（勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)專業(yè)論文）納米tio2光催化產(chǎn)物的皮膚毒性研究.pdf

腳| l | f | f f f l | | j i i | i l i f | l f f i f i f | | i | | i i | y 17 613 81 p h o t o c a t a l y t i ct o x i c i t y s t u d i eso ns nw i t ht i t a n i u m d i o x i d e at h e s i ss u b m i t t e dt o s o u t h e a s tu n i v e r s 時(shí) f o rt h ea c a d e m i c d e g r e eo f m a s t e ro fm e d i c i n e b y z h a n g x u e y a n s u p e r v i s e db y p r o f e s s o ry i nl i h o n g s c h o o lo fp u b l i ch e a l t h s o u t h e a s tu n i v e r s 時(shí) 僵a y2 0 1 0 東南大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。 盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫 過的研究成果，也不包含為獲得東南大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝 意。 研究生簽名：毒靴日 期：業(yè) 東南大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)聲明 東南大學(xué)、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所、國家圖書館有權(quán)保留本人所送交學(xué)位論文的復(fù)印 件和電子文檔，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。本人電子文檔的內(nèi)容和紙 質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。除在保密期內(nèi)的保密論文外，允許論文被查閱和借閱，可以公布( 包 括刊登) 論文的全部或部分內(nèi)容。論文的公布( 包括刊登) 授權(quán)東南大學(xué)研究生院辦理。 研究生簽名：孛齜導(dǎo)師簽名 中文摘要 納米二氧化鈦光催化產(chǎn)物對皮膚毒性的研究 研究生：張學(xué)艷導(dǎo)師：尹立紅 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 中文摘要 納米t i 0 2 因其具有屏蔽紫外線、消色力高、遮蓋力強(qiáng)等諸多優(yōu)異性能，廣泛應(yīng)用于化 妝品中，成為重要的無機(jī)添加劑。但是研究發(fā)現(xiàn)，納米t i 0 2 可吸收紫外輻射產(chǎn)生光催化活 性，生成具有高度化學(xué)活性的羥基自由基( o h ) ，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。近年來的研究表 明，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并能激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)m m p 的表達(dá)，同時(shí)抑制膠原合成，誘導(dǎo)m d a 合成、細(xì)胞膜彈性下降，導(dǎo)致光老化皮膚特征性的 改變。 為探討納米t i 0 2 光催化產(chǎn)物可能引發(fā)的皮膚損害，本研究選用對細(xì)胞和機(jī)體確定無損 傷劑量的u v a ( 3 6 5 m ，細(xì)胞試驗(yàn)照射劑量為5 j c m 2 ，動(dòng)物試驗(yàn)照射劑量為1 0 j c m 2 ) 進(jìn)行 照射，通過細(xì)胞和動(dòng)物整體試驗(yàn)分析納米t i 0 2 ( 1 0 n m 銳鈦礦型、2 5 m 銳鈦礦型、2 5 衄金 紅石型) 的毒性作用，初步探討低劑量u v a 照射下，納米t i 0 2 的細(xì)胞毒性及對大鼠皮膚 光老化的影響，為納米t i 0 2 的應(yīng)用提供一定的毒理學(xué)資料。 一、不同類型納米二氧化鈦的光催化活性比較 光催化降解亞甲藍(lán)結(jié)果顯示，僅給予紫外照射時(shí)，亞甲藍(lán)未發(fā)生顯著降解；同時(shí)給予納 米t i 0 2 處理和紫外照射，亞甲藍(lán)可見顯著降解。納米t i 0 2 光催化降解亞甲藍(lán)的效果和紫外 照射劑量、納米n 0 2 濃度、粒徑大小及晶型有關(guān)。光照劑量越大、納米t i 0 2 濃度越高、粒 徑越小，光催化作用越強(qiáng)；相同粒徑的銳鈦礦型n 0 2 對亞甲藍(lán)的氧化作用大于金紅石型， 金紅石型t i 0 2 未見顯著的光催化作用。 二、納米二氧化鈦光催化產(chǎn)物對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的毒性作用 參照國標(biāo)b a l b c 3 t 3 中性紅攝取試驗(yàn)設(shè)置不同的染毒劑量組( 1 5 6 、3 1 2 、6 2 5 、1 2 5 、 2 5 0 p 咖l ) ，分別通過四甲基偶氮唑鹽( m t t ) 法和中性紅攝取光毒性試驗(yàn)檢測納米t i 0 2 對b a l b c 3 t 3 細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，納米t i 0 2 染毒的高劑量組對細(xì)胞的影響要大于 低劑量組，而小粒徑t i 0 2 的毒性則要大于粒徑較大的t i 0 2 ，銳鈦礦型t i 0 2 的毒性大于金紅 石型。光照前后相比，光照后細(xì)胞活性小于光照前。 查墮奎蘭堡主堂絲絲莖 d c f h d a 熒光探針測定結(jié)果顯示，與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高， 多數(shù)劑量組與對照的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p o 0 5 ) 。相同染毒時(shí)間，隨著染毒劑量的增高， 納米t i 0 2 染毒組細(xì)胞活性氧水平升高；紫外照射組在光照處理后4 h 內(nèi)細(xì)胞活性氧水平與染 毒劑量呈劑量效應(yīng)關(guān)系。與2 0 0 n m 銳鈦礦型t i 0 2 組比較，納米t i 0 2 組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平 升高更為明顯；相同粒徑的銳鈦礦型與金紅石型t i 0 2 相比，銳鈦礦型t i 0 2 染毒組細(xì)胞活性 氧水平高于金紅石型。光照前后相比，光照處理后2 h 、4 h 光照組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平高于無 光照組，4 h 后，光照組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平低于五光照組。 為探討納米t i 0 2 致b a l b c 3 t 3 細(xì)胞毒作用的損傷機(jī)制，本研究應(yīng)用不同濃度( 1 5 6 、3 1 2 、 6 2 5 、1 2 5 、2 5 0 腭恤l ) 納米t i 0 2 染毒b a l b c 3 t 3 細(xì)胞，分析了不同染毒條件下b a l b c 3 t 3 細(xì)胞的氧化損傷相關(guān)指標(biāo)、凋亡、細(xì)胞間隙通訊功能等，結(jié)果顯示，納米t i 0 2 可致b a l b c 3 t 3 細(xì)胞氧化損傷，細(xì)胞凋亡顯著升高，細(xì)胞間隙通訊功能下降，銳鈦礦型t i 0 2 對細(xì)胞損傷程 度大于金紅石型。光照與納米t i 0 2 聯(lián)合暴露組氧化損傷較納米t i 0 2 單獨(dú)暴露組嚴(yán)重，凋亡 率升高，細(xì)胞間隙通訊受損更加嚴(yán)重。 本研究進(jìn)一步分析了不同粒徑、劑量和晶型的納米t i 0 2 染毒條件下b a l b c 3 t 3 細(xì)胞的 膠原含量、基質(zhì)金屬蛋白酶含量及細(xì)胞因子等指標(biāo)的水平，以探討納米t i 0 2 對b a l b c 3 t 3 細(xì)胞分泌功能的影響。結(jié)果顯示納米t i 0 2 作用于細(xì)胞后，細(xì)胞分泌膠原的能力降低，m m p 1 、 m m p 一3 的分泌水平上升，i l 1 水平表達(dá)升高，n 師a 、i l 一6 在納米t i 0 2 劑量較大時(shí)分泌量 亦增高；光照后細(xì)胞培養(yǎng)上清膠原含量明顯少于未光照組，m m p 1 、m m p 3 含量高于未光 照組。細(xì)胞因子含量光照前后相比，不同納米t i 0 2 類型及劑量變化不一，2 0 0 衄銳鈦礦型 t i 0 2 組光照后細(xì)胞培養(yǎng)上清i l 1 含量上升，i l 6 含量下降，1 0 m n 銳鈦礦型t i 0 2 組光照后 細(xì)胞培養(yǎng)上清i l 1 含量下降，i l 6 含量上升，t n f 伍光照前后差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、納米二氧化鈦光催化產(chǎn)物對s d 大鼠的皮膚毒性作用 4 0 只s d 大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為對照組、2 0 納米t i 0 2 涂抹組、u v a ( 1 0 j c m z ) 組、2 0 納米t i 0 2 + u v a ( 1 0 j c m 2 ) 組，連續(xù)染毒2 1 天。測定不同處理?xiàng)l件下大鼠皮膚病理、 電鏡及皮膚細(xì)胞氧化損傷和分泌功能，初步分析納米t i 0 2 與紫外光照聯(lián)合染毒對大鼠的皮 膚毒性。結(jié)果顯示，染毒結(jié)束各組大鼠皮膚無紅斑及水腫，皮膚組織病理未見異常，透射 電鏡可見實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變寬。與對照組相比，雄性大鼠納米t i 0 2 + u v 組 t n f a 、i l 1 含量上升，i l 6 含量降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；u v 組及納米t i 0 2 組n 盯一a 、 i l 6 含量降低，i l l 含量上升，其中u v 組i l 一6 含量與對照的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 正o 0 5 ) 。 三個(gè)不同處理組相比，納米t i 0 2 + u v 組及納米t i 0 2 組的i l 6 含量較u v 組顯著升高 i i 生壅塑莖 ( p o 0 5 ) 。雌性大鼠三個(gè)處理組t n f 0 【含量較對照組顯著上升，i l 6 含量降低( o 0 5 ) 。 不同處理組相比，納米t i 0 2 + u v 組i l 一1 含量高于u v 組( 正0 0 5 ) ，納米t i 0 2 組i l 6 含量 低于u v 組( p 0 0 5 ) 。雌性大鼠納米t i 0 2 + u v 組m d a 含量較u v 組及納米t i 0 2 組含量上 升( p o 0 5 ) 。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組間s o d 、g s h p x 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 以上研究結(jié)果表明，納米t i 0 2 經(jīng)紫外照射后可產(chǎn)生羥自由基，產(chǎn)生羥自由基的量與納 米t i 0 2 的濃度、粒徑、晶型及紫外照射劑量有關(guān)。高水平的納米n 0 2 光催化產(chǎn)物有顯著細(xì) 胞毒性，可抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞間隙通訊功能障礙， 并可影響細(xì)胞分泌功能，導(dǎo)致細(xì)胞光老化的發(fā)生及促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明， 在實(shí)驗(yàn)所選擇的受試時(shí)間和光照劑量下，雖未見大鼠皮膚光老化的發(fā)生，但是納米t i 0 2 可 誘發(fā)皮膚脂質(zhì)過氧化損傷，并誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞分泌過量的炎性因子參與炎性反應(yīng)。 綜上所述，納米t i 0 2 細(xì)胞及動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，納米t i 0 2 的皮膚毒性與粒徑、 晶型及紫外照射有關(guān)，納米t i 0 2 粒徑越小其皮膚毒性越高，銳鈦礦型t i 0 2 毒性顯著高于金 紅石型，在低劑量紫外光照下納米t i 0 2 即可產(chǎn)生較高水平的羥自由基，從而加重細(xì)胞及皮 膚組織的損傷程度。 關(guān)鍵詞：納米t i 0 2 ；紫外光照；光催化活性；羥自由基；細(xì)胞毒性；皮膚毒性 i i i 東南大學(xué)碩士學(xué)位論文 t h es k i nt o x i c i t yo fp h o t o c a t a l y t i ct i t a n i u m d i o x i dn a n o p a r t i c l e s z h a n gx u e y a ns u p e i s e db yp r o f e s s o ry i n l i - h o n g s c h o o lo fp u b l i ch e a l t l ls o u t h e a s tu m v e r s i 鑼 a b s t r a c t t i 脅i u md i o x i d ( t i 0 2 ) r 啪o p a n i c l e sh a v eb e e nu s e di nc o s m e t i c sa sa 1 1i i l l p o r t a n ti n o 喀a 1 1 i c a d d i t i v e s m o r e 肌dm o r es t l l d i e sh a v es u g g e s t e dt h a t ，w i t hu vi r r a d i a t i o n ，t i 0 2n a n o p 撕i c l e ss h o w 1 1 i g hp h o t o c a t a l y t i ca c t i v i t y ，a n dg e n e r a t eh y d r o x y lr a d i c a l ( o h ) w k c hi st h em a i na c t i v em a t e r i a l i n d u c i n gl i p i dp e r o x i d a t i o n i 沁c e n ts t u d i e sd e m o n s t r a t e dt h a to x i d a t i v es t r e s sc o u l di 1 1 d u c ec e l l 印o p t o s i s ，a c t i v a t em i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s es i g n a lt 啪s d u c t i o np a t h w a y s ，a i l dp r o m o t et h e o v e r e x p r e s s i o no fm m p nc a i la l s oi n h i b i tc o l l a g e ns y n t h e s i s ，i n d u c em d ag e n e r a t i o n ，d e c r e a s e t l l em e m b 啪en e x i b i l i 吼a l l dc a u s et h ep h o t o a g i n g c h a r a c t c r i s t i cc h a n g e si ns 虹n t o 觚h e ru 芏1 d e r s t a n dt h ee 虢c t so fp h o t o c 砌y t i cp r o d u c t so ft i 0 2n a l l o p a r t i c l e so nt h es 虹n ， t h ec y t o t o x i c i t ) ra n ds k i nt o x i c 時(shí)o ft i 0 2n a n o p a n i c l e s ( 1o - 腳a i l a 眺e ，2 5 一啪a n a e ，2 5 一眥n l t i l e ， a n d2 0 0 n ma n a e ) w e r ec a 玎i e do u to nm o u s e 鋤b r ) ，0 1 1 i c 舶r o b l a s tc e l l sa i l dr a t sr e s p e c t i v e l y u n d e rt h eu ，ai m d i a t i o ni nc o m b i n a t i o ni n “s 咖d y 1 t h e p h o t o c a t a l y t i ca c t i v i t ) r o fd i 玨：r e n ts i z e sa i l d c y s t a l s t r u c t u r e so ft i t a m 啪d i o x i d e n 鋤o p a r t i c l e s ，n l ep h o t o c a t a l y t i ca c t i v i t yo ft i 0 2r 姍o p 硼c l e sp a r t i c l e sw a se v a l u a t e d b yd e 鰣a t i o no f m e t h y l e n eb l u e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，c o m p a r e d 嘶t hu 、，ai r r a d i a t i o no n l y ，t h ed e g r a d a t i o nr a t e o fm e t h y l e n eb l u es i 鰣f i c 珊l yi n c r e a s e dw h e n 訛a t e db o t l lt i 0 2p a n i c l e s 鋤d 小，a t h e r ew e r e s i g i l i f i c a n ta s s o c i a t i o nb e 僦e e nt l l ed e g r a d a t i o nr a t eo fi n e t l l y l e n eb l u e 甜l dt h ee x p o s u r ed o s e ，s i z e s ， a n dc 巧g 謝s n l l c t u r eo ft i 0 2p a n i c l e sa n dt h ed o s eo fu v ai r r a d i a t i o n a c c o r d i n gt 0t l l ee x p o s u r ed o s eo fu v a a n dt i 0 2p a r t i c l e si n c r e a s i n ga i l dt h es i z e so ft i 0 2 p a n i c l e sd e c r e a s i n g ，m ed e g r a d a t i o nr a t eo fm e t l l y l e n eb l u ei n c r e a s e dr a p i d l yp o 0 5 ) a n dt h e p h o t o c a t a l y t i ce 虢c to fa 1 1 a t a s e t ) ，p e 、v a sh i 曲e rt l l a l lt h a to fn l t i l e - t ) ，p e 0 0 5 ) ，w h i l et h e r e 、v a sn o s t a t i s t i cs i 印i f i c a n c ew h e n e x p o s e dt om t i l e 鉚ec o m p a r e d 、) l ，i t hc o n t r o lg r o u p 2 c y t o t o x i c i t ) ro fp h o t o c a t a l y t i cp r o d u c t so ft i 0 2n a i l o p a r t i c l e so nb a l b cs 、i s sm o u s ee m b d r o f i b r o b l a s t s ( b a l b c 3 t 3 ) c e n s i v 英文摘要 t oe v a l u a t et 1 1 ec y t o t o x i c i 夠o fp h o t o c a t a l y t i cp r o d u c t so ft i 0 2n a n o p a n i c l e so nb a l b c 3 t 3 c e l l s ，m 7 丌a s s a ya n dn e u t r a lr e dd y eu p t a k ea s s a yw e r ed e t e m l i n e d 、i mt h ee x p o s u r ed o s eo f15 6 ， 31 2 ，6 2 5 ，12 5 ，a n d2 5 0p g m 1 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sas i g n i f i c a md i f r e r e n c eo fc e l l a c t i v 時(shí)b e 鉚e e nt h eh i g h - d o s eg m u pa i l dt h el o w o rm o d e r a t e d o s eg r o u p s 謝me x p o s u r eo ft i 0 2 n a l l o p a r t i c l e s 10 - 衄a l l a t a s e t ”et i 0 2p a n i c l e sc o u l di n d u c e ds i 班f i c a n t l yd e c r e a s e db a l b c 3 t 3 c e l l sa c t i v 毋c o m p a r e d 、) l ，i m2 5 一姍a i l 粕e t y p et i 0 2p a r t i c l e s ( p o 0 5 ) ，w h i l e2 5 - 1 1 i i lm t i l e - t ) ，p e t i 0 2p a n i c l e ss h o w e das l i g h tc y t o t o x i c 吼b a l b c 3 t 3c e l l sa c t i v i t ) rr e d u c e ds i 鰣f i c a l l t l yw h e n w e r ee x p o s e db o t ht i 0 2p a r t i c l e sa n du v ai 1 1 r a d i a t i o n r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si nt h eb a l b c 3 t 3c e l l sw e r ed e t e c t e dw i md c f h d af l u o r e s c e n c e p r o b e c o m p a r e d 、i mc o n t r o lg r o u p s ，也el e v e lo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si nt h et r e a t i r i e n tg r o u p s w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d t h ec o m b i n e dt i 0 2p a n i c l e sa n du 、，ae x p o s u r ei n d u c e dr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e si 1 1ad o s e - d e p e n d e n tm 鋤e r 謝t h i n4h o u r sa r e ru v ai 仃2 l d i a t i o n t h e r ew e r e s i 盟i f i c a n ta s s o c i a t i o nb e t w e e nt h el e v e lo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sa n ds i z e so rc 巧s t a ls t m c 劬r eo f t i 0 2p 甜i c l e s r h em e c h a i l i s mo fc y t o t o x i t ) ri n d u c e db yt i 0 2n a l l o p a r t i c l e sw a se x p l o r e d 謝t hm e 嬲s a yo f o x i d a t i v ed a m a g e ，a p o p t o s i s ，a n dg 印j u n c t i o n a l i n t e r c e l l u l a rc o m m u l l i c a t i o n ( g j i c ) ，r i l er e s u l t s s h o w e dt h a tb a l b c 3 t 3c e l l se x p o s e d 誚t ht i 0 2p a r t i c l e s 鋤d 叭廠ar e s p e c t i v e l yw e r ei n d u c e dt l i 曲e r l e v e lo fo x i d a t i v ed a m a g ea i l da p o p t o s i sa s 、e l la sr e d u c e dm n c t i o no fg j i cc o m p a r e dw i t hc o n t r o l g r o u p s m o r e o v e r as yn e 】學(xué)t i ce 旋c tb 咖e e nt i 0 2p a r t i c l e sa n d 小隊(duì)e x p o s u r e 、v a so b s e n ，e d 0 0 0 5 ) t oe x p l o r et h ee 髓c to ft i 0 2n a n o p a n i c l e so ns e c r e t o 巧劬c t i o no fb a l b c 3 t 3c e l l s ，t h ec e l l s e x p o s e dt od i 虢r e n ts i z e sa n dc 巧s t a ls t m c t u r eo ft i 0 2p a r t i c l e sa td i 虢r e n td o s e sw e r ee v a l u a t e d f o rt h ea u s s a yo fc o l l a g e nc o n t e n t ，m a t r i xm e t a l l o p r o t e i i l a s e s ( m m p ) ，a r l dc y t 0 虹i l e s t h er e s u l t s s h o w e d l a tt i 0 2n a n o p a r t i c l e ss i 班f i c a n t l yr e d u c e dm ee x p r e s s i o no fc o l l a g e na n di n d u c e dt l l e s e c r e t i o no fm m p - 1a n dm m p 一3b yb a l b c 3 t 3c e l l s i l - 1l e v e lo fb a l b c 3 t 3c e l l ss i 卿f i c a n t l y i n c r e a s e dw h i me x p o s e dt ot i 0 2p a n i c l e s s i 鰣f i c a i l td i f f e r e n c e si i lt l 蝦一aa n di l 一6w e r eo b s e r v e d b e 鉚e e nt h e1 1 i 曲一d o s e 鏟o u pa n dt h e1 0 w - o rm o d e r a t e d o s eg r o u p s 謝t he x p o s u r eo ft i 0 2p a r t i c l e s c 0 1 l a g e nc o n t e ma i l dm a t r i x 礎(chǔ)：t a j l o p r o t e i n a s e so fb a l b c 3 t 3c e l l sc h a n g e ds i 印i f i c a n t l yw r h e n e x p o s e d 淅t l lt i 0 2p a n i c l e sa i l du v ai r r a d i a t i o ni 1 1c o m b i l l a t i o n t h er e s u l to fc y t o k i n e sa s s a y i i l d i c a t e dt h a tw h e nc o m b i n e d 誦mu v ai r r a d i a t i o i l ，2 0 0 一啪t i 0 2 p a n i c l e sc o u l di n d u c e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a l s e di l - 1l e v e la i l dd e c r e a s e di l 一6l e v e l i nm es u p e m a t a n to fb a l b c 3 t 3c e l l s ， v 東南大學(xué)碩士學(xué)位論文 w h i l el0 i l r nt i 0 2p a r t i c l e si n d u c e dt h es t a t i s t i c a l l yd e c r e a s e dl e v e lo fi l 一1a n di n c r e a s e dl e v e lo f i l 一6 t h e r ew a sn os i g l l i f i c a md i f r e r e n c ei nt h el e v e lo fn 叮f ab e t w e e nt h ec o m b i n e dt i 0 2 p a r t i c l e sa r l du v ae x p o s u r eg r o u pa n dt i 0 2e x p o s u r e 鏟o u p 3 s l ( i nt o x i c 蚵o f p h o t o c a t a l y t i cp r o d u c t so ft i 0 2i 瑚o p a n i c l e so ns p r a g u e d a w l e y ( s d ) r a t s 4 0s dr a t so fh a l fg e n d e rw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t of o u rg r o u p sa sf o l l o w s ：c o n t r 0 1g r o u p ， 2 0 t i 0 2t r e a 缸n e n tg r o u p ，u v ai m d i a t i o ng r o u pw i t ht h ed o s eo f1o j c m za n dc o m b i n e d2 0 t i 0 2a 1 1 du v a i r r a d i a t i o n ( 晰t 1 1t h ed o s eo f10 j c ) g r o u p 1 1 1 er a t so fa 1 1t r e a t m e n tg r o u p sw e r e a d i n i n i s t e r e dd a i l yf o r21d a y s t o x i ce 虢c t sw e r ed e t e r i n i n e d 諏mh i s t o p a t h o l o g y ，t r 鋤s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) ，a l l do x i d a t i v ed 鋤a g ea 1 1 dt 1 1 es e c r e t o 巧f h n c t i o no fm es k i nc e l l s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tn oe r y t h e m a0 re d e m aw a u so b s e r v e do nt l l es l ( i na 1 1 dh i s t o p a m o l o g i ce v a l u a t i o n o fs k i nt i s s u e ss h o 、v e dn op a t h o l o g i cl e s i o n s u l t r a s t m c t u r a la i l a l y s i si n d i c a t e dr o u 曲e n d o p l a s m i c r e t i c u l u mo ft l l ef i b r o b l a s t se x p a l l d e d as y n e 唱e t i ce 虢c tb e t w e e nt i 0 2p a i r t i c l e s 鋤du 、，ae x p o s u r e o nl i p i dp e r o x i d a t i o nw 嬲o b s e r v e do i l l yi 1 1f e m a l er a t sp o 0 5 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，t h e l e v e l so ft n f 一僅a 1 1 di l 一1 、e r ei n c r e a s e da i l dt l l el e v e lo fi l - 6w 嬲r e d u c e di nt h ec o m b i n e dt i 0 2 a n du v at r e a t m e mg r o u p ，w m l et h el e v e l so f 盯呵f - aa l l di l - 6w e r er e d u c e da n dt h el e v e lo fi l 1 w a si n c r e a l s e di nt h et i 0 2o ru 、，a 骶a n n e n tg r o u pi nt h em a l er a t s ( t h o u 曲t h e s ec h a n g e sw e r en o t s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a l l t ) t h ei n c r e a s e dl e v e l so ft n f 一0 【a n di l 一1a i l dt h ed e c r e a s e dl e v e lo fi l 一6 w e r eo b s e r v e da m o n ga l lt h et r e a t m e n tg r o u p sc o m p a r e d 晰mc o n t r o l i nt h ef e m a l er a t sp t ，0 0 5 ) m o r e o v e r ，m el e v e lo fi l 一1i nt h ec o m b i n e dt i 0 2a n du v a 訛舳e n tg r o u p 、v a ss i 則f i c a n t l y k 曲e rt h a nt h a ti nu 、ai r r a d i a t i o n 伊o u pp 2 0 0 n m ；銳鈦礦型t i 0 2 產(chǎn)生光催化產(chǎn)物的能力大于金紅石 型。有關(guān)研究表明，銳鈦礦型t i 0 2 的帶隙略高于金紅石型，穩(wěn)定性比金紅石型差，金紅石型 t i 0 2 對0 2 的吸附能力比銳鈦礦型差。目前認(rèn)為銳鈦礦型t i 0 2 表現(xiàn)出高的活性有以下幾個(gè)原因 【2 1 】：( 1 ) 銳鈦礦型t i 0 2 的禁帶寬度為3 2 e v ，金紅石型t i 0 2 禁帶寬度為3 0 e v ，銳鈦礦型t i 0 2 較高的禁帶寬度使其電子空穴對具有更正或更負(fù)的電位，因而具有較高氧化能力；( 2 ) 銳鈦 礦型t i 0 2 表面吸附h 2 0 、0 2 、及o h 。的能力較強(qiáng)，導(dǎo)致其光催化活性較高，在光催化反應(yīng)中 表面吸附能力對催化活性有很大的影響，較強(qiáng)的吸附能力對其活性有利；( 3 ) 在結(jié)晶過程中 銳鈦礦型晶粒通常具有較小的尺寸及較大的比表面，對光催化反應(yīng)有利。較小的晶粒尺寸意 味著催化劑的比表面積比較大，相同質(zhì)量的催化劑可以提供更多的吸附和反應(yīng)表面【2 2 1 ，因而 小粒徑銳鈦礦型t i 0 2 表現(xiàn)出較高光催化活性。 綜上所述，可以看出紫外照射可引起光催化產(chǎn)物的產(chǎn)生，羥自由基產(chǎn)生的量隨著紫外照 射劑量的增加而增加；相同晶型納米t i 0 2 間比較，粒徑越小產(chǎn)生羥自由基的量越多；相同粒 徑下，銳鈦礦型t i 0 2 產(chǎn)生光催化產(chǎn)物的量多于金紅石型。 l o 第二章納米二氧化鈦光催化產(chǎn)物對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的毒性作用 第二章納米二氧化鈦光催化產(chǎn)物對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的毒性作用 c y t o t o x i c i t yo fp h o t o c a t a i y t i cp r o d u c t so ft i 0 2n a n o p a r t i c l e so n b a l b cs w i s sm o u s ee m b r y of i b r o b l a s t sc e l l s 成纖維細(xì)胞是真皮重要組成細(xì)胞之一，是皮膚功能完好的重要保證。成纖維細(xì)胞具有 合成膠原纖維和彈性纖維，支撐皮膚的結(jié)構(gòu)，以及釋放炎癥介質(zhì)主動(dòng)參與啟動(dòng)和延續(xù)炎癥反 應(yīng)的功能。在紫外線輻射引起的皮膚光老化以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生過程中，成纖維細(xì)胞合成和 分泌的t n f a 及i l 1 d 等細(xì)胞因子發(fā)揮著重要作用。 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞( b a l b c 3 t 3 ) 細(xì)胞是目前最認(rèn)可的光毒性評(píng)價(jià)細(xì)胞模型，能較好的 反應(yīng)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)變化【2 3 1 。本章以b a l b c 3 t 3 細(xì)胞為靶細(xì)胞，選擇我國目前評(píng)價(jià)光 毒性規(guī)定使用的對細(xì)胞無損傷的u v a 照射條件( 3 6 5 1 1 i i l ，5 j c m 2 ) ，探討在有無光照的情況 下，受試納米t i 0 2 ( 1 0 n m 銳鈦礦型、2 5 m 銳鈦礦型、2 5 m n 金紅石型、2 0 0 啪銳鈦礦型) 的細(xì) 胞損傷效應(yīng)，初步分析納米光催化產(chǎn)物的主要作用靶點(diǎn)和毒性作用機(jī)制。 第一節(jié)納米二氧化鈦光催化產(chǎn)物的一般細(xì)胞毒性 光毒性是指應(yīng)用于機(jī)體的物質(zhì)經(jīng)暴露于光線后誘發(fā)或增強(qiáng)( 在低劑量水平時(shí)明顯) 的毒 性反應(yīng)【2 3 1 。本節(jié)將通過m t t 法及中性紅攝取試驗(yàn)，觀察在有無紫外光照條件下受試納米t i 0 2 對b a l b c 3 t 3 細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)活性氧、細(xì)胞活性等方面的影響，初步分析不同類型的納米 n 0 2 對細(xì)胞細(xì)胞膜及線粒體等的損傷水平。 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料同第一章第一節(jié)1 1 。 1 2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠胚胎上皮細(xì)胞( b a l b c 3 t 3 ) 株由江蘇省疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)。 1 3 試劑與儀器 1 3 1 細(xì)胞培養(yǎng)試劑及其配制 d m e m 高糖培養(yǎng)基的配制同第一章第一節(jié)1 2 1 。 0 2 5 胰蛋白酶溶液稱取胰蛋白酶( 美國觸s c o 公司，進(jìn)口分裝) 1 o g ，用磷酸鹽緩 沖液( p b s ) 緩沖液溶解，玻棒攪拌混勻，放置4 冰箱過夜后，定容至4 0 0 m l ，抽濾除菌， 墨墮奎堂堡主蘭垡笙莖 分裝，2 0 冰箱保存?zhèn)溆谩?1 3 2 主要試劑 中性紅( 購自北京鼎國生物技術(shù)限責(zé)任公司) ； m t t ( 購自s i 腫a 公司) ； 2 7 ，7 l 二乙酰二氯熒光素( d c f h - d a ) 熒光探針( 美國i n v i t r o g e n 公司，進(jìn)口分裝) 按照 1 ：1 0 0 0 的比例，用無小牛血清的d m e m 培養(yǎng)液稀釋，使終濃度為1 0 岬o l l ，臨用前配制。 1 3 3 主要儀器 c 0 2 培養(yǎng)箱( b b 5 0 6 0 u v ，香港h e a lf o r c ed e v e l o p m e n t 公司) ； 倒置顯微鏡( c k x 4 l ，日本o l y m p u s 公司) ； 全自動(dòng)酶標(biāo)儀( m r x ，美國d y n e xt e c h n o l o g i e s 公司) ； 低溫超速離心機(jī)( 5 4 1 7 r ，德國e p p e n d o r f 公司) ； 紫外輻照儀( 法國v i l b e r 公司) 。 1 4 方法 1 4 1 受試細(xì)胞 b a l b c 3 t 3 細(xì)胞采用常規(guī)傳代培養(yǎng)，用d m e m 培養(yǎng)基( 含體積分?jǐn)?shù)為1 0 的胎牛血清、 1 0 0u m l 青霉素、1 0 0p m l 鏈霉素) 于3 7 、5 c 0 2 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好 的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。 1 4 2 納米t i 0 2 懸液配制同第一章第一節(jié)1 3 。 1 4 3 紫外輻照條件波長3 6 5 1 1 i i l ，照射劑量5 j c i n 2 。 1 4 4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞懸液( 1 1 0 5 m l ) 接種于2 4 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3 7 、5 c 0 2 培養(yǎng)箱中貼壁生長2 4 h 。加 入不同濃度的受試物溶液，相同的受試物濃度序列制備兩個(gè)板，每塊培養(yǎng)板同時(shí)設(shè)陰性對照， 每組設(shè)3 個(gè)平行。繼續(xù)培養(yǎng)1 8 h ，兩塊板隨機(jī)選擇，其中一塊置紫外輻照儀下進(jìn)行照射，照射 劑量為5 j c m ? ，室溫下將另一塊置于暗盒內(nèi)。照射結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)。 1 4 5m t t 法檢測細(xì)胞活性【2 4 】 向9 6 孔板中加入細(xì)胞懸液( 1 1 0 5 孔) ，3 7 、5 c 0 2 培養(yǎng)箱中貼壁生長2 4 h 。加入不同 濃度的受試物溶液，相同的受試物濃度序列制備兩個(gè)板，每塊培養(yǎng)板同時(shí)設(shè)陰性對照，每組 設(shè)3 個(gè)平行。繼續(xù)培養(yǎng)1 8 h ，兩塊板隨機(jī)選擇，其中一塊置紫外輻照儀下進(jìn)行照射，照射劑量 為5 j c m 2 ，室溫下將另一塊置于暗盒內(nèi)。照射結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后吸除培養(yǎng)基，用p b s 清洗 細(xì)胞3 次，加入含m t t 培養(yǎng)基，孵育3 h ，吸除培養(yǎng)基，加入d m s o 震蕩l o m i n 后用酶標(biāo)儀在5 7 0 1 1 i i l 處測定吸光值。 1 2 笙三堊塑鲞三篁絲竺堂堡些蘭望翌塵塾墅墮盛塹絲塑墮墮童絲堡旦 1 4 6 中性紅攝取光毒性