（特種經(jīng)濟(jì)動物飼養(yǎng)專業(yè)論文）蜜蜂apis+mellifera+l幼蟲級型分析差異蛋白質(zhì)組分析.pdf

-1，j，i 。，一碉4 i，j_、。； t 駕 原創(chuàng)性聲明 j i i i ii ii ii i i i i i iii iii iiij y 18 3 3 8 8 0 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究 所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集 體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均 已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者： 舅，穩(wěn) 日期：五移f9 年歲月3 移日 學(xué)位論文使用授權(quán)聲明 本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。 根據(jù)鄭州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門 或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué) 可以將本學(xué)位論文的全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印 或者其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文 或與該學(xué)位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。 保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。 學(xué)位論文作者： 舅、靜 日期：p 9 年琴y j3 移日 _j 摘要 摘要 蜜蜂是社會性昆蟲，具有典型的級型分化現(xiàn)象。蜂群中蜂王和工蜂雖然同為 雌性蜂，但只有蜂王具有生殖能力而工蜂沒有，不同的級型蜂具有不同的蛋白質(zhì) 組。因此，分析蜜蜂級型分化期發(fā)育蛋白質(zhì)組的特點(diǎn)，比較其蛋白質(zhì)表達(dá)譜的時 空差異，將對蜜蜂生物學(xué)研究和揭示蜜蜂級型分化的分子機(jī)理具有一定意義。 本研究利用雙向電泳技術(shù)，分析比較蜂王和工蜂級型分化期的蛋白質(zhì)組的 特點(diǎn)，利用生物信息方法鑒定部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能，進(jìn)而依其功能對鑒定 蛋白分類和生化通路分析。結(jié)果表明，在幼蟲3 日齡和5 日齡時，蜂王分別表達(dá) 2 8 8 個和2 4 7 個蛋白質(zhì)；而工蜂在3 日齡和5 日齡時分別表達(dá)了2 5 9 個蛋白質(zhì)和 2 3 6 個蛋白質(zhì)；到蛹1 1 日齡時，蜂王頭部蛋白質(zhì)組有3 1 1 個蛋白質(zhì)，明顯高于工 蜂頭部表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)( 2 7 8 個) 。3 日齡時，兩種級型蜂共有蛋白質(zhì)為1 5 6 個， 而蜂王和工蜂的特異蛋白質(zhì)分別為1 3 2 個和1 0 3 個；到幼蟲5 日齡時，兩級型蜂 共有蛋白質(zhì)點(diǎn)為9 5 個，而蜂王特異蛋白質(zhì)點(diǎn)為1 7 9 個，工蜂特異蛋白質(zhì)點(diǎn)為1 4 1 個；到蛹1 1 日齡時，蜂王和工蜂頭部共有蛋白質(zhì)點(diǎn)為1 9 4 個，而蜂王的特異蛋 白質(zhì)點(diǎn)為1 1 7 個，工蜂特異蛋白質(zhì)點(diǎn)為8 4 個。蜂王和工蜂的蛋白質(zhì)表達(dá)譜存在 顯著差異，蜂王表達(dá)的蛋白質(zhì)總數(shù)和特有蛋白質(zhì)數(shù)都較工蜂多，說明蜂王的基因 表達(dá)較工蜂更加旺盛。發(fā)育中所表達(dá)的共有蛋白質(zhì)可能是他們發(fā)育所必須的管家 蛋白質(zhì)，但它們在級型中的表達(dá)模式卻存在較大差異。在三個日齡中蜂王和工蜂 有大量差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這表明在級型分化中，蜂王和工蜂需要不同的蛋白質(zhì) 來調(diào)節(jié)各自的發(fā)育。 利用m a l d i t o f m s 對6 0 個蜂王和工蜂差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定并依 照蛋白質(zhì)在蜜蜂發(fā)育過程中行使的功能，將這些鑒定的蛋白質(zhì)分為8 個功能類 別：碳水化合物代謝和能量產(chǎn)生類蛋白質(zhì)( 3 5 ) 、蛋白質(zhì)和脂肪酸代謝的蛋白 質(zhì)( 1 7 ) ，抗氧化類蛋白質(zhì)( 1 5 ) 、發(fā)育類蛋白( 1 2 ) 、營養(yǎng)儲存類蛋白質(zhì) ( 1 0 ) 、具折疊功能類蛋白質(zhì)( 6 ) 和轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)( 4 ) 、及未知功 能的蛋白質(zhì)( 1 ) 。 其中，代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)量最多，說明幼蟲期的兩級型蜂代謝旺盛， 都需要大量的能量來完成生長發(fā)育，同時，對蜂王和工蜂在兩個日齡差異蛋白質(zhì) 表達(dá)量的聚類發(fā)現(xiàn)，蜂王在發(fā)育過程中，上調(diào)了較多碳水化合物代謝和能量生產(chǎn) t 摘要 類蛋白質(zhì)，這說明能量需求可能是導(dǎo)致幼蟲進(jìn)化為蜂王的一個原因。 將3 日齡和5 日齡的蜂王和工蜂6 0 個差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行生化通路分析發(fā) 現(xiàn)，2 4 個蛋白是在發(fā)育中起關(guān)鍵作用的節(jié)點(diǎn)蛋白，它們是：a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ，a l d e h y d er e d u c t a s e ， a t ps y n t h a s eb e t as u b u n i t ，b e l l w e t h e r ， e n o l a s e ，p h o s p h o g l y c e r a t em u t a s e ，t r a n s k e t o l a s e ，l e o n a r d o ， 14 3 3p r o t e i n e p s i l o n ， a c t i n - 8 7 ei s o f o r m2 ， c a t h e p s i nd ，i m a g i n a ld i s cg r o w t hf a c t o r4 ， l e t h a l ( 2 ) 3 7 ，a r g i n i n ek i n a s e ，f a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n ，p r o t e a s o m es u b u n i ta l p h a t y p e5 ，p e r o x i r e d o x i n2 5 4 0 ，g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s es1 ，t h i o r e d o x i np e r o x i d a s e 1 ，h e a ts h o c kp r o t e i nc o g n a t e3 ，e r p 6 0 ，l a r v a ls e r u mp r o t e i n2 ，t r a n s l a t i o n a l c o n t r o l l e dt u m o rp r o t e i n 。這些節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)不僅對于幼蟲的生長發(fā)育必不可少，而 且為進(jìn)一步研究和驗(yàn)證級型分化提供了目標(biāo)蛋白質(zhì)。 關(guān)鍵詞：蜜蜂；級型分化；雙向電泳；蛋白質(zhì)組 i i a b s t r a c t a b s t r a c t t h eh o n e y b e e ( a p i sm e l l i f e r al ) i sae u s o c i a li n s e c tt h a th a st y p i c a lo ft h ec a s t e d i f f e r e n t i a t i o n i nt h ec o l o n y , t h eq u e e na n dw o r k e ra r eb o t hf e m a l e ，b u to n l yt h e q u e e nb e eh a sr e p r o d u c t i v ec a p a c i t y c o m p a r i s o no f t h ep r o t e o m ed i f f e r e c eb e t w e e n t h et w oc a s t e sw i l lh e l pu n d e r s t a n d i n gm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fh o n e y b e ec a s t e d i f f e r e n t i a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t2 8 8a n d2 7 4p r o t e i n sw e r ed e t e c t e di nt h ep r o t e o m e p r o f i l eo fq u e e nl a r v a so nd a y3a n dd a y5 ，r e s p e c t i v e l y , a n dw o r k e re x p r e s s e d2 5 9 a n d2 3 6p r o t e i n so nd a y3a n d5o l dl a r v a e ，r e s p e c t i v e l y a l s o ，i nt h eh e a do f11 一d a y p u p a e s ，e v i d e n t l yh i g h e rn u m b e ro ft o t a lp r o t e i n s ( 3 11 ) w a sd e t e c t e di nq u e e nt h a n t h o s eo fw o r k e r ( 2 7 8 ) o nt h et h i r dd a y , 15 6p r o t e i n sw e r ed e t e c t e di nb o t hq u e e na n d w o r k e rl a r v a e s ，w h i l e13 2p r o t e i n sw e r es p e c i f i ct oq u e e nl a r v a e ，a n d10 3p r o t e i n s w e r ee x c l u s i v et ow o r k e r sl a r v a e w h i l eo nt h ef i f t h sd a y , l a r v a e so fq u e e na n d w o r k e rh a d9 5s h a r e dp r o t e i n s ，17 9a n d141p r o t e i n sw e r es p e c i f i ct oq u e e nl a r v a e s a n dw o r k e rl a r v a e s ，r e s p e c t i v e l y a tt h ee l e v e n t hd a y , 19 4p r o t e i n sw e r ed e t e c t e d c o m m o n l yi nt h eh e a do fq u e e na n dw o r k e r s ，w h i l e117a n d8 4p r o t e i n sw e r eu n i q u e t ot h eh e a d so fq u e e na n dw o r k e r , r e s p e c t i v e l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sh a db e e nf o u n d i n t h ep r o t e o m eb e t w e e nq u e e na n dw o r k e rd u r i n gt h ep r o c e s so fc a s t ed i f f e r e n t i a t i o n w h i l et h ei n c r e a s e dn u m b e ro ft o t a la n ds p e c i f i cp r o t e i n si nq u e e n si sl i k e l yt h a tt h e m e t a b o l i cr a t eo fq u e e n si sh i g h e rt h a nt h a to fw o r k e r s t h ep r o t e i n sb o t hi nq u e e n a n dw o r k e rs u g g e s tt h a tt h e ys h o u l db ei n d i s p e n s a b l ef o rd e v e l o p m e n t ，b u tt h e i r e x p r e s s i o np a t t e r n sa r ed i f f e r e n tb e t w e e nt h et w ob e ec a s t e s am a s so fp r o t e i n s d i f f e r e n t l ye x p r e s s e da te a c ht i m e - p o i n ti n d i c a t et h a td i f f e r e n tc a s t ed e v e l o p m e n t a l s t a g e sn e e dd i f f e r e n tp r o t e i n st ob ei n v o l v e di n 6 0p r o t e i n sw h i c hd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e db e t w e e nt h ew o r k e ra n dq u e e nl a r v a e o nd a y3a n d5w e r es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e db ym a l d i - t o fa n dc a t e g o r i z e di n t o8 f u n c t i o n a lg r o u p s ，i e c a r b o h y d r a t em e t a b o l i s ma n de n e r g yp r o d u c t i o n ( 35 ) ，a m i n o a c i da n df a ta c i dm e t a b o l i s m ( 1 7 ) ，a n t i o x i d a n ts y s t e m ( 1 5 ) ，d e v e l o p m e n t ( 1 2 ) ， p r o t e i n f o l d i n g ( 10 ) ，t r a n s c r i p t i o n t r a n s l a t e ( 6 ) ，n u t r i t i o ns t o r a g e ( 4 ) a n d i i i a b s t r a c t u n k n o w n ( 1 ) t h el a r g e s tg r o u po f t h ei d e n t i f i e d p r o t e i n s w a s c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s ma n de n e r g yp r o d u c t i o n ，i n d i c a t i n gt h a tt h ed e v e l o p m e n t sb o t ho ft h et w o c a s t e sn e e dal o to fe n e r g yf o r t h el a r v a l d e v e l o p e m n t d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d p r o t e i n sb e t w e e nt h ew o r k e ra n dt h eq u e e nl a r v a ew e r ec l u s t e r e d ，a n df i n d i n gt h a t q u e e nl a r v a eu p r e g u l a t em o r ep r o t e i n sr e l a t e dt oc a r b o h y d r a t em e t a b o l i s ma n de n e r g y p r o d u c t i o nt h a nw o r k e rl a r v a ei n d i c a t i n ge n e r g yr e q u i m e n ti sp r o b a b l yad r i v i n gf o r c e f o rt h el a v ab e c o m i n gaq u e e n w h e np l a c e dt h e6 0i d e n t i f i e dp r o t e i n st l l a td i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e db e t w e e nt h e w o r k e ra n dt h eq u e e nl a r v a eo nd a y3a n d5i n t ob i o l o g yn e t w o r k , 2 4k e yn o d e p r o t e i n sw e r ed e t e c t e d ，i n c l u d i n g ，a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，a l d e h y d er e d u c t a s e ，a t p s y n t h a s eb e t as u b u n i t ，b e l l w e t h e r , e n o l a s e ，p h o s p h o g l y c e r a t em u t a s e ，t r a n s k e t o l a s e ， 14 3 3p r o t e i ne p s i l o n ，a c t i n 一8 7 ei s o f o r m2 ，c a t h e p s i nd ，i m a g i n a ld i s cg r o w t hf a c t o r 4 ，l e t h a l ( 2 ) 3 7 ，a r g i n i n ek i n a s e ，f a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n ，p r o t e a s o m es u b u n i ta l p h a t y p e5 ，p e r o x i r e d o x i n2 5 4 0 ，g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s es1 ，t h i o r e d o x i np e r o x i d a s e1 ， h e a ts h o c kp r o t e i nc o g n a t e3 ，e r p 6 0 ，l a r v a ls e r u mp r o t e i n2 ，t r a n s l a t i o n a lc o n t r o l l e d t u m o rp r o t e i n t h e s ep r o t e i n sn o to n l ya r ei n d i s p e n s a b l ei nc a s t ed i f f e r e n t i a t i o no fb e e ， b u ta l s o h e l pt op r o v i d et a r g e tp r o t e i n s f o r f u r t h e r v e r i f i c a t i o no ft h ec a s t e d i f f e r e n t i a t i o n k e yw o r d s ：h o n e y b e e ( a p i sm e l l i f e r al ) ；c a s t ed i f f e r e n t i a t i o n ；t w o d i m e n s i o n a l g e le l e c t r o p h o r e s i s ；p r o t e o m e i v 目錄 目錄 第一章引言1 1 1 研究目的和意義+ l 1 2 研究問題的提出1 1 3 研究的背景2 1 4 文獻(xiàn)綜述3 i 4 i 蜜蜂級型分化在營養(yǎng)和激素方面的研究進(jìn)展3 1 4 2 蜜蜂級型分化在分子和蛋白質(zhì)組方面的研究進(jìn)展4 1 5 研究方法6 1 6 論文結(jié)構(gòu)安排6 第二章蜜蜂幼蟲期蜂王和工蜂蛋白質(zhì)組成及發(fā)育特點(diǎn)比較7 2 1 材料和方法7 2 1 1 試劑7 2 i 2 儀器1 1 2 i 3 取樣1 2 2 1 4 幼蟲期蛋白提取、蛋白質(zhì)濃度測定及雙向電泳( 2 - d e ) 1 2 2 1 5 圖像分析1 2 2 2 結(jié)果1 3 2 2 i 蜂王和工蜂幼蟲期蛋白質(zhì)組圖譜1 3 2 2 2 蜂王與工蜂3 日齡幼蟲蛋白質(zhì)組比較1 5 2 2 3 蜂王與工蜂5 日齡幼蟲蛋白質(zhì)組比較_ 1 5 2 2 4 蜂王與工蜂日齡間比較1 5 2 2 5 幼蟲期蜂王與工蜂形態(tài)發(fā)育比較j 1 7 2 3 討論1 8 第三章蛹期蜂王和工蜂頭部蛋白質(zhì)組成及發(fā)育特點(diǎn)比較2 0 3 1 材料和方法2 0 3 1 1 取樣2 0 3 2 結(jié)果2 l v 目錄 3 2 1 蜂王和工蜂蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜分析2 1 3 2 21 1 日齡的蜂王與工蜂蛹頭部蛋白質(zhì)比較2 3 3 2 31 1 日齡的蜂王與工蜂蛹發(fā)育形態(tài)比較2 4 3 3 討論2 5 第四章蜜蜂幼蟲期級型發(fā)育蛋白功能鑒定與生化通路分析2 7 4 1 材料和方法2 7 4 1 - 1 試劑2 7 4 1 2 儀器2 8 4 1 3 膠內(nèi)酶切和g i a l d i - t o f 質(zhì)譜分析2 8 4 1 4 蛋白鑒定2 8 4 1 5 對蛋白質(zhì)表達(dá)量聚類分析2 9 4 1 6 生物通路分析2 9 4 2 結(jié)果2 9 4 2 1 幼蟲期蜂王和工蜂差異表達(dá)蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定2 9 4 2 2 鑒定出差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分類和表達(dá)量聚類分析3 l 4 2 3 鑒定出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)生化通路分析3 6 4 3 討論5 5 第五章結(jié)論5 7 5 1 階段性成果及意義5 7 5 2 結(jié)論5 8 參考文獻(xiàn)一6 0 第一章6 0 第二章6 2 第三章6 3 第四章6 4 個人簡歷與論文發(fā)表情況6 6 致謝j 6 7 v i 第一章引言 第一章引言 1 1 研究目的和意義 在對社會性昆蟲的研究中，最古老且具挑戰(zhàn)性的問題就是群落中生殖能力 不同的兩種級型間的發(fā)育【l 】。蜜蜂是高度社會化的昆蟲，蜂群中有蜂王和工蜂兩 種級型的雌蜂。蜂王和工蜂都是由遺傳信息完全相同受精卵發(fā)育而來，僅僅由 于生長環(huán)境的不同，而使它們在外表形態(tài)、生殖能力、生命周期、社會職能等 方面相差甚遠(yuǎn)【2 】。級型分化過程中涉及器官發(fā)育，營養(yǎng)調(diào)節(jié)，激素調(diào)控，和社會 分工等眾多問題，這些問題的解讀不但可以推動蜜蜂生物學(xué)的發(fā)展，而且有助 于社會行為學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、行為遺傳學(xué)、免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的研究。 因此，級型分化是蜜蜂學(xué)研究中的熱點(diǎn)，早在1 8 世紀(jì)科學(xué)家們就利用互換 培育試驗(yàn)，來研究蜂王和工蜂級型分化的特點(diǎn)1 3 j 。隨著，蜜蜂基因組序列的完成 h ，蜜蜂級型分化在分子和蛋白水平的研究也更加便利。兩級型蜂在營養(yǎng)水平， 激素水平和基因水平的差異都會一定程度地體現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平上，通過蛋白質(zhì) 組的研究可以直接了解生命活動的進(jìn)程。國內(nèi)外已有對蜜蜂不同時期發(fā)育蛋白 質(zhì)組的研究【5 】，這為利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究蜜蜂級型分化打下了基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)的研究目的是揭示蜜蜂級型分化的分子機(jī)理。首先，通過對蜂王和 工蜂在級型分化時期蛋白質(zhì)組的分析比較，來尋找雌性蜜蜂級型間的差異蛋白。 之后，對這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行功能驗(yàn)證，并對結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。最終 了解這些特異蛋白質(zhì)在級型分化中所起的作用，從而推動蜜蜂級型分化的研究。 用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究蜜蜂級型分化，不但為在基因調(diào)控，激素誘 導(dǎo)等方面研究級型分化提供了證據(jù)和思路，也為從生化水平上研究級型分化開 辟了道路。對于推動蜜蜂生物學(xué)乃至昆蟲學(xué)研究起到了積極的作用。 1 2 研究問題的提出 進(jìn)入后基因組時代后，蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究越來越受到關(guān)注，作為生物 體必不可少的大分子，蛋白質(zhì)在生命活動中起著重要的調(diào)節(jié)作用，對于蛋白質(zhì) 在生物體內(nèi)功能性的研究方興未艾。蜜蜂作為一種重要的模式生物，廣泛用于 眾多學(xué)科的研究領(lǐng)域刁】，級型分化是蜜蜂學(xué)研究的一個熱點(diǎn)，但在蛋白質(zhì)組學(xué) 1 第一章引言 方面的研究卻較少。在蜜蜂級型分化過程中蜂王和工蜂由孵化后完全相同的小 幼蟲，在營養(yǎng)環(huán)境的作用下慢慢發(fā)育為形態(tài)和器官各異的兩種級型蜂。這個過 程涉及眾多蛋白質(zhì)的表達(dá)和調(diào)節(jié)，利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)可以直接、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn) 級型間蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律，對蜜蜂級型分化的研究有一定幫助。 1 3 研究的背景 蜜蜂在人類生活中扮演重要角色，它不但為人類提供眾多營養(yǎng)豐富的食品， 而且對人類賴以生存自然環(huán)境也起著重要作用。植物需要授粉繁衍，而動物以 植物為食，因此蜜蜂是生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中起的橋梁，是許多動植物生存的保障。 也是生命科學(xué)中重要的模式生物，蜂王和工蜂在壽命長短和發(fā)育進(jìn)程中的差異 為研究衰老機(jī)制，神經(jīng)發(fā)育提供了良好素材【引。 蜜蜂是典型的社會性昆蟲，蜂群內(nèi)由兩種性別三種級型的蜜蜂個體組成， 即工蜂、蜂王和雄蜂。雄蜂由未受精卵發(fā)育而來，為單倍體，蜂王和工蜂都是 二倍體，由受精卵發(fā)育而來，蜂王和工蜂雖然都是雌性蜂，但只有蜂王具有生 殖能力而工蜂沒有。蜂王和工蜂在外部形態(tài)、內(nèi)部解剖、生理和行為上都存在 較大差異【9 】。從解剖學(xué)上看，蜂王通常有近2 0 0 個卵巢，每日可生產(chǎn)數(shù)千粒卵； 而工蜂僅有2 至1 2 個卵巢，一般不具有生殖能力【1 0 】。從外部形態(tài)看，蜂王身體較 工蜂重，體長是工蜂的1 3 3 倍。而且它們頭部形狀也不相同，正面觀蜂王頭部呈 心臟形，而工蜂的呈倒三角形，蜂王的上顎較工蜂略大，基部也更粗壯以便于 在羽化時能咬開繭衣出王臺。在足部，工蜂的足除了行走外，還有采集和攜帶 花粉的特化器官，而蜂王的這些特化構(gòu)造已退化【l l 】。這些都生理構(gòu)造的差異與 它們的社會分工有關(guān)，蜂王生殖器官發(fā)育完全，專門負(fù)責(zé)產(chǎn)卵繁衍后代；工蜂 的特化器官則可以幫助工蜂在蜂群進(jìn)行采集、哺育、建設(shè)、防衛(wèi)和清掃等工作。 導(dǎo)致受精卵幼蟲發(fā)育成蜂王或工蜂是營養(yǎng)調(diào)控的結(jié)果。蜂王和工蜂都是由受 精卵發(fā)育而來的雌性。出生在王臺中的幼蟲被連續(xù)飼以過量的王漿，漸漸發(fā)育 成蜂王；出生在工蜂巢房中的幼蟲在被飼以三天工蜂漿就開始進(jìn)食花粉和蜂蜜 從而慢慢發(fā)育為工蜂，所處營養(yǎng)環(huán)境的不同是造成幼蟲發(fā)育為不同的級型的直 接原因【1 2 。1 3 1 。營養(yǎng)環(huán)境的不同也使兩級型蜂在級型發(fā)育時激素的分泌有所不同 【1 4 】 o 在幼蟲期，蜂王保幼激素的分泌量始終高于工蜂【1 2 1 3 】，蜂王發(fā)育n 5 日齡 2 第一章引言 后期時，所分泌保幼激素的滴度是同時期工蜂分泌保幼激素滴度的2 6 倍【l5 1 。咽 側(cè)體分泌的保幼激素是一種多效性激素，在昆蟲的生長，發(fā)育，繁殖和免疫反 應(yīng)等方面都有影響，但它在級型發(fā)育方面作用更為顯著。在幼蟲期，保幼激素 可以提高卵黃原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平，和卵黃原蛋白的合成速率，從而促進(jìn)卵 黃，卵子，和生殖器官的成熟【9 】。同時蛻皮激素也參與了級型分化的調(diào)節(jié)，體 外實(shí)驗(yàn)表明，蛻皮激素濃度的變化與兩種級型分化特征蛋白的表達(dá)量變化相一 致【1 6 j 。 現(xiàn)已證明造成兩級型蜂的差異，是基因差異表達(dá)的結(jié)果，而不是遺傳多態(tài) 性，蜂王和工蜂有相同的基因組，卻有不同的基因表達(dá)模式，在發(fā)育過程中， 工蜂上調(diào)表達(dá)了較多發(fā)育基因，而蜂王在代謝相關(guān)的基因上的過表達(dá)的，表達(dá) 模式的不同最終導(dǎo)致蜂王和工蜂具有不同的蛋白質(zhì)組。目前對蜜蜂級型分化已 從營養(yǎng)、激素和基因組方面進(jìn)行了較為翔實(shí)的研究，但利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方 法研究蜜蜂級型間發(fā)育的相關(guān)文獻(xiàn)還未見報(bào)到。而近年來，國內(nèi)外已對蜜蜂不 同發(fā)育時期的蛋白質(zhì)組的研究壚 1 7j ，為研究蜜蜂級型發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)提供了打下 基礎(chǔ)。 可本文通過分析蜂王和工蜂這兩種級型蜂在不同發(fā)育時期蛋白質(zhì)組的特點(diǎn)， 比較其蛋白質(zhì)表達(dá)譜的時空差異，并對部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和 代謝通路驗(yàn)證，分析這些蛋白質(zhì)表達(dá)差異在級型分化中所起的作用，以期揭示 級型分化的分子機(jī)理。這可以為研究影響級型分化的因素提供參考，也從生化 水平上研究級型分化開辟了道路。 1 4 文獻(xiàn)綜述 1 4 1 蜜蜂級型分化在營養(yǎng)和激素方面的研究進(jìn)展 級型分化是社會性昆蟲的主要特征之一，即遺傳基礎(chǔ)相同的雌性分化為生 殖個體和非生殖個體。蜜蜂是典型的社會性昆蟲，蜂王和工蜂雖然都是雌性蜂， 但只有蜂王具有生殖能力而工蜂沒有。導(dǎo)致受精卵幼蟲發(fā)育成蜂王或工蜂是營 養(yǎng)調(diào)控的結(jié)果，它們在幼蟲期所處的營養(yǎng)環(huán)境決定了它們的發(fā)育方向。蜂王被 養(yǎng)育在王臺中，而工蜂被養(yǎng)育在普通的巢房中，王臺底部為圓型臺口垂直向下， 容積比普通的巢房大【l 引。哺育蜂能區(qū)分這兩種巢房，從而對蜂王和工蜂幼蟲分 別飼以不同質(zhì)和量的食物。在幼蟲期，蜂王被連續(xù)飼以過量王漿，飼喂次數(shù)是 3 第一章引言 工蜂幼蟲的1 0 倍以上【l 引。研究發(fā)現(xiàn)，卵孵化后的1 3 日內(nèi)，飼喂蜂王幼蟲的王漿 中總糖( 葡萄糖、果糖、蔗糖) 含量是工蜂漿的4 倍【2 0 】，到4 5 日齡的蜂王幼蟲被 飼喂的食物中，含糖量會進(jìn)一步提高【19 1 ，食物中的糖可以刺激蜜蜂幼蟲取食， 有加快進(jìn)食及發(fā)育的作用【2 m 2 1 。在工蜂漿加入一定比例的葡萄糖和果糖蔗糖飼 喂工蜂幼蟲，可以培育出蜂王；當(dāng)加入乳糖、半乳糖、海藻糖等其它糖時可培 育出和蜂王外貌相似的成蜂【2 0 l 。由此可見幼蟲食物中的糖含量對蜜蜂級型分化 有重要的影響。除含糖量外，工蜂漿和王漿的成分也不同，哺育蜂上顎腺分泌 物的含量較高，而工蜂漿成分中，哺育蜂舌腺分泌物所占比例較大【l9 1 ，這也可 能是導(dǎo)致兩級型蜂在體重、發(fā)育速度、生殖能力等方面，出現(xiàn)差異的另一個原 因。 營養(yǎng)啟動幼蟲的級型分化，使蜂王和工蜂產(chǎn)生不同的內(nèi)分泌信號，從而分 泌不同的激素調(diào)節(jié)級型分化。研究發(fā)現(xiàn)，5 齡后期的蜂王幼蟲分泌大量保幼激素 是同期工蜂的二十多倍l l 引，保幼激素可以幫助幼蟲卵巢的發(fā)育，蜂王和工蜂在 生殖水平的差異，主要是由于9 5 的工蜂卵巢細(xì)胞退化造成的l 2 3 】，用保幼激素處 理在5 齡末的工蜂幼蟲，會使其卵巢中細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象明顯減少。同時蛻皮激素在 兩級型蜂中的表達(dá)情況也不同。蜜蜂前胸腺分泌蛻皮激素可作為一種級型分化 指示激素，在喀蜂級型分化時它的濃度變化與兩種級型分化特征的蛋白 ( 2 9 k d a p 1 4 6 乘1 2 4 k d a p 1 5 2 - 5 5 ) 的表達(dá)量一致【2 4 j 。在預(yù)蛹期，蛻皮激素的單 一峰在蜂王中出現(xiàn)的較早，這可能與蜂王和工蜂的發(fā)育進(jìn)程有關(guān)，蜂王比工蜂 提前進(jìn)入蛹期。除了保幼激素和蛻皮激素之外，促前胸腺激素和生物胺如多巴 胺、去甲腎上腺素、章魚胺和5 羥色胺，在幼蟲階段也對級型分化有調(diào)節(jié)作用 1 9j 。體外試驗(yàn)表明，章魚胺和和5 羥色胺、章魚胺類似物可增加工蜂幼蟲后 期的咽側(cè)體中的保幼激素的滴度，刺激保幼激素的釋放【2 5 】。同時，外激素對級型 的發(fā)育也會有一定影響，對熊蜂中研究發(fā)現(xiàn)，受蜂王外激素影響的幼蟲發(fā)育成 工蜂，而不受其影響的幼蟲則發(fā)育成蜂王1 2 6 j 。 1 4 2 蜜蜂級型分化在分子和蛋白質(zhì)組方面的研究進(jìn)展 蜂群中，蜂王和工蜂都是由受精卵發(fā)育而來，具有完全相同的遺傳物質(zhì)， 但二者不僅在外表形態(tài)上差異巨大，而且具有截然不同的生殖能力，懸殊的生 命期限以及相差甚遠(yuǎn)的行為方式【9 】。為了解蜂王和工蜂在生殖、發(fā)育的分子機(jī)理 和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從上個世紀(jì)后期，就開始對級型間基因表達(dá)的差異進(jìn)行分析。 4 第一章引言 第一次大規(guī)模研究級型間分子層次的差異是1 9 8 9 年蜂王和工蜂在幼蟲和蛹 階段中m r n a 的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在4 日齡末兩級型蜂的m r n a 表達(dá)出現(xiàn)差異【1 9 】。之 后1 9 9 9 年，用扣除差異雜交法研究蜂王和工蜂幼蟲基因組時發(fā)現(xiàn)，在蜂王和工 蜂有7 個差異表達(dá)的基因位點(diǎn)，它們屬于至少5 個截然不同的進(jìn)化和功能組別，7 個差異表達(dá)的基因位點(diǎn)中有兩個位點(diǎn)是關(guān)于級型分化調(diào)控，一個是脂質(zhì)和疏水 性集團(tuán)( 包括視黃酸) 的綁定蛋白質(zhì)基因：一個位點(diǎn)序列與的轉(zhuǎn)錄因子e t s 家族 結(jié)合域序列相似，其余5 個位點(diǎn)與下游基因的改變有關(guān)暖7 1 。同年發(fā)現(xiàn)在蜂王和工 蜂級型發(fā)育過程中，編碼線粒體蛋白的基因和線粒體翻譯啟動子基因在蜂王幼 蟲中的表達(dá)水平都較在工蜂中的高，認(rèn)為蜂王幼蟲高生長率、高呼吸率是通過 線粒體蛋白基因的高豐度表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的【2 8 】。2 0 0 0 年，利用1 2 7 8 個基因芯片數(shù)據(jù) 分析3 類幼蟲的基因表達(dá)譜：尚未分級型的幼蟲，五日齡中期的蜂王和工蜂幼蟲。 發(fā)現(xiàn)工蜂基因表達(dá)較保守，而蜂王在下調(diào)了一系列幼蟲時表達(dá)的基因后又上調(diào) 了一些級型分化調(diào)控基因，蜂王上調(diào)的基因大部分涉及代謝，特別是代謝中的 酶；而工蜂上調(diào)有細(xì)胞色素c p 4 5 0 蛋白家族，六聚體營養(yǎng)儲存蛋白和二氫二醇脫 氫酶和脂肪酸綁定蛋白的基因【2 9 1 。研究轉(zhuǎn)錄前的上游調(diào)控元件時發(fā)現(xiàn)，蜂王和 工蜂差異表達(dá)的基因大多涉及代謝過程，工蜂過量表達(dá)水解酶基因，蜂王在氧 化還原酶的表達(dá)上是過量的，這說明蜂王和工蜂有不同的代謝通路【3 1 1 。在2 0 0 7 年利用e s t s 和基因芯片技術(shù)對蜂王和工蜂在分化過程中2 4 0 個表達(dá)不同的基 因，分析級型發(fā)育中的工蜂上調(diào)表達(dá)了較多發(fā)育基因，而蜂王上調(diào)表達(dá)了較多 代謝相關(guān)的基因，這些基因可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝來指導(dǎo)級型分化【3 2 1 。幼蟲 發(fā)育為蜂王或工蜂與他們所處的營養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，由于營養(yǎng)環(huán)境不同，使它們具 有不同的基因表達(dá)模式。2 0 0 8 年利用r n a 干擾技術(shù)使蜜蜂d n a 甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá) 沉默，發(fā)現(xiàn)在蜜蜂體內(nèi)，d n a 甲基化用于儲存蜜蜂后天遺傳信息，而后天遺傳 信息的利用會因蜂王和工蜂幼蟲所處的營養(yǎng)環(huán)境不同而有所差異【3 3 1 。 基因水平的差異最終也會體現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平，生命活動需要蛋白質(zhì)來完成 【2 6 d 7 1 。對不同級型蜜蜂血淋巴液內(nèi)蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，在蜂王血淋巴液中含有 大量與繁殖功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，而在工蜂血淋巴液中則沒有，因此推斷這些蛋 白質(zhì)有促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟的功能1 1 7 】。同時，類胰島素肽在2 日齡的蜂王幼蟲體 內(nèi)高水平表達(dá)，而在2 日齡的工蜂幼蟲體內(nèi)的表達(dá)量很少【3 4 l ，這也許是因?yàn)榉渫?和工蜂具有不同的的胰島素信號調(diào)節(jié)通路而造成的。 5 第一章引言 1 5 研究方法 本研究主要使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對級型分化不同時期的蜂王和工蜂蛋白 質(zhì)組進(jìn)行比較、鑒定、和分析。 首先，合理取樣，通過獎勵飼喂等手段，使蜂群強(qiáng)盛，結(jié)合文獻(xiàn)和蜜蜂生 物學(xué)知識科學(xué)取樣并對樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。 其次，利用雙向電泳的方法獲得蛋白質(zhì)圖譜。并利用生物學(xué)軟件對同一日 齡的蜂王和工蜂重復(fù)性較好的膠圖進(jìn)行比較分析，找出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。 之后，利用質(zhì)譜技術(shù)對級型間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能鑒定。 最后，利用生物信息學(xué)軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索、分析和歸納。 1 6 論文結(jié)構(gòu)安排 第一章：引言，主要介紹研究的目的意義和選題背景、文獻(xiàn)綜述、研究方 法等方面的內(nèi)容。 第二章：蜜蜂幼蟲期蜂王和工蜂蛋白質(zhì)組成及發(fā)育特點(diǎn)比較，與第三章： 蜜蜂幼蟲期蜂王和工蜂蛋白質(zhì)組成及發(fā)育特點(diǎn)比較，都是論文的主要的研究內(nèi) 容。它們在時間上是順承關(guān)系。在這兩章中都是首先介紹本章的研究背景，其 次，介紹具體的試驗(yàn)方法和所用的試劑及儀器。之后，介紹取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 最后，對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析解讀，闡明分析的結(jié)果和意義。 第四章：蜜蜂幼蟲期級型發(fā)育蛋白功能鑒定與生化通路分析。是對第二章 的深入研究，對第二章的數(shù)據(jù)結(jié)果做進(jìn)一步的鑒定實(shí)驗(yàn)，同時利用大量生物信 息學(xué)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。章內(nèi)結(jié)構(gòu)與第二章，第三章相似。 第五章：結(jié)論是對論文整體最終和總體的結(jié)論。其中5 1 現(xiàn)階段取得的成果 和意義是對論文研究成果，在本學(xué)術(shù)領(lǐng)域地位作用和意義的介紹。5 2 結(jié)論是對 論文結(jié)果的概括。 6 第二章蜜蜂幼蟲期蜂王和工蜂蛋白質(zhì)組成及發(fā)育特點(diǎn)比較 第二章蜜蜂幼蟲期蜂王和工蜂蛋白質(zhì)組成及發(fā)育特點(diǎn)比較 蜂王和工蜂都是由相同的受精卵發(fā)育而來，它們級型分化是從幼蟲期開始 的【1 1 。蜜蜂在幼蟲期發(fā)育速度很快，在孵化后的9 6 h 中，幼蟲大約每隔2 4 小時就 蛻一次皮【2 】。在所有社會性膜翅目昆蟲中，蜜蜂發(fā)育周期歷時最短，從受精卵到 羽化，西方蜜蜂的工蜂需要2 1 天，蜂王僅需1 6 天；其中工蜂經(jīng)歷了6 天幼蟲期， 而蜂王的幼蟲期只需要5 天【3 】。它們發(fā)育時間的差異是由于后天所處的營養(yǎng)環(huán)境 不同造成的f 4 5 1 ，出生在王臺的幼蟲不但被飼喂的次數(shù)是出生在工蜂巢的幼蟲的 數(shù)倍，而且被飼喂食物的含糖量也明顯高于出生在工蜂巢的幼蟲。 蜂王和工蜂的級型發(fā)育雖然是一個連續(xù)的過程，有些時期卻是有兩級型蜂 分化的“分水嶺”。通過互換培育試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小于4 齡末期的幼蟲培育在王臺中 可發(fā)育為蜂王，培育在工蜂巢脾中則發(fā)育為工蜂；而大于4 齡末期的工蜂幼蟲即 使被移入王臺中也只能發(fā)育成工蜂，說明只有小于4 齡末期的幼蟲才具有雙向發(fā) 育的能力【引，4 齡末期是一個級型分化的關(guān)鍵時期【眄】。因此本實(shí)驗(yàn)選取4 齡末期 前后( 3 日齡，5 日齡) 的蜂王和工蜂幼蟲為代表，研究兩級型蜂在幼蟲期的發(fā) 育特點(diǎn)。 在幼蟲期短短幾天的時間里，蜂王和工蜂的體重就出現(xiàn)明顯差異，其間有 大量蛋白質(zhì)參與表達(dá)和調(diào)控，是蜜蜂級型發(fā)育的重要階段。但前人對幼蟲期級 型分化的研究大多集中在營養(yǎng)、激素和基因組方面，而在蛋白質(zhì)組學(xué)方面卻很 少。因此，本實(shí)驗(yàn)利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究蜂王和工蜂在幼蟲期的發(fā)育 特點(diǎn)，這有利于推動蜜蜂生物學(xué)的發(fā)展，為研究影響級型分化的因素提供了參 考。 2 1 材料和方法 2 1 1 試劑 雙向凝膠電泳( 2 一d e ) 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、固相p h 梯度( i p g ) 膠條( p h 3 1 0 線性) 、b i o l y t e ( p h 3 1 0 ) 和礦物油均購于b i o - r a d 公司。 i r i s 堿、過硫酸銨( a p ) 、 十二烷基磺酸鈉( s d s ) 、甘氨酸和尿素，均購1 1 1 s i g m a 公司。丙烯酰胺、甲叉 雙丙烯酰胺、溴酚蘭、考馬斯亮蘭( c b b ) g 2 5 0 、硫脲、c h a p s 、牛血清白蛋 7 第二章蜜蜂幼蟲期蜂王和工蜂蛋白質(zhì)組成及發(fā)育特點(diǎn)比較 白( b s a ) 和瓊脂糖均購于a m r e s c o 公司。d t t 、碘乙酰胺，來l 芻m e r c k 公司。 其余化學(xué)試劑均產(chǎn)自北京化學(xué)試劑公司。 ( 1 ) 磷酸抽提緩沖液( p b s ) ( 3 2 5 m mk 2 h p 0 4 ，2 6 m mk h 2 p 0 4 ，4 0 0 m m n a c i ，p h7 6 ) k 2 h p 0 4 3 h 2 0 ( 2 2 8 2 2 ) k h 2 p 0 4 ( 1 3 6 0 9 ) n a c l ( 5 8 4 4 ) 超純水溶解，最終定容至 4 。c 冰箱保存待用。 ( 2 ) 蛋白樣品溶解緩沖液( 8 m t r i s b a s e ，3 0 m md t t ，0 5 b i o l y r e 尿素( 6 0 0 6 ) 硫脲( 7 6 1 2 ) c h a p s ( 6 14 9 ) t r i s ( 1 2 1 3 ) d t t ( 15 4 2 ) 超純水溶解，最終定容至 0 3 7 9 0 0 1 7 9 1 1 6 9 9 5 0 m l 尿素，2 m 硫尿，4 c h a p s ，2 0 m m ( p h3 5 1 0 ) ) 9 6 1 9 3 0 4 4 9 o 8 9 o 0 4 8 9 0 0 9 2 9 2 0 m 1 分裝為l m f 管，一2 0 。c 冰箱保存待用，臨用前每管力1 4 0 b i o l y t e1 2 5ul ，剩 余4 。c 冰箱保存待用。 ( 3 ) b r a d f o r d 工作液 9 0 乙醇， 8 5 磷酸溶液 c b b ( 考馬斯亮藍(lán)) g 2 5 0 超純水至 用前濾紙過濾，棕色瓶室溫可存放一個月。 ( 4 ) 1 0 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 b s a ( 牛血清白蛋白) 超純水至 分裝出l m f 管x9 管，2 0 冰箱存放待用。 ( 5 ) 1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 1