（生物化學(xué)與分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）家蠶phf5a基因的研究.pdf

浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 p h f 5 a ( p l a n th o m o l o g yd o m a i nf i n g e rp r o t e i n5 a ) 轉(zhuǎn)錄起始因子，它的分布十 分廣泛，從酵母到人類(lèi)幾乎所有真核生物中都發(fā)現(xiàn)了該蛋白，但至今在原核生物 中尚未發(fā)現(xiàn)此蛋白。它編碼1 1 0 個(gè)氨基酸，屬于一種高度保守的小轉(zhuǎn)錄因子或協(xié) 因子，缺少了p h f 5 a ，會(huì)產(chǎn)生剪接不完全的p r e m r n a 。另夕 , p h f 5 a 還與細(xì)胞周 期密切相關(guān)，缺少了p h f 5 a ，有絲分裂終止在g 2 m 期。我們?cè)趯?duì)家蠶蛹c d n a 文 庫(kù)測(cè)序過(guò)程中獲得了一個(gè)類(lèi)似p h f 5 a 的基因序列，此基因由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi) 含子組成，編碼1 1 0 個(gè)氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)此基因編碼的氨基酸序列與果蠅、 人、小鼠、家鼠等物種的p h f 5 a 蛋白同源性都超過(guò)了9 0 ，因此我們將此蛋白命 名為b m p h f 5 a 。推測(cè)的蛋白分子量、等電點(diǎn)分別為1 2 4 7l ( d a 和8 4 ，這也與已知 的p h f 5 a 蛋白相似。 將b m p h f 5 a 基因o r f 克隆至i j p g e m t 載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，經(jīng)e c o ri 和勵(lì)di 雙酶切后，插入表達(dá)載體p e t 一2 8 a ( + ) 的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，成功構(gòu)建了表 達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，經(jīng)p c r 、酶切鑒定以及測(cè)序分析重 組正確。i p t g 誘導(dǎo)表達(dá)后裂解菌作s d s p a g e 分析，在1 6 k d 處有一條特別濃的 條帶，與預(yù)期值相符，表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的4 0 左右。融合蛋白以不溶性的 包涵體形式存在，超聲波裂解菌體分離包涵體并離心、洗滌；對(duì)包涵體進(jìn)行溶解 和梯度透析復(fù)性；采用親和層析純化融合蛋i 芻h i s b m p h f 5 a 。以該融合蛋白為 抗原免疫雄性新西蘭兔制作了該重組蛋白的多克隆抗體，e l i s a 檢測(cè)該抗體血清 的效價(jià)可達(dá)到1 ：3 2 0 0 0 。w e s t e m f n 跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了目的蛋白的表達(dá)。在亞 細(xì)胞定位中，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要存在于在細(xì)胞核中。r n a i 顯示b m 5 細(xì)胞在g 2 m 期 的數(shù)目增加。 關(guān)鍵詞：p h f 5 a ；家蠶；鋅指蛋白；亞細(xì)胞定位；細(xì)胞周期 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t t r a n s c r i p t i o na c t i v a t o rf a c t o rp h f 5 ai sf o u n di nm a n yd i f f e r e n ts p e c i e sr a n g i n g f r o my e a s tt oh u m a n ，b u tn oh o m o l o g o u ss e q u e n c ew a si d e n t i f i e di nab l a s ts e a r c h o ft h ep r o k a r y o t i cd a t a b a s e i tb e l o n g st oas m a l lt r a n s c r i p t i o nf a c t o ro rc o f a c t o r w h i c he n c o d e s110a c i d s i fp h f 5 ad e l e t e d ，p r e m r n as p l i c e du n c o m p l e t e dw a s f o u n da n dc e l lc y c l ew a s d e p l e t e dt og e m a c c o r d i n gt ot h el a r g e s c a l es e q u e n c i n go f s i l k w o r mp u p a e ，au n i q u eb o m b y xm o r ie d n aw a si d e n t i f i e dw h i c hc o n t e i n st h r e e e x o na n dt w oi n t r o n t h ep h f 5 a p r o t e i nc o n s i s t so f1 10a a s h o m o g e n e o u sa n a l y s i s s h o w e dt h a tb m p h f 5 as h a r e d9 0 o fi d e n t i t yw i t ht h a ti nb o t hd r o s o p h i l aa n d v e r t e b r a t es u c ha sh o m o s a p i e n s ，r a t t u sn o r v e g i c u s ，m u sm u s c u l u s a c c o r d i n gt ot h e s e q u e n c i n gd a t a ，t h em o l e c u l a rw e i g h t s ，a n di s o e l e c t r i cp o i n t sw e r ee s t i m a t e da s12 4 7 k d aa n d8 4f o rb m p h f 5 as i m i l a rt oo t h e rp h f 5 a p r o t e i n si d e n t i f i e d i nt h i sp a r t ，ap h f 5 ag e n ew a sf o u n di nt h ee d n a l i b r a r yo ft h i sl a b o r a t o r y t h e o r fo ft h eg e n ew a ss u b c l o n e di n t op g e m - t v e c t o r , a f t e rb e i n gd i g e s t e dw i t he c o r ia n dx h oi ，t h ed n af r a g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h ef u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o r p e t - 2 8 a ( + ) t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h e r e s u l to fp c ra n dd i g e s t i o nw i t he c o ri x h ois h o w e dt h a tt h ed e s i g n e df r a g m e n t w a si n s e r t e dc o r r e c t l y t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a ss e q u e n c e da n dt h es e q u e n c e m a pi n d i c a t e dt h a tar e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) i n d u c e db y i p t gt h ea n a l y s i so fs d s - p a g es h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nh i s - - b m p h f 5 aw a s e x p r e s s e dh i g h l yi nb l 21 ，w h i c ha c c o u n t e du pt o4 0 o fg e r mp r o t e i n s t h em o s t r e c o m b i n a n t p r o t e i nw a s i n s o l u b l ei n c i s i o n b o d ya n do n l y l i t t l ef r a c t i o no f r e c o m b i n a n tp r o t e i no fh i s b m p h f 5 aw a ss o l u b l e i no r d e rt oo b t a i na b u n d a n t s o l u b l er e c o m b i n a n tp r o t e i n ，t h ei n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d yw a ss o l u b i l i z e d ，r e f o l d e d a n dp u r i f i e d b yn i 2 + t r a pa f f p h f 5 a t yc h r o m a t o g r a p h y , p r o t e i nh i s b m p h f 5 aw a s o b t a i n e d i m m u n i z a t i o no fr a b b i t sw i t hf u s i o np r o t e i ng e n e r a t e dh i g ht i t e r ( 1 ：3 2 0 0 0 ) p o l y c l o n a la n t i b o d i e s ，m e a s u r i n gb ye l i s a w e s t e mb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a t t h ea n t i b o d yc o u l db i n dt h e e x p r e s s i o nh i s - b m p h f 5 as p e c i f i c a l l y p h f 5 aw a s i i 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 f o u n di nn u c l e u sb ys u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n k e y w o r d s ：p h f 5 a ；b o m b y xm o r i ； z i n cf i n g e rp r o t e i n ；s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n ； c e l lc y c l e i i i 浙江理工大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是 本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已明確注明和 引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品及 成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫(xiě)，我對(duì)所寫(xiě)的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲 明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名：壺1 毒選 日期：沙哆年3 月日 浙江理工大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) 學(xué)位論文作糞完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的艦定，同_ ；蠹：學(xué)校傈鞭 并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。 本人授權(quán)浙江理二e 大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)疼遴 行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 本學(xué)位論文藩予 保密口在年解密后適用本版權(quán)書(shū)。 不保密腳 學(xué)位論文作者簽名：玉1 毒睦 日期：沙審年；月咫日 臌輒夠幽 日期：2 岬年多月崢日 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章綜述 植物同源域蛋白( p l a n th o m e o d o m a i nf i n g e r p r o t e i n ，p h d ) 亦稱(chēng)白血病關(guān)聯(lián) 蛋白1 1 1 ( l e u k e m i aa s s o c i a t e dp r o t e i n ，l a p ) 。是在1 9 9 3 年s c h i n d l e r f l l 在研究擬 南芥同源域蛋白( h o m e o d o m a i n ) h a t 3 蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)的。它含有一類(lèi)特征為 c y s 4 h i s - c y s 3 的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域( p l a n th o m e o d o m a i nf i n g e r ，p h d f i n g e r ) 長(zhǎng)約 5 0 個(gè)氨基酸，大小及氨基酸的排列方式均與r i n g f i n g e r ( c y s 3 一h i s c y s 4 ) 和l i m 結(jié)構(gòu)域( c y s 2 一h i s c y s 5 ) 相似【2 1 。經(jīng)研究證明p h d f i n g e r 除了在植物中，它也 廣泛存在于酵母、線蟲(chóng)與哺乳動(dòng)物q h 3 , 4 1 。p h i ) 一f i n g e r 主要存在于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白， 和染色質(zhì)調(diào)節(jié)復(fù)合物( c h r o m a t i n m o d u l a t i n g c o m p l e x e s ) 中，它可能是蛋白質(zhì)與 蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與d n a 或蛋白質(zhì)與r n a 相互作用區(qū)【2 1 。 轉(zhuǎn)錄起始因子是在基因表達(dá)中具有轉(zhuǎn)錄起始作用的一類(lèi)蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng)。 p h f 5 a ( p l a n t h o m e o d o m a i n f i n g e r p r o t e i n5 a ) t 5 1 亦稱(chēng)i n i ( i n i = i m t i m i o n ) 【6 1 也是一種 含有p h d f i n g e r 的蛋白質(zhì)，屬于一種高度保守的小轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子【5 】，并在 p r e r n a 剪接【7 】，細(xì)胞周期及d n a 損傷修復(fù)中具有重要的作用。 1p h f 5 a 的發(fā)現(xiàn) i n i 是在研究受雌激素誘導(dǎo)的子宮肌層間隙連接蛋白c x 4 3 時(shí)發(fā)現(xiàn)的，并因其 具有轉(zhuǎn)錄起始因子的作用而命名【5 1 。 受雌激素誘導(dǎo)的子宮肌層間隙連接蛋i ! t c x 4 3 屬于c o n n e x i n 家族【8 1 ，它是一種 跨膜蛋白，在胎兒發(fā)育早期表達(dá)【9 1 ，在成體中的許多組織中都有發(fā)現(xiàn)。它在心肌 中表達(dá)量最高，并且是組成型表達(dá)【1 0 1 。在子宮中，c x 4 3 在調(diào)節(jié)肌肉同步收縮中 是相當(dāng)必要的】，與心肌的組成型表達(dá)不同，c x 4 3 在子宮中的表達(dá)受到固醇類(lèi) 激素調(diào)控”】。為了研究雌激素在子宮肌層中的誘導(dǎo)機(jī)制，陳等提出在家鼠 t a t a 框上游1 2 b p 處有激活蛋白( a c t i v a t o r p r o t e i n ) 1 位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄激活因子家族c “h 和c - f o s 通過(guò)結(jié)合在激活蛋白1 位點(diǎn)而間接發(fā)揮作用。但是人們發(fā)現(xiàn)如果突變a p 一1 位點(diǎn)從而使c q u n 和c - f o s 不能與a p 一1 位點(diǎn)結(jié)合并不能消除c x 4 3 基因?qū)Υ萍に氐姆?應(yīng)f 7 】。通過(guò)分析表明，臨近c(diǎn) x 4 3 啟動(dòng)子的區(qū)域?qū)τ赾 x 4 3 基因?qū)Υ萍に氐姆磻?yīng)也是 非常重要的。此區(qū)域可以與含1 1 0 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)結(jié)合，人們通過(guò)掃描受雌激 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 素誘導(dǎo)的鼠子宮肌層表達(dá)文庫(kù)而鑒定出這是一個(gè)新的保守性相當(dāng)高的鋅指蛋白 1 5 ，它屬于一種高度保守的小轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子7 1 ，能增強(qiáng)c x 4 3 對(duì)雌激素的應(yīng)答 f 1 。因?yàn)檫@種蛋白具有轉(zhuǎn)錄起始因子的作用，取起始( i n i = i n i t i a t i o n ) 前三個(gè)字母 命名之，即i n i ”，后來(lái)有人在鼠的基因組中分選出了這種蛋白質(zhì)，因其含有 p h d f i n g e r 結(jié)構(gòu)域就將其命名為p h f 5 a i ”，目l j 關(guān)于這種蛋白質(zhì)還沒(méi)有統(tǒng)一的名 稱(chēng)，本文中以p h f 5 a 命名。 2 p h f 5 a 的特征 p h f 5 a 是一種高度保守且廣泛存在的蛋白質(zhì)，分布在從酵母到人類(lèi)的真核生 物中，但迄今為止在原核生物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 的存在7 1 。n o r t h e r nb l o t 分析表 明，p h f 5 a 在不同的組織中，如：腦、心臟、卵巢、子宮、骨骼肌、睪丸中都只 有單一的轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)約1 2k b t ”。 2 1p h f 5 a 的保守性 p h f 5 a 只有短短的1 1 0 個(gè)氨基酸【5 1 ，但它在進(jìn)化上是極度保守的。在蛋白質(zhì) 水平上，在n c b i 上進(jìn)行b l a s t 時(shí)發(fā)現(xiàn)( 如圖1 1 所示) ，p h f 5 a 在脊椎動(dòng)物中的 同源性為1 0 0 ，在多細(xì)胞生物中，p h f 5 a 的同源性要超過(guò)8 0 ，即使在同源性 最低的啤酒酵母中p h f 5 a 的同源性也超過(guò)t 5 0 t 羽。在核酸水平上，p h f 5 a 也是 相當(dāng)保守的，在n c b i 上進(jìn)行b l a s t 時(shí)發(fā)現(xiàn)，鼠和人的同源性超過(guò)了9 0 。在用 家蠶進(jìn)行b l a s t 時(shí)發(fā)現(xiàn)，家蠶與人、鼠等脊椎動(dòng)物及果蠅、岡比亞按蚊的同源 性都超過(guò)了9 0 ，但是家蠶與果蠅、岡比亞按蚊的同源性低于人、鼠等脊椎動(dòng)物 等的同源性，相差的部分來(lái)自于羧基端的n l s 序列。 圖1 1p h f 5 a 在不同物種中的同源性比對(duì)1 8 i 2 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 f i 9 1 1a n a l y s i so fp h f 5 ah o m o l o g yi nd i f f e r e n ts p e c i e s ，i d e n t i c a lr e s i d u e sa r eb o x e di n b l a c k , c o n s e r v e dr e s i d u e sa r eb o x e di ng r a y 2 2p h f 5 a 的分布 從酵母到人類(lèi)的真核生物中都發(fā)現(xiàn)了p h f 5 a ，但在原核生物中尚沒(méi)有發(fā)現(xiàn) p j 。在挪威鼠中的n o r t h e r nb l o t 分析表明，p h f 5 a 在不同的組織中，如：腦、心 臟、卵巢、子宮、骨骼肌、睪丸中都只有單一的轉(zhuǎn)錄本 ”。而在對(duì)家鼠進(jìn)行染色 體定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，p h f s a 存在假基因，并且p h f 5 a 與假基因分別位于不同的染色 體上【6 】。用融合了g f p 的重組g f p p h f 5 a 進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 位于細(xì)胞核 內(nèi)，并在核仁中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 的存在【7 1 。目前，所有的研究都集中在脊椎動(dòng)物 中的人、鼠及無(wú)脊椎動(dòng)物的酵母、線蟲(chóng)中，在昆蟲(chóng)中尚沒(méi)有報(bào)道。 2 3p h f s a 的結(jié)構(gòu)特征 對(duì)p i t f 5 a 進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 從n 端到c 端依次為：三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)、 一個(gè)亮氨酸拉鏈、一個(gè)核定位信號(hào)( n l s ) 【7 】( 如圖1 2 所示) 。在此結(jié)構(gòu)中，最 n 端的鋅指結(jié)構(gòu)含有較多的堿性氨基酸，體# b e m s a 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)切除此區(qū)域發(fā) 現(xiàn)p h f 5 a 不能結(jié)合至i d n a 上，而切除后兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)并不妨礙p h f 5 a 結(jié)合到 d n a ，說(shuō)明最n 端的鋅指結(jié)構(gòu)是結(jié)合d n a 所必須的。雖然切除后兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)并 不妨礙p h f 5 a 結(jié)合到d n a ，但是p h f 5 a 并不具備轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子的功能。c 端n l s 序列在p h f 5 a 的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，人們發(fā)現(xiàn)【釀，如果切除 n l s 序y l j p h f 5 a 將不能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，而是富集在細(xì)胞質(zhì)中。 t 鸛揀獅矬輔糖輔甜 狂獼符戡鍆髓t 0 2t 琦 戳瞪疆童趟立篷毯越盎：越函杰波士士捌翻 材抖e e ee ee eeeeelgllr k 拭螭髓 = 罱= 墨= 目霉# t t _ 蚴 r h 婚f 嘲 h 秈z t p l w 圖1 2p h f 5 a 序列分析h i f i 9 1 2a n a l y s i so ft h ep h f 5 as e q u e n c e 3 p h f s a 的功能特點(diǎn) 3 1p h f s a 在基因表達(dá)時(shí)的調(diào)節(jié)作用 浙江理1 ：人學(xué)碩士學(xué)位論文 3 1 1 作用特點(diǎn) p h f 5 a 作為轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子結(jié)合到基因的啟動(dòng)子7 5 - 3 4 附近的區(qū)域啟動(dòng) 或促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄【5 1 ；p h f 5 a 在不同的細(xì)胞或組織中對(duì)雌激素的反應(yīng)可能是不同 的f 7 ，m 】，例如，在非洲綠猴腎纖維原細(xì)胞中p h f 5 a 的表達(dá)量隨雌激素的濃度的 升高而增；9 1 1 7 1 ，而在人肝癌上皮細(xì)胞p h f 5 a 的表達(dá)量與雌激素的濃度沒(méi)有關(guān)系 【7 】：在生物發(fā)育的不同時(shí)期具有不同的作用【1 7 】，如在線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)中p h f 5 a 是必 需的，缺失了它將造成幼蟲(chóng)的死亡，但是缺失了p h f 5 a 的成體不會(huì)死亡。 3 1 2p h f 5 a 在c x 4 3 表達(dá)時(shí)的作用 c x 4 3 作為一種跨膜蛋白聚合在一起在細(xì)胞表面形成間隙連接通道【1 8 】，有利 于細(xì)胞間的物質(zhì)和能量的交流。另外c x 4 3 能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的電勢(shì)差【1 9 】，在信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要的作用，比如，c x 4 3 能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞有節(jié)律的跳動(dòng)餑】。c x 4 3 基因在表達(dá)過(guò)程中受雌激素受體調(diào)節(jié) 7 , 2 0 , 2 1 】。 o l t r a 等人【5 】在研究中發(fā)現(xiàn)，在c x 4 3 表達(dá)過(guò)程中需要p h f 5 a 的參與。p h f 5 a 作為轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子能夠特異結(jié)合在c x 4 3 基因啟動(dòng)子一7 5 3 4 附近的區(qū)域增強(qiáng) c x 4 3 基因?qū)Υ萍に氐姆磻?yīng)【”。p h f 5 a 結(jié)合到c x 4 3 啟動(dòng)子上時(shí)，促進(jìn)了雌激素受 體轉(zhuǎn)錄激活作用1 1 2 2 2 3 l ( a c t i v a t i n gf u n c t i o n1 ) ，而不是轉(zhuǎn)錄激活作用2 【7 l ( a c t i v a t i n g f u n c t i o n2 ) 。用重組質(zhì)粒p c d n a f l a g 。p h f 5 a 轉(zhuǎn)染h e l a 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)【7 】，p h f 5 a 的過(guò)量表達(dá)以劑量效應(yīng)的方式增強(qiáng)c x 4 3 的表達(dá)。在研究p h f 5 a 對(duì)c x 4 3 表達(dá)調(diào) 節(jié)作用是發(fā)現(xiàn)了一個(gè)十分奇特的現(xiàn)象，o l t r a 等人1 7 1 將p h f 5 a 與雌激素一同處理 小鼠，n o r t h e r n b l o t 分析表明，p h f 5 a 的m r n a 含量提高了，似乎表明p h f 5 a 的表達(dá)與受雌激素相關(guān)。 3 1 3p h f 5 a 對(duì)e r a 調(diào)節(jié)作用 雌激素受體( e r e 0 是配體依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子【2 4 , 2 5 1 ，屬核受體超家族成員。維 持雌性性征、卵泡發(fā)育、排卵等生理活動(dòng)2 5 ，26 1 ，并在子宮成熟和胚胎附植過(guò)程 中起著重要作用2 ”。 在研究p h f 5 a 對(duì)c x 4 3 調(diào)節(jié)作用時(shí)，o l t r a 等人【7 坼帶熒光素酶的重組質(zhì)粒 h e l 5 p h f 5 a 轉(zhuǎn)染到h e l a 細(xì)胞中，此質(zhì)粒只表達(dá)e r a 的轉(zhuǎn)錄激活作用i ( a f 1 ) 結(jié)構(gòu)域，在與只帶有熒光素酶而沒(méi)有e r a 的重組質(zhì)粒h e l 5 比較發(fā)現(xiàn)，熒光素 水平有明顯提高，暗示p h f 5 a 能夠增強(qiáng)e r c t 的活性，并且能夠激活a f l 7 , 2 8 。 隨后他們又構(gòu)建了重組質(zhì)粒h e o p h f 5 a ，此質(zhì)粒中可表達(dá)的e r a 的a f 一1 和轉(zhuǎn) 4 浙江理l ：人學(xué)碩士學(xué)位論文 錄激活作用2 ( a f 一2 ) 雙結(jié)構(gòu)域7 ，2 8 9 1 ，出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。但是當(dāng)用只表達(dá)a f 2 的載體h e l 9 構(gòu)建重組質(zhì)粒h e l 9 p h f 5 a ，轉(zhuǎn)染h e l a 細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，熒光素水平 并沒(méi)有明顯變化。這說(shuō)明p h f 5 a 能夠特異地與a f 1 結(jié)構(gòu)域作用。 3 2p h f 5 a 在p r e - m r n a 剪接中的作用 r n a 剪接( r n as p l i c i n g ) 是t r n a 、r r n a ，特別是m r n a 加工與成熟的重 要生物學(xué)過(guò)程，也是蛋白質(zhì)分子多樣性產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制之一f 3 0 , 3 1 。r n a 剪接 是一個(gè)多步驟、形成多種中問(wèn)狀態(tài)復(fù)合物的復(fù)雜過(guò)程。r n a 剪接需要多種因 子參與，包括雜性核r n a ( h e t e r o g e n e o u s n u c l e a r r n a ，h n r n a ) 結(jié)合蛋白 h n r n ( h e t e r o g e n e o u sn u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n ) 、小核r n a ( s m a l ln u c l e a rr n a ， s n r n a ) 結(jié)合蛋白s n 時(shí)姐( s m a l l n u c l e a rr i b o n u e l e o p r o t e i n ) 等【3 2 ，3 3 ，3 4 1 。 p h f 5 a 是一種與p r e m r n a 剪接相關(guān)的蛋白質(zhì)，2 0 0 2 年，o h i 等人對(duì)s c e r e v i s i a e 和p o m b e 中純化的復(fù)合物u 2 ，u 5 腳6s n 對(duì)妤進(jìn)行光譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了 p h f 5 a 1 3 5 】，同時(shí)如果阻斷t p h f 5 a 的表達(dá)，會(huì)產(chǎn)生剪接不完全的p r e m r n a t 6 ，15 1 。 通過(guò)r t - p c r 檢測(cè)正常細(xì)胞的p r e m r n a 與剔除了p h f 5 a 的細(xì)胞的p r e - m r n a ，發(fā) 現(xiàn)在突變體中p r e - m r n a 累積【6 】，這些p r e m r n a 是c d c 2 5 ，c d c 2 8 ，p r p l 2 ，它們編 碼的蛋白在細(xì)胞周期中具有重要的作用。在剔除了p h f 5 a 的細(xì)胞中除了有 p r e m r n a o b ，人們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期被阻滯在g 2 期【“，似乎表明在p r e m r n a 的剪 接中p h f 5 a 是必要的，同時(shí)一些有絲分裂必需因子m r n a 的形成也需要p h f 5 a 。 3 3p h f 5 a 在細(xì)胞周期中的作用 有絲分裂時(shí)從g 2 期到m 期的轉(zhuǎn)換i ： t c d c 2 有絲分裂周期蛋白的活性控制【3 6 1 。 有絲分裂中，c d c 2 c d c l 3 - - - - 聚體中的c d c 2 亞基處于活性狀態(tài)，其t h r - 1 5 沒(méi)有磷酸 化，而t h r - 1 6 1 被磷酸化。在起始點(diǎn)后，c d c 2 c d c l 3 二聚體的活性被t h r - 1 5 上增加 的磷酸基團(tuán)抑制p 引。因此，該抑制性磷酸基團(tuán)的去除是激活有絲分裂的關(guān)鍵。 c d c 2 5 編碼酪氨酸磷酸酶，該酶對(duì)c d c 2 c d c l 3 二聚體中c d c 2 的去磷酸化是必需的 3 9 4 1 1 。 在通常情況下，細(xì)胞分裂周期與細(xì)胞大小有關(guān)。w e e l 基因通常抑制細(xì)胞進(jìn) 入有絲分裂直到系細(xì)胞體積足夠大4 2 1 。w e e l 編碼異常類(lèi)型的激酶：它可以磷酸 浙江理l ：大學(xué)碩士學(xué)位論文 化s e r t h r 和t y r ，它通過(guò)磷酸化t h r - 1 5 抑帶1 c d c 2 4 3 , 4 4 1 。 w e e l 產(chǎn)物與c d c 2 5 的產(chǎn)物有拮抗作用。w e e l 的激酶活性作用在t h r - 1 5 上抑 制c d c 2 的功能”1 。c d c 2 5 的磷酸化活性作用在同一個(gè)位點(diǎn)上激活c d e 2 。c d c 2 5 過(guò)量表達(dá)的突變與w e e l 的缺失突變有相同的表型。因此，c d c 2 活性的調(diào)控對(duì)決 定酵母細(xì)胞何時(shí)允許自身進(jìn)入分裂循環(huán)很重要；被w e e l 抑制和被c d c 2 5 激活允 許細(xì)胞依賴(lài)環(huán)境或其它信號(hào)來(lái)控制這些調(diào)控因子。 2 0 0 3 年，w e r n e r 等人【”1 構(gòu)建p h f 5 a 缺失體，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變長(zhǎng)，失去有絲分 裂能力。而當(dāng)他們將構(gòu)建重組質(zhì)粒p j k - r e p 8 1 一p h f 5 a i ( 載體r e p 8 1 含有硫胺素 抑制啟動(dòng)子n m t 8 1 ) 轉(zhuǎn)染到p h f 5 a 缺失體中，記為a p h f s a l ，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞恢復(fù)有 絲分裂能力，當(dāng)用硫胺素處理a p h f 5 a 1 時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表型與p h f 5 a 缺失體相 同。 為了檢測(cè)w e e l 在a p h f 5 a 1 中是否起作用，w e m e r 等人剔除了w e e l 基 因，然后構(gòu)建了w e e l 5 0 p 嬲跗j 雙突變體。此雙突變體含有硫胺素抑制啟動(dòng) 子n m t s l ，又受溫度控制，在2 5 激酶w e e l 表達(dá)，而在3 6 就不會(huì)表達(dá)。經(jīng) 過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，如果在2 5 加入硫胺素，細(xì)胞仍會(huì)生長(zhǎng)，但如果在3 6 下，細(xì) 胞數(shù)目就會(huì)增多，出現(xiàn)異常有絲分裂，但8 小時(shí)后細(xì)胞會(huì)大量死亡。而在p h f 5 a 缺失體中細(xì)胞延長(zhǎng)，但不會(huì)死亡。這大概可能是因?yàn)閣 e e l 在p h f s a 缺失體起 保護(hù)作用。 3 4 在細(xì)胞d n a 損傷中的作用 d n a 破壞檢驗(yàn)點(diǎn)( d n ad a m a g ec h e c k p o i n t s ) 是指d n a 損傷引發(fā)的能使細(xì)胞周 期延遲或阻滯的生化調(diào)控途徑【舶1 ，它指在進(jìn)入到細(xì)胞周期的下一時(shí)相前對(duì)d n a 的完整性進(jìn)行檢測(cè)的一些特殊時(shí)點(diǎn)【4 7 1 。如果d n a 損傷，會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞反應(yīng)， 包括：( 1 ) 激活d n a 修復(fù)系統(tǒng)，修復(fù)受損的d n a ，使d n a 復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行；( 2 ) 激活 d n a 破壞檢驗(yàn)點(diǎn)，使細(xì)胞周期阻滯，以便細(xì)胞有充分的時(shí)間進(jìn)行修復(fù)，避免該 損傷遺傳至后代細(xì)胞；( 3 ) 使一些損傷嚴(yán)重、修復(fù)無(wú)望的細(xì)胞發(fā)生凋亡；( 4 ) 轉(zhuǎn)錄 某些特定的基因，以利于細(xì)胞的生存 4 8 - 5 1 】。 r a d 3 與屬于p 1 3 k 激酶家族 5 2 1 ，在d n a 損傷檢驗(yàn)點(diǎn)的活化中起著重要的作用 1 5 3 - 5 5 1 ，是作用于d n a 破壞檢驗(yàn)點(diǎn)早期的一種重要蛋白。 浙江理l 大學(xué)碩士學(xué)位論文 o l t r a 等人構(gòu)建了酵母p h f 5 a 的缺失菌株觀測(cè)d n a 受損后細(xì)胞的反應(yīng)，他們 檢測(cè)了& p o m b e 中的檢驗(yàn)點(diǎn)激酶r a d 3 。研究發(fā)現(xiàn)r a d 3 并沒(méi)有什么變化，細(xì)胞也沒(méi) 有出現(xiàn)修復(fù)的跡象【1 5 1 ，同時(shí)細(xì)胞仍然不能分裂，這似乎表明p h f 5 a 弓i 起的細(xì)胞 分裂中止現(xiàn)象是細(xì)胞本身不可修復(fù)的。他們隨后構(gòu)建了重組質(zhì)粒r e p 3 x p h f 5 a 轉(zhuǎn)染到缺失菌中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞又能進(jìn)行有絲分裂。 但是，t r a p p 等人在線蟲(chóng)中進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)【1 7 j ，在胚胎期和幼蟲(chóng)期缺 失了p h f 5 a 會(huì)引發(fā)線蟲(chóng)的死亡，而在成蟲(chóng)中缺失了p h f 5 a 不會(huì)誘發(fā)細(xì)胞的死亡。 4 展望 綜上所述，p h f 5 a 在基因表達(dá)、細(xì)胞周期、p r e m r n a 剪接等過(guò)程中發(fā)揮著 重要的作用。但是作為一種上世紀(jì)9 0 年代后期才發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，相關(guān)研究還不 是很多，蛋白質(zhì)的功能還不是很明確。比如：人們?cè)趐 r e m r n a 剪接復(fù)合體中發(fā) 現(xiàn)了p h f 5 a t ”1 ，可p h f 5 a 是參與p r e m r n a 剪接復(fù)合體的形成，還是作為剪接 復(fù)合體的一部分參與p r e - m r n a 的剪接；p h f 5 a 作為轉(zhuǎn)錄因子或協(xié)因子存在【7 1 ， 那么它調(diào)控哪些基因的表達(dá)，具體調(diào)控機(jī)制又是怎樣的? 另外，人們發(fā)現(xiàn)p h f 5 a 在幼體中是必不可少的，而在成體的缺失體又不是致死的【”】，這又是為什么? 在d n a 損傷時(shí)會(huì)引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，但是當(dāng)p h f 5 a 缺失時(shí)，細(xì)胞既沒(méi)有激活 修復(fù)系統(tǒng)，也沒(méi)使這些無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞發(fā)生凋亡，那么在細(xì)胞中應(yīng)該有一種代償 機(jī)制，此機(jī)制雖然無(wú)法使細(xì)胞繼續(xù)分裂，但卻能夠使細(xì)胞生存，此機(jī)制到底是什 么，又是怎樣發(fā)揮作用的? p h f 5 a 的保守性相當(dāng)高，但是它的分布又具有局限 性，那么p h f 5 a 是如何進(jìn)化而來(lái)得，為什么只在真核生物中表達(dá)，原核生物中 到底有沒(méi)有這種蛋白質(zhì)，在真核生物中它最基本的功能到底是什么? 它能否作為 進(jìn)化的標(biāo)尺? 鑒于p h f 5 a 的高保守性，我們有理由相信它在生物體的發(fā)育過(guò)程 中扮演非常重要的角色。相信在不遠(yuǎn)的未來(lái)，p h f 5 a 的功能及其保守原因都會(huì) 更清楚。 浙江理 大學(xué)碩十學(xué)位論文 第二章b m p h f s a 的生物信息學(xué)分析 1 生物信息學(xué)工具 用b l a s t 軟件( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 在g e n b a n k q 6 對(duì)獲得的 家蠶新基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，之后使用生物軟件網(wǎng)在線b l a s t 工 具( h t t p ：w w w b i o - s o f t n e t ) 尋找o r f 框，并預(yù)測(cè)其氨基酸序列及基本性質(zhì)，再 用此氨基酸序列在n c b i 進(jìn)行b l a s t l l ：對(duì)，查找同源蛋白質(zhì)，根據(jù)同源蛋白質(zhì)的 性質(zhì)預(yù)測(cè)其功能。并用b i o e d i t 軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。并用在線工具p r o t s c a l e 、 t m h m m 、s i g n a l p 對(duì)p h f 5 a 進(jìn)行疏水性分析，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)。 2 生物信息學(xué)分析 2 1b m p h f 5 a 的基因分析結(jié)果 2 1 1 b m p h f 5 a 的基因分析 將本實(shí)驗(yàn)室的e d n a 序列在家蠶基因組比對(duì)確定后，用在線軟件分析o r f ，在 n c b i 上比對(duì)后，推測(cè)為p h f 5 a ，下表兩方框內(nèi)的部分即為p h f 5 a 的o r f ，按 57 端到3 的方向，依次為起始密碼子與終止密碼子。此基因編碼1 l o 個(gè)氨基 酸，在基因的3 u t r 處有三個(gè)加尾信號(hào)。 1 g t t t g 硝瞻a t a a c a a t c a a a g a a c a t t c g c c a g c a g a c c a g a c c 唧嫩t j 玨a a a d 酊g | g c ma 6 1 a a a g c a t c a t c c a g a t t t a a t t t t c t g c a g g a a a c a g c c c g g a g t c g c t a t t g g a c g t t t khh pdl ifcr kq p gva工grl 1 2 1 a t g t g a g a a a t g t g a c g g a a a a t g t g t g a t t t g c g a t t c t t a t g t g c g t c c g t g c a c g t t cekc d gk cv工c d syvr p ct l 1 8 1 g g t t c g t a t t t g t g a c g a g t g c a a c t a t g g c t c g t a t c a g g g g c g a t g t g t g a t t t g c g g vr i c de cny g syqgrcv工c g 2 4 1 c g g g c c t g g a g t a t c t g a t g c t t a t t a _ r t g t a a g g a g t g c a c g a t a c a g g a g a a g g a t a g gp gvs day y c ke c ti q e kdr 3 0 1 a g a t g g c t g t c c a a a g a t t g t c a a t t t g g g a a g c t c t a a a a c a g a t c t g t t c t a c g a g a g d gc pk ivnlgss k td lfyer 3 6 1 a a a g a a a t a t g g g t t t a g g a g a c a d t a g 阻t t a g g t t t c t t t t t a g t t t t t a a a t a t t a a kk y gf r rh 4 21 t t t c t g c a a a g t t t c t g t t a t t t a a a a t a a t a a a a a c a g a g g t t t t t c t c a a c t a a a g t t 4 8 1 t g a t t g a a a t a c a a g t t t g t t t t t a t c a a c t a c t t t g t t g t t g a c t t t t t a a a g c c a a c g 5 41 g c t a t t a t g a t c a a g t a t g g t t t t c a a t g t c t a a a g a g t t g c a g c t c g g g t c c a a g a g a a 浙江理f ：人學(xué)碩士學(xué)位論文 6 0 1a t t c a c a t a t a t t t t t t t a a a t t c a t t c a t t t a t a c a a t t g g a t 粥t 粥t i a t c g a t g a t 6 6 1 a t c t g t t a t t t t t t t a c a a t t t t t t t t a t c c t t t g t t t a t t c a a t g c a g a t t a g t t t t c a 7 21t t t t c c a a c t a g a a a g a a a a t a c t t g a a a a a t a c a t t t a g t t t t t g c a 唧a a a t t a t t a 7 8 1 a g a t t c a t t t t t a t t t t t t a t t t t t c t a c t a a a t t g t c a a t a a a g a t a t t t t t g a c t a c c 8 41 a t g t g c t c t g t a a a a c t a c a g a c a a t a t g t t a g c a a t a t t c a t g t a t g t a a t g a g a g t g a 9 0 1 t t g t a c t g t g t g a a t g t t g t c t g t c a t a t t t t g a a a a c t a t g t t t c t a g t g t g t a c t t a c 9 6 1 a t t a a g a c a t t a t g t a a t t a t t a a t a a a t g c a t t g g t a t t a c a c 2 1 1 口朋f 糾基因的結(jié)構(gòu)分析 我們將b m p h f 5 a 的e d n a 在家蠶基因組中比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，m p h f 5 a 基因由三 個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成，結(jié)果如圖2 1 ，其中最兩端的用白色方框表示的部 分從左至右依次為5 u t r 和3 u t r ，黑色方框表示o r f ，黑色方框內(nèi)的線段 表示內(nèi)含子，各部分下面的數(shù)字表示各部分的堿基數(shù)。另外，如圖所示，5 u t r 和3 u t r 分別與o r f 的5 7 端和37 端相連。 5 二】 二 a 5 5 5 27 4 1 9 1 4 4 49 0 6 1 5 2 2 保守性分析 圖2 1b m p h f s a 基因的結(jié)構(gòu)示意圖 f i g2 1t h es c h e m a t i cs t r u c t u r eo f b m p h f s a 經(jīng)過(guò)b l a s t 比對(duì)確認(rèn)該基因編碼1 1 0 個(gè)氨基酸。所預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量大約 為1 2 4 7k d a ，等電點(diǎn)約為8 4 。對(duì)該蛋白進(jìn)行同源性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)該蛋白是相當(dāng) 保守的，家蠶p h f 5 a 與人、