DNA的復制和修復教程.ppt

第十二章DNA的復制和修復,本章重點介紹中心法則和DNA的半保留復制以及逆轉錄的過程和機理，對DNA的損傷和修復、突變和重組作一般介紹。,知識點回顧,什么是DNA？DNA是生物遺傳的主要物質基礎，是遺傳信息的載體。生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。,DNA的結構特征？雙螺旋結構含兩條多核苷酸的雙螺旋分子。Watson-Crick模型,什么是DNA變性、復性和雜交？DNA變性指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結構松解為無規(guī)則線性結構的現(xiàn)象。DNA復性變性DNA在適當條件下,兩條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現(xiàn)象，又稱“退火”。雜交DNA復性過程中不同來源的DNA單鏈形成雙螺旋結構的過程。,那么，DNA是如何參與遺傳信息傳遞的？,中心法則,1958年Crick稱之為中心法則。,DNA的生物合成：細胞內合成DNA的過程1、復制：以DNA作為模板指導的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。2、反轉錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導合成作用，見于RNA病毒。3、修復合成：當各種因素引起DNA損傷時，損傷DNA可修復合成，校正錯誤，完成正確合成，以保持DNA結構的穩(wěn)定性和遺傳信息的準確性。,第一節(jié)DNA復制一、復制的特征（一）半保留復制兩個子代分子中各有一條鏈來自親代，各有另一條新合成的鏈，這種復制方式叫半保留復制。實驗證據(jù)：1957年M.Meselson和F.W.Stahl用大腸桿菌為材料，在含15N和14N的NH4Cl中培養(yǎng)證實了半保留復制方式。Cscl梯度離心的結果。,（二）復制的起始點與方向親代DNA開鏈，復制起始點呈叉型移動1、復制起點：DNA復制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復制起點。,單復制子,多復制子,（三）半不連續(xù)合成,在DNA復制過程中，一條鏈是連續(xù)合成的，而另一條鏈是不連續(xù)合成。體內僅含催化53合成的DNA聚合酶。60年代，岡琦片段的發(fā)現(xiàn)：合成53前導鏈（leadingstrand）是連續(xù)的，方向與復制叉一致。合成35隨從鏈時，方向與叉相反，合成不連續(xù)，各片段連成一條鏈。,在DNA復制時，1條鏈的合成方向和復制叉的前進方向相同，可以連續(xù)復制，叫作前導鏈；而另一條鏈的合成方向和復制叉的前進方向正好相反，不能連續(xù)復制，只能分成幾個片段(岡崎片段)合成，稱之為滯后鏈。,（四）DNA聚合反應有關的酶,TopoI和TopoII,解鏈酶和SSB的作用,2引物酶合成RNA引物,3DNA聚合酶延長子鏈,E.Coli的DNA聚合酶,真核生物的DNA聚合酶,DNA聚合酶水解引物并填補空隙,4DNA連接酶連接岡崎片段,第二節(jié)DNA生物合成過程,DNA復制的起始階段，由下列兩步構成。1解旋解鏈，形成復制叉：由拓撲異構酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結構解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結合蛋白（SSB）四聚體結合在兩條單鏈DNA上，形成復制叉。,一、復制的起始,2引發(fā)體組裝和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復制起始區(qū)域形成引發(fā)體；在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3端自由羥基（3-OH）。,二、復制的延長,復制的延長指在DNA聚合酶催化下，以35方向的親代DNA鏈為模板，從53方向聚合子代DNA鏈。其化學本質是dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，磷酸二酯鍵不斷生成。在原核生物中，參與DNA復制延長的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH3,3,DNA復制的延長過程,領頭鏈的合成過程,隨從鏈的合成過程,DNA聚合酶催化領頭鏈和隨從鏈同時合成,DNA復制過程簡圖,三、復制的終止,在復制過程中形成的RNA引物，需由RNA酶來水解去除；RNA引物水解后遺留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延長缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。,（一）去除引物，填補缺口：,在DNA連接酶的催化下，生成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。,（二）連接岡崎片段：,隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接,DNA復制的過程,端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構部分，通常膨大成粒狀。,（三）真核生物端粒的形成：,線性DNA在復制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進行延長反應。,端粒酶(telomerase),端粒酶是一種RNA-蛋白質復合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉錄過程對末端DNA鏈進行延長。,端粒酶的分子結構,端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT),端粒酶的組成,端粒酶(telomerase)的作用機制爬行模型,端粒酶的爬行模型（動畫演示）,人的生殖細胞和癌細胞中，可以檢測到端粒酶活性；而在多數(shù)的體細胞中，未檢測到端粒酶活性(Kimetal,1994Science)。在人的永生化細胞中抑制端粒酶的活性，將導致端?？s短并最終導致細胞死亡(Herbertetal1999PNAS)在多數(shù)人的體細胞中，端粒隨著細胞傳代而漸漸縮短。將端粒酶導入到人的正常細胞中，細胞在體外至少可以多傳20代(Bodnaretal,1998Science)Werner綜合癥早老綜合癥是位于8號染色體短臂的一種DNA解旋酶基因突變,端粒在對于保持染色體穩(wěn)定性和細胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒（縮短的端粒其細胞復制能力受限），從而增強體外細胞的增殖能力。端粒酶在正常人體組織中的活性被抑制，在腫瘤中被重新激活，端粒酶可能參與惡性轉化。端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細胞長期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。,第三節(jié)逆轉錄和其他復制方式,Section4ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays,一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶,逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象：,二、逆轉錄研究的意義,逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。逆轉錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。,三、滾環(huán)復制和D環(huán)復制,滾環(huán)復制(rollingcirclereplication)：是某些低等生物的復制形式，如X174和M13噬菌體等。,滾環(huán)復制的過程,D環(huán)復制(D-loopreplication)：是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復制形式。,第四節(jié)DNA的損傷（突變）與修復,由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結構的任何異常的改變稱為DNA的損傷，也稱為突變（mutation）。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。,一、突變的意義,（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎,（一）自發(fā)因素：1.自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達近萬個核苷酸殘基。2.自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達幾十到幾百個核苷酸殘基。3.復制錯配：由于復制時堿基配對錯誤引起的損傷，發(fā)生頻率較低。,二、引起突變的因素,胞嘧啶（C）,尿嘧啶（U）,由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價鍵連接的環(huán)丁烷結構，因而會引起復制障礙。,（二）物理因素：,嘧啶二聚體的形成,1.脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成H。,（三）化學因素：,2.烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。3.DNA加合劑：如苯并芘，在體內代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價結合引起損傷。4.堿基類似物：如5-FU，6-MP等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。5.斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。,三、突變的分子改變類型,DNA分子上單一堿基的改變稱點突變(pointmutation)。,鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)亞基,正常成人Hb(HbA)亞基,血紅蛋白-亞基的點突變,3.缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。,4.插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。,移碼突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。,缺失或插入都可導致移碼突變。,缺失引起的框移突變,5.重排DNA分子內較大片段的交換，稱為重組或重排。,由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型,四、DNA損傷的修復,DNA損傷修復(repair)：是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其盡可能回復為原有的天然狀態(tài)。,光修復(lightrepair)切除修復(excisionrepair)重組修復(recombinationrepair)SOS修復,修復的主要類型：,這是一種廣泛存在的修復作用，能夠修復任何嘧啶二聚體的損傷。修復過程由光修復酶(photolyase)催化完成。,（一）光修復（lightrepair）：,光修復酶的分子結構,其修復過程為：光修復酶(photolyase)識別嘧啶二聚體并與之結合形成復合物。在300600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開。光修復酶從DNA上解離。,1、形成嘧啶二聚體,2、光復合酶結合于損傷部位,3、酶被可見光激活,4、修復后酶被釋放,DNA紫外線損傷的光裂合酶修復,這也是一種廣泛存在的修復機制，可適用于多種DNA損傷的修復。切除修復機制的基本過程是將受損的DNA片段切除，然后再以對側鏈為模板，重新合成新鏈進行修復。,（二）切除修復(excisionrepair)：,在原核生物中，與DNA切除修復有關的蛋白質包括UvrA、UvrB、UvrC，以及DNApol和DNA連接酶。UvrA和UvrB主要起辨認和結合受損部位的作用；而UvrC則主要與受損片段的切除有關。,DNA的損傷和切除修復,堿基丟失,堿基缺陷或錯配,結構缺陷,切開,核酸內切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA連接酶,AP核酸內切酶,核酸外切酶,切開,切除,修復,連接,糖苷酶,插入酶,堿基取代,這是DNA的復制過程中所采用的一種有差錯的修復方式。修復時，利用重組蛋白RecA的核酸酶活性，將另一股健康親鏈與損傷缺口相互交換。,（三）重組修復(recombinationrepair),RecA的分子結構,DNA的重組修復,胸腺嘧啶二聚體,復制,核酸酶及重組蛋白,修復復制,DNA聚合酶,DNA連接酶,重組,RecA重組蛋白修復DNA示意圖,當DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復制時，由此而誘發(fā)出一系列復雜的反應。在E.coli中，各種與修復有關的基因，組成一個稱為調節(jié)子(regulon)的網絡式調控系統(tǒng)。這種修復特異性低，對堿基的識別、選擇能力差。通過SOS修復，復制如能繼續(xù)，細胞是可存活的。然而DNA保留的錯誤