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葉綠體基因工程姓名：李茂華 學號：20142356 摘要：葉綠體是植物細胞和真核藻類執(zhí)行光合作用的重要細胞器，在葉綠體中表達外源基因比在細胞核中表達具有一些獨特優(yōu)勢。葉綠體基因工程步驟類似核基因工程，葉綠體基因工程在提高植物光合效率、改良植物特性及生產生物藥物等方面已得到應用。盡管葉綠體基因工程還存在同質化難度高、標記基因轉化效率較低、宿主種類偏少等問題，但作為外源基因在高等植物中表達的良好平臺其仍然具有廣闊的發(fā)展和應用前景。 關鍵詞：葉綠體 基因工程 應用 存在問題 葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細胞器，其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882 年Straburger 觀察到藻類葉綠體能分裂并進入子代細胞；1909年Baur 和Correns 通過在3 種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出，質體是母本遺傳的。人們便開始對葉綠體遺傳方面產生了濃厚的興趣【1】。1988 年Boynton 等首次用野生型葉綠體DNA 轉化了單細胞生物衣藻突變體（atPB 基因突變體），使其完全恢復光合作用能力，標志著葉綠體基因工程的誕生【2】。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉基因技術，在植物光合作用、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來越重要的意義。1 葉綠體基因工程概述1.1葉綠體簡介 葉綠體是綠色植物光合作用的場所, 來源于古代的衣藻類原核生物, 含有雙鏈環(huán)狀DNA ( Manning , 1971 )葉綠體DNA 有IRA 和IRB 兩個反向重復序列( 分別位于A 鏈和B鏈) , 兩者基因大小完全相同, 只是方向相反, 它們之間有一個大的單拷貝區(qū)(large single copy region , LSC ) , 大小約80kb, 和一個小的單拷貝區(qū)( small single copy region , SSC )大小約20kb。多數葉綠體D N A大小在120一160kb, 最大2000 kb ( 傘藻) , 最小85 kb ( 刺海松)。葉綠體基因組中的基因在漫長的進化歷程中, 有許多轉移到了核中, 遺留在葉綠體中的基因是功能必需的一些基因, 有巨大的拷貝數( 一個葉綠體中, 基因拷貝數可達上百個; 一個細胞中, 基因的拷貝數可達上萬個) , 而且它們都是原核生物來源的, 具有原核生物基因的特點葉綠體基因多為多順反子轉錄單位, 這些轉錄單位中基因的排列順序是高度保守的【3】。1.2葉綠體基因工程優(yōu)勢1.2.1 高效表達外源蛋白 外源基因在葉綠體基因組中穩(wěn)定整合之后，能夠使外源蛋白大量積累，這是因為在每一個植物細胞中質體遺傳系統(tǒng)的多倍體特性可以使葉綠體基因組的基因拷貝數目多1000-10 000，保證了功能基因拷貝數維持在較高數量。此外，葉綠體轉化體系消除了核轉化體系中頻繁出現(xiàn)的位置效應，因葉綠體轉化載體兩側的同源序列保證了外源基因在和葉綠體基因組進行同源重組時的位點特異性，這就為外源基因的高效表達提供了有利條件。葉綠體轉基因植物還具有其他一些優(yōu)點，如不會出現(xiàn)轉基因沉默現(xiàn)象。這使得轉錄本的積累比核轉化植物可以高169 倍，并且外源蛋白的表達量在成熟葉片中可占可溶性蛋白的45.3%，在老葉片中占可溶性蛋白的46.1%【4】。1.2.2 安全性好 在大多數被子植物中，葉綠體基因都是母系遺傳的，所以這些葉綠體中的轉基因不會通過花粉進行傳播，使葉綠體轉化成為創(chuàng)造和培養(yǎng)基因修飾的轉基因植物的一個有價值的工具，并且產生更低的環(huán)境危害。因此，利用這種生物防范策略也可以使傳統(tǒng)的和修飾的轉基因作物共存，雄性不育遺傳工程技術正是這種轉基因防范策略的進一步體現(xiàn)【5】。此外，植物來源的醫(yī)療蛋白不受人類病原體和哺乳動物病毒載體的危害。因此，葉綠體系統(tǒng)為傳統(tǒng)的生產系統(tǒng)，如微生物發(fā)酵或哺乳動物細胞培養(yǎng)等提供了一個可行的替代選擇。1.2.3 后代不易分離 母系遺傳是葉綠體的遺傳特性，因此在得到純合并且穩(wěn)定的葉綠體轉化植株后，這樣純系的后代不會因有性雜交而分離，從而一直保持純系【6】。除上述優(yōu)點，葉綠體遺傳工程還具有轉基因累加的獨特優(yōu)勢。例如，可以同時表達多個基因以實現(xiàn)通過一次轉化就能生產多價疫苗。一些異源操縱子已經在轉基因葉綠體中表達，多順反子也沒有先被加工成單順反子就被成功翻譯。此外，在葉綠體中合成的外源蛋白經適當的轉錄后修飾被正確折疊，包括生成二硫鍵、脂質修飾等【7】。2 葉綠體轉化步驟2.1將外源DNA導入葉綠體外源DNA 穿過葉綠體的雙層膜比穿過核膜要困難得多, 葉綠體轉化的一個關鍵問題是DNA 進入細胞質后如何穿過葉綠體雙層膜。目前最常用和最有效的方法是基因槍法, 轉化效率高且重復性好【8】。此外還有農桿菌介導法、聚乙二養(yǎng)醇(PEC) 介導法、顯微注射法等。2.2 外源D N A 整合進入葉綠體基因組用于葉綠體基因轉化的質粒載體具有葉綠體基因組的同源片段、啟動子及適于葉綠體表達的篩選標記, 轉化載體被載人葉綠體后通過與葉綠體基因組的同源片段之間發(fā)生核兩次同源重組, 將外源基因整合到基因組定位點。2.3篩選葉綠體轉化的細胞 高等植物中, 每個葉綠體內又有數百個基因組拷貝,因此轉化和未轉化的葉綠體極易同時存在于轉基因植株中, 這種雜合體遺傳不穩(wěn)定。解決該問題的方法之一是在得到外源基因的轉化子后, 在增加選擇壓力的培養(yǎng)基上反復篩選, 逐步淘汰野生型拷貝, 最終使轉基因植株中已整合外源基因的葉綠體基因組取代原基因組所有拷貝, 即同質化【9】。2.4再生穩(wěn)定的轉基因植株 目前常用的植物組織再生方式有愈傷組織再生和原生質體再生。轉化外植體經脫分化培養(yǎng)誘導形成愈傷組織后, 再通過分化培養(yǎng)誘導生根、發(fā)芽獲得再生植株, 將再生植株移栽土壤就可長成可育的成年植株。再生系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性與再生方式、培養(yǎng)條件、外植體的選擇等有關【10】。3葉綠體基因工程的應用3.1提高植物光合效率 植物的光合效率非常有限，太陽能的很小一部分可以轉化為植物所需要的能量，從而轉變?yōu)槿祟愋枰漠a品。植物光合效率取決于Rubisco 酶的豐富度。Rubisco 酶一方面可以制造可溶性蛋白，另一方面也可以限制CO2合成。人們可以通過2 種直接的方法提高光合速率：一是加速酶催化的循環(huán)過程；二是提高酶的特性，減少光呼吸浪費的能量【11】。很多科學家正試圖通過提高Rubisco 酶來提高植物的光合效率，而其中擬南芥和水稻的定點整合試驗取得了重大突破，證明葉綠體基因工程是生產高光合效率作物植物的最有價值的方法。3.2合成有機物質 由于葉綠體型轉基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產物區(qū)域化等優(yōu)點，已被越來越多的人關注，并成為工業(yè)化生產特定有機物質的可靠場所。例如，有科學家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達聚3-羥基丁酸酯合成相關基因的方法。其通過構建了含phbB、phM、phbC 和aadA 基因表達盒的葉綠體整合及表達載體，通過基因槍轟擊法轉化煙草。Northem 點雜交、RT-PCR分析結果表明，葉綠體型轉基因植株中目的基因在轉錄水平的表達明顯高于核轉化植株中相應基因【12】。3.3生產疫苗 人類治療用蛋白質可以在葉綠體中實現(xiàn)表達，表達效率取決于外源基因的整合位點，增強轉錄和翻譯的調控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經在用葉綠體基因生產疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如，范國昌等將甲型肝炎病毒VP3P1 區(qū)和丙型肝炎病毒C 區(qū)融合，并導入到衣藻葉綠體基因組中，融合蛋白得到高效表達，且具有雙抗原活性【13】。3.4在植物抗性方面的研究 在抗蟲性方面，Kota 和Cosa 分別于1999 年、2001 年將BTCryZAaZ 基因轉入煙草葉綠體，前者可100%殺死4000多倍抗性的抗性蟲，后者報道BT 表達量達46.1%?！?4】在抗逆性方面，人們通過編碼SOD、APx 等酶的基因已經轉入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中，提高了植物的耐氧化能力，從而提高了植物對環(huán)境脅迫的耐受能力【15】。4存在問題4.1葉綠體的同質化問題 植物葉綠體轉化不同于細胞核轉化的重要一點是同質化問題。高等植物的每個細胞中含有許多葉綠體，單獨的每個葉綠體又含有許多葉綠體基因組拷貝，所以轉化后所得到的葉綠體植株中未被轉化的野生型葉綠體和被轉化的葉綠體同時存在，一般情況下是異質的，這在遺傳學上較不穩(wěn)定。因此，在將外源基因導入之前必須使轉基因植株易于同質化，然而改造葉綠體的基因組相當困難，它的基因組結構使人們難以進行深入的加工和修飾【16】。4.2選擇標記基因 應用不同的選擇標記基因，轉化效率不同。如aadA 基因轉化能大大提高葉綠體轉化子的回收率?？梢?，有效的選擇標記基因是提高葉綠體轉化效率的關鍵因素。并且，為非綠色質體選擇合適的標記基因是在重要作物中構建質體轉化系統(tǒng)的一個可行的途徑。這個領域的快速發(fā)展需要對葉綠體基因工程進一步的研究應用【17】。4.3植物種類有待擴展 葉綠體基因工程只在少數的幾種植物中獲得成功【18】，主要原因是大多數植物的葉綠體基因組序列還沒有完全測出，無法確定同源重組和插入位點。截至目前，葉綠體轉化技術已經在多種高等植物中得到成功嘗試，而穩(wěn)定的轉化系統(tǒng)僅僅在煙草中得以構建，番茄、油菜、大豆、胡蘿卜及萵苣等葉綠體轉化體系相繼建立但仍處于開發(fā)階段【19】。5結語 迄今為止，在煙草葉綠體基因組中穩(wěn)定整合并表達的轉基因已超過40 余種【20】，而且產生了有價值的工業(yè)生物材料和治療蛋白。重組蛋白在葉綠體工程系統(tǒng)中的高效表達表明植物作為生物反應器的潛在巨大效益，并且這種環(huán)保的植物生物反應器途徑已逐漸被應用于治療蛋白、疫苗和生物材料的生產。葉綠體基因工程作為分子水平上的一種技術手段，為轉基因植物的研究開辟了一個新的方向，為外源基因在高等植物中表達提供了一個良好的平臺。然而這只是第一步，這個技術尚不能使產品商業(yè)化，目的基因表達水平的調控還有待解決，并且葉綠體轉基因植物需要得到更多層面的評估。隨著對葉綠體基因工程的進一步探索與完善，葉綠體作為一種新型高效的生物反系統(tǒng)必將為生物工程領域帶來新的希望。參考文獻【1】劉良式.植物分子遺傳學M.北京：科學出版社，1997.【2】BOYNTON J E，GILLHAM N W，HARRIS E H，et al.Chloroplast transformation in Chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles J.Science，1988，240（4858）：1534-1538.【3】西費利.葉綠體分子遺傳學M.湖南：湖南科學技術出版社,1987【4】桂騰琴，孫敏.葉綠體基因工程的研究進展.安徽農業(yè)科學,2009,37(8):3429-3431【5】Ruiz ON, Daniell H. 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