葉綠體基因工程.doc

葉綠體基因工程姓名：李茂華 學(xué)號(hào)：20142356 摘要：葉綠體是植物細(xì)胞和真核藻類執(zhí)行光合作用的重要細(xì)胞器，在葉綠體中表達(dá)外源基因比在細(xì)胞核中表達(dá)具有一些獨(dú)特優(yōu)勢。葉綠體基因工程步驟類似核基因工程，葉綠體基因工程在提高植物光合效率、改良植物特性及生產(chǎn)生物藥物等方面已得到應(yīng)用。盡管葉綠體基因工程還存在同質(zhì)化難度高、標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化效率較低、宿主種類偏少等問題，但作為外源基因在高等植物中表達(dá)的良好平臺(tái)其仍然具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。 關(guān)鍵詞：葉綠體 基因工程 應(yīng)用 存在問題 葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細(xì)胞器，其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882 年Straburger 觀察到藻類葉綠體能分裂并進(jìn)入子代細(xì)胞；1909年Baur 和Correns 通過在3 種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出，質(zhì)體是母本遺傳的。人們便開始對(duì)葉綠體遺傳方面產(chǎn)生了濃厚的興趣【1】。1988 年Boynton 等首次用野生型葉綠體DNA 轉(zhuǎn)化了單細(xì)胞生物衣藻突變體（atPB 基因突變體），使其完全恢復(fù)光合作用能力，標(biāo)志著葉綠體基因工程的誕生【2】。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在植物光合作用、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來越重要的意義。1 葉綠體基因工程概述1.1葉綠體簡介 葉綠體是綠色植物光合作用的場所, 來源于古代的衣藻類原核生物, 含有雙鏈環(huán)狀DNA ( Manning , 1971 )葉綠體DNA 有IRA 和IRB 兩個(gè)反向重復(fù)序列( 分別位于A 鏈和B鏈) , 兩者基因大小完全相同, 只是方向相反, 它們之間有一個(gè)大的單拷貝區(qū)(large single copy region , LSC ) , 大小約80kb, 和一個(gè)小的單拷貝區(qū)( small single copy region , SSC )大小約20kb。多數(shù)葉綠體D N A大小在120一160kb, 最大2000 kb ( 傘藻) , 最小85 kb ( 刺海松)。葉綠體基因組中的基因在漫長的進(jìn)化歷程中, 有許多轉(zhuǎn)移到了核中, 遺留在葉綠體中的基因是功能必需的一些基因, 有巨大的拷貝數(shù)( 一個(gè)葉綠體中, 基因拷貝數(shù)可達(dá)上百個(gè); 一個(gè)細(xì)胞中, 基因的拷貝數(shù)可達(dá)上萬個(gè)) , 而且它們都是原核生物來源的, 具有原核生物基因的特點(diǎn)葉綠體基因多為多順反子轉(zhuǎn)錄單位, 這些轉(zhuǎn)錄單位中基因的排列順序是高度保守的【3】。1.2葉綠體基因工程優(yōu)勢1.2.1 高效表達(dá)外源蛋白 外源基因在葉綠體基因組中穩(wěn)定整合之后，能夠使外源蛋白大量積累，這是因?yàn)樵诿恳粋€(gè)植物細(xì)胞中質(zhì)體遺傳系統(tǒng)的多倍體特性可以使葉綠體基因組的基因拷貝數(shù)目多1000-10 000，保證了功能基因拷貝數(shù)維持在較高數(shù)量。此外，葉綠體轉(zhuǎn)化體系消除了核轉(zhuǎn)化體系中頻繁出現(xiàn)的位置效應(yīng)，因葉綠體轉(zhuǎn)化載體兩側(cè)的同源序列保證了外源基因在和葉綠體基因組進(jìn)行同源重組時(shí)的位點(diǎn)特異性，這就為外源基因的高效表達(dá)提供了有利條件。葉綠體轉(zhuǎn)基因植物還具有其他一些優(yōu)點(diǎn)，如不會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。這使得轉(zhuǎn)錄本的積累比核轉(zhuǎn)化植物可以高169 倍，并且外源蛋白的表達(dá)量在成熟葉片中可占可溶性蛋白的45.3%，在老葉片中占可溶性蛋白的46.1%【4】。1.2.2 安全性好 在大多數(shù)被子植物中，葉綠體基因都是母系遺傳的，所以這些葉綠體中的轉(zhuǎn)基因不會(huì)通過花粉進(jìn)行傳播，使葉綠體轉(zhuǎn)化成為創(chuàng)造和培養(yǎng)基因修飾的轉(zhuǎn)基因植物的一個(gè)有價(jià)值的工具，并且產(chǎn)生更低的環(huán)境危害。因此，利用這種生物防范策略也可以使傳統(tǒng)的和修飾的轉(zhuǎn)基因作物共存，雄性不育遺傳工程技術(shù)正是這種轉(zhuǎn)基因防范策略的進(jìn)一步體現(xiàn)【5】。此外，植物來源的醫(yī)療蛋白不受人類病原體和哺乳動(dòng)物病毒載體的危害。因此，葉綠體系統(tǒng)為傳統(tǒng)的生產(chǎn)系統(tǒng)，如微生物發(fā)酵或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等提供了一個(gè)可行的替代選擇。1.2.3 后代不易分離 母系遺傳是葉綠體的遺傳特性，因此在得到純合并且穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化植株后，這樣純系的后代不會(huì)因有性雜交而分離，從而一直保持純系【6】。除上述優(yōu)點(diǎn)，葉綠體遺傳工程還具有轉(zhuǎn)基因累加的獨(dú)特優(yōu)勢。例如，可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因以實(shí)現(xiàn)通過一次轉(zhuǎn)化就能生產(chǎn)多價(jià)疫苗。一些異源操縱子已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因葉綠體中表達(dá)，多順反子也沒有先被加工成單順反子就被成功翻譯。此外，在葉綠體中合成的外源蛋白經(jīng)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄后修飾被正確折疊，包括生成二硫鍵、脂質(zhì)修飾等【7】。2 葉綠體轉(zhuǎn)化步驟2.1將外源DNA導(dǎo)入葉綠體外源DNA 穿過葉綠體的雙層膜比穿過核膜要困難得多, 葉綠體轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵問題是DNA 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后如何穿過葉綠體雙層膜。目前最常用和最有效的方法是基因槍法, 轉(zhuǎn)化效率高且重復(fù)性好【8】。此外還有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、聚乙二養(yǎng)醇(PEC) 介導(dǎo)法、顯微注射法等。2.2 外源D N A 整合進(jìn)入葉綠體基因組用于葉綠體基因轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體具有葉綠體基因組的同源片段、啟動(dòng)子及適于葉綠體表達(dá)的篩選標(biāo)記, 轉(zhuǎn)化載體被載人葉綠體后通過與葉綠體基因組的同源片段之間發(fā)生核兩次同源重組, 將外源基因整合到基因組定位點(diǎn)。2.3篩選葉綠體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 高等植物中, 每個(gè)葉綠體內(nèi)又有數(shù)百個(gè)基因組拷貝,因此轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的葉綠體極易同時(shí)存在于轉(zhuǎn)基因植株中, 這種雜合體遺傳不穩(wěn)定。解決該問題的方法之一是在得到外源基因的轉(zhuǎn)化子后, 在增加選擇壓力的培養(yǎng)基上反復(fù)篩選, 逐步淘汰野生型拷貝, 最終使轉(zhuǎn)基因植株中已整合外源基因的葉綠體基因組取代原基因組所有拷貝, 即同質(zhì)化【9】。2.4再生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株 目前常用的植物組織再生方式有愈傷組織再生和原生質(zhì)體再生。轉(zhuǎn)化外植體經(jīng)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織后, 再通過分化培養(yǎng)誘導(dǎo)生根、發(fā)芽獲得再生植株, 將再生植株移栽土壤就可長成可育的成年植株。再生系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性與再生方式、培養(yǎng)條件、外植體的選擇等有關(guān)【10】。3葉綠體基因工程的應(yīng)用3.1提高植物光合效率 植物的光合效率非常有限，太陽能的很小一部分可以轉(zhuǎn)化為植物所需要的能量，從而轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愋枰漠a(chǎn)品。植物光合效率取決于Rubisco 酶的豐富度。Rubisco 酶一方面可以制造可溶性蛋白，另一方面也可以限制CO2合成。人們可以通過2 種直接的方法提高光合速率：一是加速酶催化的循環(huán)過程；二是提高酶的特性，減少光呼吸浪費(fèi)的能量【11】。很多科學(xué)家正試圖通過提高Rubisco 酶來提高植物的光合效率，而其中擬南芥和水稻的定點(diǎn)整合試驗(yàn)取得了重大突破，證明葉綠體基因工程是生產(chǎn)高光合效率作物植物的最有價(jià)值的方法。3.2合成有機(jī)物質(zhì) 由于葉綠體型轉(zhuǎn)基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產(chǎn)物區(qū)域化等優(yōu)點(diǎn)，已被越來越多的人關(guān)注，并成為工業(yè)化生產(chǎn)特定有機(jī)物質(zhì)的可靠場所。例如，有科學(xué)家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達(dá)聚3-羥基丁酸酯合成相關(guān)基因的方法。其通過構(gòu)建了含phbB、phM、phbC 和aadA 基因表達(dá)盒的葉綠體整合及表達(dá)載體，通過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化煙草。Northem 點(diǎn)雜交、RT-PCR分析結(jié)果表明，葉綠體型轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)明顯高于核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因【12】。3.3生產(chǎn)疫苗 人類治療用蛋白質(zhì)可以在葉綠體中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，表達(dá)效率取決于外源基因的整合位點(diǎn)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經(jīng)在用葉綠體基因生產(chǎn)疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如，范國昌等將甲型肝炎病毒VP3P1 區(qū)和丙型肝炎病毒C 區(qū)融合，并導(dǎo)入到衣藻葉綠體基因組中，融合蛋白得到高效表達(dá)，且具有雙抗原活性【13】。3.4在植物抗性方面的研究 在抗蟲性方面，Kota 和Cosa 分別于1999 年、2001 年將BTCryZAaZ 基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，前者可100%殺死4000多倍抗性的抗性蟲，后者報(bào)道BT 表達(dá)量達(dá)46.1%?！?4】在抗逆性方面，人們通過編碼SOD、APx 等酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中，提高了植物的耐氧化能力，從而提高了植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力【15】。4存在問題4.1葉綠體的同質(zhì)化問題 植物葉綠體轉(zhuǎn)化不同于細(xì)胞核轉(zhuǎn)化的重要一點(diǎn)是同質(zhì)化問題。高等植物的每個(gè)細(xì)胞中含有許多葉綠體，單獨(dú)的每個(gè)葉綠體又含有許多葉綠體基因組拷貝，所以轉(zhuǎn)化后所得到的葉綠體植株中未被轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體和被轉(zhuǎn)化的葉綠體同時(shí)存在，一般情況下是異質(zhì)的，這在遺傳學(xué)上較不穩(wěn)定。因此，在將外源基因?qū)胫氨仨毷罐D(zhuǎn)基因植株易于同質(zhì)化，然而改造葉綠體的基因組相當(dāng)困難，它的基因組結(jié)構(gòu)使人們難以進(jìn)行深入的加工和修飾【16】。4.2選擇標(biāo)記基因 應(yīng)用不同的選擇標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化效率不同。如aadA 基因轉(zhuǎn)化能大大提高葉綠體轉(zhuǎn)化子的回收率?？梢姡行У倪x擇標(biāo)記基因是提高葉綠體轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。并且，為非綠色質(zhì)體選擇合適的標(biāo)記基因是在重要作物中構(gòu)建質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的一個(gè)可行的途徑。這個(gè)領(lǐng)域的快速發(fā)展需要對(duì)葉綠體基因工程進(jìn)一步的研究應(yīng)用【17】。4.3植物種類有待擴(kuò)展 葉綠體基因工程只在少數(shù)的幾種植物中獲得成功【18】，主要原因是大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列還沒有完全測出，無法確定同源重組和插入位點(diǎn)。截至目前，葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)在多種高等植物中得到成功嘗試，而穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)僅僅在煙草中得以構(gòu)建，番茄、油菜、大豆、胡蘿卜及萵苣等葉綠體轉(zhuǎn)化體系相繼建立但仍處于開發(fā)階段【19】。5結(jié)語 迄今為止，在煙草葉綠體基因組中穩(wěn)定整合并表達(dá)的轉(zhuǎn)基因已超過40 余種【20】，而且產(chǎn)生了有價(jià)值的工業(yè)生物材料和治療蛋白。重組蛋白在葉綠體工程系統(tǒng)中的高效表達(dá)表明植物作為生物反應(yīng)器的潛在巨大效益，并且這種環(huán)保的植物生物反應(yīng)器途徑已逐漸被應(yīng)用于治療蛋白、疫苗和生物材料的生產(chǎn)。葉綠體基因工程作為分子水平上的一種技術(shù)手段，為轉(zhuǎn)基因植物的研究開辟了一個(gè)新的方向，為外源基因在高等植物中表達(dá)提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。然而這只是第一步，這個(gè)技術(shù)尚不能使產(chǎn)品商業(yè)化，目的基因表達(dá)水平的調(diào)控還有待解決，并且葉綠體轉(zhuǎn)基因植物需要得到更多層面的評(píng)估。隨著對(duì)葉綠體基因工程的進(jìn)一步探索與完善，葉綠體作為一種新型高效的生物反系統(tǒng)必將為生物工程領(lǐng)域帶來新的希望。參考文獻(xiàn)【1】劉良式.植物分子遺傳學(xué)M.北京：科學(xué)出版社，1997.【2】BOYNTON J E，GILLHAM N W，HARRIS E H，et al.Chloroplast transformation in Chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles J.Science，1988，240（4858）：1534-1538.【3】西費(fèi)利.葉綠體分子遺傳學(xué)M.湖南：湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1987【4】桂騰琴，孫敏.葉綠體基因工程的研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(8):3429-3431【5】Ruiz ON, Daniell H. 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