹性 貝毒素( p s p ) 引起的。世界上許多國家己將麻痹性貝毒作為貝類主產區(qū)的常規(guī) 監(jiān)測項目，并建立或提出相應的規(guī)定。多數國家將貝類產品中p s p 含量限制在 8 0 嶺s t xe q 1 0 0 9 或4 0 0m u 1 0 0 9 貝軟體組織以下，我國也執(zhí)行這一標準。 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 1 文獻綜述 1 1 麻痹性貝毒的種類及來源 麻痹性貝類毒素( p s p ) 是最常見，危害最大的由食用海產品引起人體中毒 的貝類毒素類型之一。麻痹性貝毒是一類由甲藻產生的四氫嘌呤類物質，早在 1 0 0 多年以前，人們就開始研究p s p 毒素的分離，但是由于其復雜的成分組成， 導致研究進展緩慢。致病毒素最先是從石房蛤( s a x i d o m u sg i g a n t e u s ) 體內分離 得到的，被稱為石房蛤毒素( s a x i t o x i n ，s t x ) 。在1 9 7 5 年，科學家們第一次合成 s t x 的結晶衍生物并對s t x 的結構進行了研究，并通過x 一射線晶體學和核磁共 振( n m r ) 的光譜研究，對s t x 的結構進行了鑒定( b o w e re ta 1 ，1 9 8 1 ) 。到目 前為止，共發(fā)現了約3 0 余種s t x 的衍生化合物，它們的化學結構如圖1 1 所示 ( 李愛峰，2 0 0 5 ) 。p s p 毒素是一類密切相關的化合物，主要由四組組成：( 1 ) 氨基甲酸酯類( s t x 、n e o s t x 、g t x l 。4 ) ；( 2 ) 脫氨甲?；? d e s t x 、d c n e o s t x 、 d c g t x l 4 ) ；( 3 ) n 磺酰氨甲?；? b 1 或g t x 5 、b 2 或g t x 6 、c 1 4 ) ：( 4 ) 脫氧脫氨甲?；? d o s t x 、d o g t x 2 、d o g t x 3 ) ( 李愛峰，2 0 0 5 ) 。另外，還有 n 一羥基衍生物( h y s t x 、h y n e o ) ，安息香酸鹽衍生物( g c l 6 ) ( v a l ee ta l + ，2 0 0 9 ) ， 以及d e l l a v e r s a n o 等人應用液相色譜質譜聯(lián)用( l c m s ) 技術，在塔瑪亞歷 山大藻( a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) 赤潮( 7 1 0 5c e l l s l ) 污染的貽貝樣品( m y t i l u s e d u l i s 和mt r o s s u l u s ) 中檢測到p s p 的五種新型代謝產物( m 1 m 5 ) ，化學結構 如圖1 2 所示：1 1 一p 羥基_ n 2 l 一磺酰氨甲?；鵶 t x ( m 1 ) 、1 1 d 羥基s t x ( m 2 ) 、 1 1 ，1 1 二羥基- n 2 1 磺酰氨甲?；籹 t x ( m 3 ) 和1 1 ，1 1 二羥基s t x ( m 4 ) ，m 5 與m 1 分子量相同，但由于樣品量限制未能確定m 5 的結構( d e l l a v e r s a n oe ta 1 ， 2 0 0 8 ) 。 麻痹性貝類毒素是由甲藻和藍綠藻的一些株系產生的。能夠產生p s p 毒素 的甲藻主要有膝溝藻屬( g o n y a u l a x ) 、亞力山大藻屬( a l e x a n d r i u m ) 、裸甲藻屬 ( c y m n o d i n i u m ) 、原甲藻屬( p r o r o c e n t r u m ) 等。其中膝溝藻屬中的藻珠有g t a m a r e n s i s 、g c a t e n e l l a 、g a c a t e n e l l 、g “c 口1 ，口幻、g c o h o r t i c u l a 、g m o n i l a t a ( 鄒仁林，1 9 9 7 ) ；亞歷山大藻屬中的藻株有鏈狀亞歷山大藻a c a t e n e l l a 、塔瑪 亞歷山大藻a t a m a r e n s e 、a a c a t e n e h 、股狀亞歷山大藻a c o h o n i c u l a 、a f u n d y e n s e 、 聯(lián)體亞歷山大藻a f r a t e r c u l u s 、微小亞歷山大藻a m i n u t u m ；裸甲藻屬中的g 2 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 c a t e n a t u m 等。除此之外還有一些藻比如鏈狀裸甲藻( g y m n o d i n i u mc a t e n a t u m ) 以及巴哈馬梨甲藻( p y r o d i n i u mb a h a m e n s e ) 等也可以產生p s p 毒素( 李愛峰， 2 0 0 5 ) 。 p s p 毒素的分子量很低，呈堿性，分子極性大，易溶于水，可溶于乙醇、甲 醇，不溶于非極性溶劑，除n 一磺酰氨甲?；惗舅刂猓渌亩舅卦谒嵝詶l 件下耐熱穩(wěn)定，在堿性條件下容易被氧化( 田華，2 0 0 9 ) 。p s p 毒素的結構在常 溫下相對比較穩(wěn)定，但是其中的一些基團也會發(fā)生變化，如c 1 1 位羥基磺酸鹽 基團可以發(fā)生空間異構化，在有毒藻中大量存在的b 異構體在貝類組織內可以轉 變成更加穩(wěn)定的i f , 異構體，穩(wěn)定后q 、b 異構體的比例趨于3 ：1 ( 田華，2 0 0 9 ) 。 麻痹性貝類毒素的毒性作用十分類似于河豚毒素。s t x 和t 1 ) ( 都能夠有選 擇性地與高親和力受體結合，從而阻斷電壓門控鈉離子通道。電壓門控鈉離子通 道是一個分子量大約有2 5 0k d 的蛋白質，均勻分布在興奮細胞的細胞膜上，具 有鈉離子選擇性的特點。大多分布于所有哺乳動物的神經、骨骼肌纖維和大多數 心臟的肌肉纖維。在安靜狀態(tài)下，細胞處于膜內高k + 膜外高n a + 狀態(tài)，當細胞 受到刺激后n a + 快速內流產生動作電位，進而在神經細胞上開始傳播，當s t x 和其他一些麻痹性貝類毒素進入體內后，阻斷電壓門控鈉離子通道，從而減緩或 取消動作電位的傳播。目前，p s p 的7 ，8 ，9 位的胍基已被確定具有參與阻斷作 用功能，c 1 2 位的羥基也發(fā)揮重要的作用( m o n se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。因p s p 毒素是水 溶性的，當食用含有p s p 的產品后，p s p 可以通過口腔粘膜迅速進入人體，在 3 0 分鐘內，使得嘴唇周圍產生刺痛感和麻木感，隨后這種感覺很快傳至臉和頸 部。人們通常會感到四肢麻木，呼吸困難，心跳加快，全身軟弱無力，并產生頭 疼、眩暈、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，有時還會出現短暫的失明，嚴重者導致身 體癱瘓，窒息而亡等( 李愛峰，2 0 0 5 ) 。 p s p 毒素各種衍生物之間的毒性大小有很大的差異，它們的毒性大小與其結 合n a + 通道位點的牢固程度密切相關，它們的的毒性大小( 如表1 1 所示) ：n 磺酰氨甲?；惗舅囟拘宰畹停浯问敲摪奔柞；惗舅?，氨甲?；惗舅氐亩?性最強。s t x 的毒性很強，和其他動物如魚類、爬行類相比，小鼠對p s p 更為 敏感，給小鼠進行靜脈注射的半致死劑量為2 4 - 3 4 g k g ( a u n e e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在 阿拉斯加，p s p 毒素曾導致一位漁民死亡，從患者胃容物里檢測到的p s p 的濃度 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 為3 7 0l a gs t xe q 1 0 0 9 ( m o n se t 口，1 9 9 8 ) 。n 一磺酰氨甲酰基類毒素毒性較低， 但是在p h 較低的環(huán)境下，例如在胃里，容易轉化成其他毒性更高的甲酰基類毒 素。最近人們在有毒甲藻赤潮污染的貽貝、歐洲鳥尾蛤、溝紋蛤仔等貝類體內發(fā) 現的m 1 m 5 的毒性很低( 依據毒素的構一效關系推測) ，推測這些新成分是p s p 在貝體內的代謝產物或降解產物，它們的形成很可能是貝類自身的一種重要解毒 途徑。因此，研究這些低毒代謝產物的形成機制，可為貝類快速脫毒技術的開發(fā) 提供新方向，同時也可為p s p 解毒劑的研發(fā)提供新思路。 n 鴨 圖1 1 麻痹性貝毒的結構式 f i g 1 1s t r u e t u r eo f p a r a l y t i es h e l l f i s hp o i s o n i n g o r ，r 2 s 。3 + h m 1 d1 1 燦y d r o x y - n 2 1 一s u i 瞅篇怕m w l s a x i l o x i n hh 褂雒1 1 卜時帥妒的x 帖n s o a o h m 3 1 1 l d i h y c l r o x y n 2 1 s u i b 由目m o y k 培一嘣輛 ho h m 411 11 - c l i 1 i y o r o x y - s a x i t o x m 圖1 2m 1 一m 4 的化學結構 f i g 1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so fm l m 4 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 表1 1 麻痹性貝毒的種類與毒性 t a b l e1 - 1a n a l o g u e sa n dt o x i c i t yo fp a r a l y t i es h e l l f i s hp o i s o n i n g 毒性 r 1勉粥r 4 毒素 分子量 ( m u p m 0 1 ) hhh s t x2 1 0 0 3 0 1 0 hhh n e o s t x2 3 0 0 3 1 7 o hh o s 0 3 一g t x l 1 9 0 0 4 1 2 hh o s o ，一 g t x 2 1 0 0 03 9 6 o c o n h 2 h o s 0 3 h g t x 3 1 6 0 03 9 6 o h o s 0 3 hg t x d1 9 0 0 4 1 2 hho h1 1 a 一0 h s t x3 1 7 h o h h11 - 1 3 o h s t x3 1 7 hhh b k g t x s ) 1 5 03 8 0 o hhh b 2 ( g t x 6 ) 1 5 03 9 6 o hh o s 0 3 一c 3 4 7 6 o c o n h s 0 3 hh 0 8 0 3 c l 1 74 9 2 h o s 0 3 h c 2 2 5 84 7 6 o h o s 0 3 h c 4 4 9 2 hhhd c s t x9 0 0 2 5 8 o h hhd c n e o s t x9 0 02 7 4 o hh o s 0 3 一d c g t x i 9 5 03 6 9 o h hho s o ，d c g t x ，3 8 03 5 3 h o s 0 3 h d c g t x 3 3 8 03 5 3 o h o s 0 3 hd c g t x 49 5 03 6 9 hhho c o n h o h h y s t x 3 1 7 5 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 o h h h h y n e o s t x 3 3 3 hhhd o s t x2 4 2 h h o s 0 3 一 h d o g t x 2 3 3 7 h o s 0 3 h d o g t x 3 3 3 7 1 2 麻痹- i 生貝毒的生物轉化過程研究 近年來，隨著沿海水產養(yǎng)殖產業(yè)的不斷發(fā)展，麻痹性貝毒在全球的分布范圍 不斷擴大。1 9 7 0 年，僅在歐洲，北美從和日本的溫帶水域發(fā)現產生p s p 的甲藻。 到1 9 9 0 年時，p s p 的分布擴展到整個南半球包括南非、澳大利亞、印度、泰國、 文萊、馬來西亞、菲律賓等國家( h a l l e g r a e f f ，1 9 9 3 ) 。給人類健康和海洋生態(tài)環(huán) 境帶來嚴重的威脅。因此，科學家們開展了許多關于p s p 毒素在海洋雙殼貝類 體內生物轉化過程的研究。 在雙殼貝類濾食的過程中，有毒藻細胞和孢子首先被運送到食道和胃里，然 后在胃里發(fā)生消化作用，p s p 毒素被釋放出來，進入其他消化器官。研究發(fā)現， 不同種貝類對p s p 的累積和排出情況差別很大，暴露在相同的毒性環(huán)境下，雙 殼類體內毒素含量的變化與自身個體的大小有關。由于細胞每單位生物量的攝食 率更大，小的個體單位重量的組織獲得更多的毒素。b r i e e l j 和s h u m w a y ( 1 9 9 8 ) 根據以往研究，認為貝類對p s p 貝毒的敏感性及毒素累積能力的差異主要體現 于2 個方面：一是對s t x 的神經抵抗性：二是攝食及其他行為反應以及能夠累 積達到的最大毒性。根據貝類的解毒動力學，人們將雙殼類貝類分為兩大類( 如 表1 - 2 ) ：慢速排毒者和快中速排毒者等( a n d r i n o l oe ta 1 ，1 9 9 9 a ) 。 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 表1 - 2 雙殼貝類根據毒素排出速率分類表( a n d r i n o l oe ta 1 ，19 9 9 a ) t a b l e1 2c l a s s i f i c a t i o no fb i v a l v es p e c i e sb a s e do nt h e i rr a t e so fd e t o x i f i c a t i o n 在一次赤潮爆發(fā)的初期，首先在貝類的內臟發(fā)現大部分的毒素，特別是在胃 腸道部位，毒素濃度最高( b r i c e l je ta 1 ，1 9 9 8 和l e h a n e ，2 0 0 0 ) 。在我國，朱明 遠( 2 0 0 3 ) 等研究發(fā)現，櫛孔扇貝對麻痹性貝毒有很強的累積能力，僅在攝食微 小亞歷山大藻4 8h 后，內臟中毒素累積就高達5 0 0 0l x gs t xe q 1 0 0 9 貝軟體組 織。扇貝內臟的毒性占據了整個扇貝體內總毒性的9 7 以上，鰓、外套膜其次， 毒性最小的是足和閉殼肌。顏天等( 2 0 0 1 ) 發(fā)現紫貽貝攝食塔瑪亞歷山大藻以后， 內臟是p s p 的主要累積部位，并且p s p 在紫貽貝體內發(fā)生一系列的變化，停止 喂食后，紫貽貝可以通過白凈作用排除毒素，在8 天實驗結束時，p s p 毒素共排 出了約5 0 。楊美蘭( 1 9 9 0 1 9 9 2 ) 用小白鼠生物檢測法檢測了廣東沿海各種貝類體 內不同組織器官中的p s p 毒性分布。結果發(fā)現，貝體中毒性最高部分是消化腺， 較低部分是外套膜。聶利華( 2 0 0 3 ) 研究發(fā)現廣州市黃沙水產品批發(fā)市場的所有 檢測樣品中，消化腺中的毒素含量及檢出率明顯高于貝類中的其它軟組織。 許多研究者都對雙殼貝類不同組織的毒性進行了報道，研究表明，閉殼肌累 積p s p 毒素很低。例如海灣蛤s p i s u l as o l i d i s s i m a ( b l o g o s l a w s k ie ta 1 ，1 9 7 8 ) ； 麥哲倫海扇貝p l a c o p e c t e n ma g e l l a n i c u s ( s h i m i z ue ta 1 ，19 81 ：s h u m w a ye ta l ， 7 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 1 9 8 7 ) ；以及硬殼蛤m e r c e n a r i a me r c e n a r i e s ( b f i c e l je ta l ，1 9 9 1 ) 。但是h i n n i t e s g i g a n t e u s 體內的p s p 毒素含量達2 0 0 0m gs t xe q 1 0 0 9 組織。盡管不同的種類 和組織之間p s p 毒素的含量有差異，消化腺，外套膜，性腺和鰓等都可以累積 一定量的毒素，同時各種組織中的毒性水平也會隨季節(jié)改變而變化( s h u m w a ye t a 1 ，1 9 8 8 ) 1 2 1 麻痹性貝毒在貝類體內的轉化機制的研究 當毒素被貝類吸收后，會在貝類體內發(fā)生一系列的轉變。在使用僅產生 g t x l 4 和n e o s t x 的a c a t e n e l l a 喂養(yǎng)無毒的奶油蛤( p l a c a m e nc h l o r o t i c a ) 的 實驗中發(fā)現，在過了8 3 天后，在奶油蛤體內檢測到了s t x ，因此人們推斷s t x 可能是由g t x l 4 或n e o s t x 轉化而來( m o n se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。還有很多科學家都 做了相似的報道。 目前，對貝類p s p 毒素的生物轉化機制的認識還非常有限，前期的研究主 要是針對常見的三大類毒素。從研究結果來看，p s p 毒素化學結構的變化類型主 要包括： 1 ) 貝類體內的化學轉化。 貝類的胃酸環(huán)境和天然還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸等會引起p s p 在體內 發(fā)生還原反應。c 1 l 位原子上0 s 0 3 - 發(fā)生羥基化或羥基硫酸鹽化作用，并發(fā) 生空間異構化轉變，如g t x 3 可轉化為g t x 2 ；n 磺酰氨甲酰基能夠水解生 成氨基甲酸脂類毒素，如c 2 可轉化為g t x 2 ：c 1 、c 2 可轉化為d c 類毒素 等；部分n o h 毒素還可以被還原成為n h 毒素( f f j 華，2 0 0 9 ) 由于貝體 內天然還原劑如半胱氨酸或谷氨酸的作用，有的貝類還伴有c 1 1 位o s 0 3 基團消去( 鄒迎麟，2 0 0 0 ) 。 2 1 貝類體內酶促轉化。 氨甲?；被崴饷冈趐 s p 毒素結構轉化過程中具有重要的催化作 用( a r t i g a se ta 1 ，2 0 0 7 ) 。水解酶可催化n 一磺酰氨甲酰基類毒素部分水解而 生成脫氨甲?；惗舅兀琹 i n 和c h o 等從中國蛤蜊( m a c t r ac h i n e n s i s ) 分離 純化獲得了一種氨甲?；被崴饷福纱呋痳 4 基團中氨甲?；蚽 一磺 酰氨甲酰基發(fā)生水解。a r t i g a s 和v a l e 等發(fā)現在堅固馬珂蛤( s p i s u t as o l i d a ) 中同樣存在較強的氨甲酰基氨基酸水解酶活性。 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 磺基轉移酶在p s p 毒素的磺化過程中也發(fā)揮重要作用。從鏈狀裸甲藻中 分離純化的n 磺基轉移酶可將硫酸基團從3 一磷酸腺苷5 磷酸硫酸酯( p a p s ) 轉移到s t x 和g t x 2 3 的n 2 1 位氨甲?；鶊F，分別生成b l 和c 1 2 ；o 磺基轉移酶可將硫酸基團轉移到1 1 - a ，d - o h s t x 的o 2 2 位羥基，生成 g t x 2 3 ( s a k oe ta 1 ，2 0 01 ；y o s h i d ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。除此之外，人們在塔瑪亞 歷山大藻和鏈狀裸甲藻兩種藻中也檢測到兩種影響p s p 毒素生物合成的酶 n 磺基轉移酶和n 氧化酶，n 磺基轉移酶可以將g t x 2 3 轉化為c 1 、c 2 ； n 氧化酶可以將g t x 2 3 轉化為g t x l 4 ( 鄒迎麟，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 麻痹性貝毒在貝類體外轉化機制的研究 在國外，人們用人肝臟微粒體的離體培養(yǎng)實驗，直接證明了g t x 3 2 通過生 物轉化在n 1 位發(fā)生氧化作用生成g t x 4 1 的過程( g a r c i ae ta 1 ，2 0 0 9 ) 。同時也 證明了n e o s t x 、g t x 3 2 和s t x 等在微粒體u d p 刪a d p h 存在的條件下發(fā) 生連續(xù)的氧化和葡萄糖醛酸結合反應，發(fā)生部位分別在n 1 位和c 1 2 羥基( g a r c i a e ta 1 ，2 0 1 0 ) 。貝類組織攜帶的細菌也能夠參與p s p 的轉化和排除過程，具有脫 氨甲酰基和硫酸鹽化作用，且不同的菌群具有不同的轉化能力( s m i t he ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 研究發(fā)現細菌提取物將g t x s 向s t x s 轉化是因為谷胱甘肽在起作用( s a k o m o t o e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，而有些細菌的轉化作用也是歸因于體內特有的酶。 1 3 麻痹性貝毒的分析方法 由于p s p 對人類和其它生物有極高的危險，因此，需要一種快速、敏感、 專一的方法來檢測貝類體內的p s p 毒素以保證食品安全。目前我國對p s p 的調 查分析通常使用最多的是傳統(tǒng)的小鼠生物測試法( m b a ) 和高效液相色譜法 ( h p l c ) ，然而，用哺乳動物進行生物測試引起許多爭議，同時哺乳動物測試的 局限性使得科學家們更努力的尋求其他的檢測方法。近二十年來，隨著液質聯(lián) 用技術的迅速發(fā)展，使用l c m s 分析p s p 毒素已成為研究領域的熱點。大量的 研究證明，使用l c m s 不僅可以準確分析海洋微藻和貝類體內的各種p s p 毒 素，還可以及時有效地對水產養(yǎng)殖產業(yè)中貝類產品受p s p 毒素污染的情況進行 監(jiān)測( 李愛峰，2 0 0 5 ) 。本文通過建立l c m s m s 分析p s p 毒素的分析方法，對 塔瑪亞歷山大藻和蝦夷扇貝累積p s p 毒素后組織內的毒素成分進行分析比較， 研究p s p 毒素在蝦夷扇貝體內的生物轉化過程并探討m 類低毒新型代謝產物的 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 形成機制。 1 3 1 生物測試方法 1 1 生物體內測試法 目前，小鼠生物測試法( m o u s eb i o a s s a y ，m b a ) 仍然是一種分析測試樣品 體內p s p 毒素的常用方法。小鼠腹腔注射檢測p s p 毒素的方法已經發(fā)展了多半 個世紀，是1 9 3 7 年由s o m m e r 和m a y e r 建立的，現在已成為美國分析化學協(xié)會 ( a s s o c i a t i o no f f i c i a l a n a l y t i c a lc h e m i s t s ，a o a c ) 規(guī)定的標準分析方法 ( h o l l i n g w o r t ha n dw e k e l l ，19 9 0 ) 。給一只體重為2 0g 的雄性小鼠注射1m l 貝 類組織的酸性提取液，并記錄小鼠的死亡時間。對于毒性較高的樣品，先進行稀 釋，使小鼠的死亡時間控制在5 1 5 分鐘。樣品中毒素毒性根據毒素的毒性值換 算出相當于s t x 毒性大小的當量值，用小鼠單位來表示。l 鼠單位( m u ) 定義 為一只體重為2 0g 的i c r 品系的雄性小鼠殺死的毒性，lm u = 0 1 8p gs t x 。大 多數國家將貝類體內的p s p 閾值規(guī)定為4 0 0m u 1 0 0g 貝類軟組織，這也是聯(lián)合 國衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農組織推薦的標準。小鼠生物測試方法的檢出限為2 0 g s i xe q 1 0 0g 貝軟體組織。由于樣品的含鹽量比較高，從而會降低毒素的毒性 值( s c h a n t ze ta 1 ，1 9 5 8 ) ，而且，據a u n e1 9 9 8 年報道，牡蠣體內積累的z n 元 素對小鼠有致死作用，從而導致p s p 毒素的分析結果偏高( a u n e ，1 9 9 8 ) 。同時 p s p 毒素提取物也容易給出假陽性的測試結果( p a r ke ta t ，1 9 8 6 ) 實際操作過程中，該方法有以下幾個缺點：小鼠的體重必須控制在1 9g 2 2g ， 日益增長的監(jiān)測需求會導致小鼠供應不足；該方法的檢出限偏高，專一性差，靈 敏度不高；致死劑量與小鼠的死亡時間之間不呈線性關系；準確的測定死亡時間 需要耗費很長的時間，消耗大量人力：使用大量活體脊椎動物進行實驗越來越受 到動物保護人士的譴責等。 2 ) 體外組織培養(yǎng)法 利用p s p 毒素能對n a 十通道產生特異阻滯作用，破壞細胞功能這一機制， 建立了一種體外檢測p s p 的方法。p s p 毒素與神經細胞的細胞膜上的n a + 結合， 擾亂了細胞正常的去極化作用。兩者的結合量是與p s p 的毒性成正比。 小鼠神經母細胞瘤暴露在藜蘆堿和哇巴因下時，細胞膜外的鈉離子會大量涌 入細胞內，從而使細胞發(fā)生腫脹作用，并晟終裂解。當可以阻斷鈉通道的s t ) ( 1 0 麻痹性貝毒在貝類中的生物轉化及其對機體免疫系統(tǒng)的影響 存在時，其他兩種化合物的作用被抑制，細胞保持正常形態(tài)。在這種方法中，免 受哇巴因與藜蘆堿損傷作用的細胞數量與s t x 及其類似物的濃度成正比。j e l l e t t 等人1 9 9 2 年改進了該方法，他們使用酶標儀自動測定神經母細胞瘤細胞，不再 需要對單個細胞進行計數，就能確定s t x 的毒性大小，從而提高其測定速度， 更加方便。該方法的檢出限達到2 0m gs t xe q 1 0 0g 貝組織。用1 0 種甲藻的 酸性提取物和4 7 個貝類樣品的提取物將該組織培養(yǎng)法和小鼠生物測試法進行了 比較，發(fā)現兩種測試方法的結果幾乎相同，不過，組織培養(yǎng)法比小鼠生物測試法 更為敏感。從原則上看，神經母細胞瘤細胞檢測方法可能是一個很好的替代小鼠 生物測試p s p 毒素的方法，但是，在1 9 9 9 年美國分析化學家協(xié)會( a o a c ) 對 該方法進行檢測時并沒有取得很好的結果。同時，研究材料的裝運也是影響該方 法發(fā)展的一個重要問題。 1 3 2 酶聯(lián)免疫吸附技術( e n z y m e 1 i n k e di m m t m o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗( e n z y m e 1 i n k e di m m t m o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 法利 用抗原抗體反應，越來越多的被用于各種化合物的檢測。c h u 和f a n ( 1 9 8 5 ) 建立 了檢測p s p 毒素的方法。使用牛血清白蛋白做成一個s t x 抗原，注射到兔子體 內，將兔子機體產生抗體收集起來并凍干。在測試時，酶標板上涂有抗原，將s t x 標準或貽貝提取物和適當稀釋的抗體加進系統(tǒng)。s t x 與抗體競爭結合酶標板上 的抗原，用比色法對結合的抗體進行定量進而得出s t x 的量。近些年來，商業(yè) e l i s a 檢測s t x 毒素的試劑盒已經上市( 如r - b i o p h a r m 的r i d a s c r e e n r ； s a x i t o x i nt e s t r ) ，但是該方法還未經美國分析化學家協(xié)會( a o a c ) 確認為 標準測試方法。在我國，也有研究人員使用商業(yè)化的試劑盒分析檢測p s p 毒素 ( 張紋等，2 0 0 6 ) 。c h u 等人使用e l i s a 技術比較分析了大量受污染的貝樣品， 發(fā)現e l i s a 數據和小鼠生物檢測法的結果十分一致( c h u ，1 9 9 6 ) 。c e m b e l l a 和 l a