DNA的復(fù)制和修復(fù)教程.ppt

第十二章DNA的復(fù)制和修復(fù),本章重點(diǎn)介紹中心法則和DNA的半保留復(fù)制以及逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程和機(jī)理，對(duì)DNA的損傷和修復(fù)、突變和重組作一般介紹。,知識(shí)點(diǎn)回顧,什么是DNA？DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，是遺傳信息的載體。生物機(jī)體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。,DNA的結(jié)構(gòu)特征？雙螺旋結(jié)構(gòu)含兩條多核苷酸的雙螺旋分子。Watson-Crick模型,什么是DNA變性、復(fù)性和雜交？DNA變性指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。DNA復(fù)性變性DNA在適當(dāng)條件下,兩條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，又稱(chēng)“退火”。雜交DNA復(fù)性過(guò)程中不同來(lái)源的DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。,那么，DNA是如何參與遺傳信息傳遞的？,中心法則,1958年Crick稱(chēng)之為中心法則。,DNA的生物合成：細(xì)胞內(nèi)合成DNA的過(guò)程1、復(fù)制：以DNA作為模板指導(dǎo)的DNA合成，即將DNA攜帶的信息傳至子代DNA。2、反轉(zhuǎn)錄：DNA合成也可以RNA為模扳指導(dǎo)合成作用，見(jiàn)于RNA病毒。3、修復(fù)合成：當(dāng)各種因素引起DNA損傷時(shí)，損傷DNA可修復(fù)合成，校正錯(cuò)誤，完成正確合成，以保持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和遺傳信息的準(zhǔn)確性。,第一節(jié)DNA復(fù)制一、復(fù)制的特征（一）半保留復(fù)制兩個(gè)子代分子中各有一條鏈來(lái)自親代，各有另一條新合成的鏈，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制。實(shí)驗(yàn)證據(jù)：1957年M.Meselson和F.W.Stahl用大腸桿菌為材料，在含15N和14N的NH4Cl中培養(yǎng)證實(shí)了半保留復(fù)制方式。Cscl梯度離心的結(jié)果。,（二）復(fù)制的起始點(diǎn)與方向親代DNA開(kāi)鏈，復(fù)制起始點(diǎn)呈叉型移動(dòng)1、復(fù)制起點(diǎn)：DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開(kāi)始，此部位稱(chēng)復(fù)制起點(diǎn)。,單復(fù)制子,多復(fù)制子,（三）半不連續(xù)合成,在DNA復(fù)制過(guò)程中，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而另一條鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成。體內(nèi)僅含催化53合成的DNA聚合酶。60年代，岡琦片段的發(fā)現(xiàn)：合成53前導(dǎo)鏈（leadingstrand）是連續(xù)的，方向與復(fù)制叉一致。合成35隨從鏈時(shí)，方向與叉相反，合成不連續(xù)，各片段連成一條鏈。,在DNA復(fù)制時(shí)，1條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制，叫作前導(dǎo)鏈；而另一條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向正好相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成幾個(gè)片段(岡崎片段)合成，稱(chēng)之為滯后鏈。,（四）DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶,TopoI和TopoII,解鏈酶和SSB的作用,2引物酶合成RNA引物,3DNA聚合酶延長(zhǎng)子鏈,E.Coli的DNA聚合酶,真核生物的DNA聚合酶,DNA聚合酶水解引物并填補(bǔ)空隙,4DNA連接酶連接岡崎片段,第二節(jié)DNA生物合成過(guò)程,DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。1解旋解鏈，形成復(fù)制叉：由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）四聚體結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。,一、復(fù)制的起始,2引發(fā)體組裝和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復(fù)制起始區(qū)域形成引發(fā)體；在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3端自由羥基（3-OH）。,二、復(fù)制的延長(zhǎng),復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA聚合酶催化下，以35方向的親代DNA鏈為模板，從53方向聚合子代DNA鏈。其化學(xué)本質(zhì)是dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，磷酸二酯鍵不斷生成。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長(zhǎng)的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH3,3,DNA復(fù)制的延長(zhǎng)過(guò)程,領(lǐng)頭鏈的合成過(guò)程,隨從鏈的合成過(guò)程,DNA聚合酶催化領(lǐng)頭鏈和隨從鏈同時(shí)合成,DNA復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖,三、復(fù)制的終止,在復(fù)制過(guò)程中形成的RNA引物，需由RNA酶來(lái)水解去除；RNA引物水解后遺留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延長(zhǎng)缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。,（一）去除引物，填補(bǔ)缺口：,在DNA連接酶的催化下，生成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來(lái)，形成完整的DNA長(zhǎng)鏈。,（二）連接岡崎片段：,隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接,DNA復(fù)制的過(guò)程,端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。,（三）真核生物端粒的形成：,線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。,端粒酶(telomerase),端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程對(duì)末端DNA鏈進(jìn)行延長(zhǎng)。,端粒酶的分子結(jié)構(gòu),端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT),端粒酶的組成,端粒酶(telomerase)的作用機(jī)制爬行模型,端粒酶的爬行模型（動(dòng)畫(huà)演示）,人的生殖細(xì)胞和癌細(xì)胞中，可以檢測(cè)到端粒酶活性；而在多數(shù)的體細(xì)胞中，未檢測(cè)到端粒酶活性(Kimetal,1994Science)。在人的永生化細(xì)胞中抑制端粒酶的活性，將導(dǎo)致端?？s短并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Herbertetal1999PNAS)在多數(shù)人的體細(xì)胞中，端粒隨著細(xì)胞傳代而漸漸縮短。將端粒酶導(dǎo)入到人的正常細(xì)胞中，細(xì)胞在體外至少可以多傳20代(Bodnaretal,1998Science)Werner綜合癥早老綜合癥是位于8號(hào)染色體短臂的一種DNA解旋酶基因突變,端粒在對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長(zhǎng)縮短的端粒（縮短的端粒其細(xì)胞復(fù)制能力受限），從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力。端粒酶在正常人體組織中的活性被抑制，在腫瘤中被重新激活，端粒酶可能參與惡性轉(zhuǎn)化。端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長(zhǎng)期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。,第三節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式,Section4ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays,一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶,逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象：,二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義,逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。,三、滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制,滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)：是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和M13噬菌體等。,滾環(huán)復(fù)制的過(guò)程,D環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)：是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制形式。,第四節(jié)DNA的損傷（突變）與修復(fù),由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱(chēng)為DNA的損傷，也稱(chēng)為突變（mutation）。常見(jiàn)的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。,一、突變的意義,（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（二）突變導(dǎo)致基因型改變（三）突變導(dǎo)致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ),（一）自發(fā)因素：1.自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達(dá)近萬(wàn)個(gè)核苷酸殘基。2.自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達(dá)幾十到幾百個(gè)核苷酸殘基。3.復(fù)制錯(cuò)配：由于復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)錯(cuò)誤引起的損傷，發(fā)生頻率較低。,二、引起突變的因素,胞嘧啶（C）,尿嘧啶（U）,由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價(jià)鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會(huì)引起復(fù)制障礙。,（二）物理因素：,嘧啶二聚體的形成,1.脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成H。,（三）化學(xué)因素：,2.烷基化劑：這是一類(lèi)帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。3.DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價(jià)結(jié)合引起損傷。4.堿基類(lèi)似物：如5-FU，6-MP等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。5.斷鏈劑：如過(guò)氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。,三、突變的分子改變類(lèi)型,DNA分子上單一堿基的改變稱(chēng)點(diǎn)突變(pointmutation)。,鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)亞基,正常成人Hb(HbA)亞基,血紅蛋白-亞基的點(diǎn)突變,3.缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。,4.插入：原來(lái)沒(méi)有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。,移碼突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。,缺失或插入都可導(dǎo)致移碼突變。,缺失引起的框移突變,5.重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱(chēng)為重組或重排。,由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型,四、DNA損傷的修復(fù),DNA損傷修復(fù)(repair)：是對(duì)已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其盡可能回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。,光修復(fù)(lightrepair)切除修復(fù)(excisionrepair)重組修復(fù)(recombinationrepair)SOS修復(fù),修復(fù)的主要類(lèi)型：,這是一種廣泛存在的修復(fù)作用，能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。修復(fù)過(guò)程由光修復(fù)酶(photolyase)催化完成。,（一）光修復(fù)（lightrepair）：,光修復(fù)酶的分子結(jié)構(gòu),其修復(fù)過(guò)程為：光修復(fù)酶(photolyase)識(shí)別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物。在300600nm可見(jiàn)光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開(kāi)。光修復(fù)酶從DNA上解離。,1、形成嘧啶二聚體,2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位,3、酶被可見(jiàn)光激活,4、修復(fù)后酶被釋放,DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù),這也是一種廣泛存在的修復(fù)機(jī)制，可適用于多種DNA損傷的修復(fù)。切除修復(fù)機(jī)制的基本過(guò)程是將受損的DNA片段切除，然后再以對(duì)側(cè)鏈為模板，重新合成新鏈進(jìn)行修復(fù)。,（二）切除修復(fù)(excisionrepair)：,在原核生物中，與DNA切除修復(fù)有關(guān)的蛋白質(zhì)包括UvrA、UvrB、UvrC，以及DNApol和DNA連接酶。UvrA和UvrB主要起辨認(rèn)和結(jié)合受損部位的作用；而UvrC則主要與受損片段的切除有關(guān)。,DNA的損傷和切除修復(fù),堿基丟失,堿基缺陷或錯(cuò)配,結(jié)構(gòu)缺陷,切開(kāi),核酸內(nèi)切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA連接酶,AP核酸內(nèi)切酶,核酸外切酶,切開(kāi),切除,修復(fù),連接,糖苷酶,插入酶,堿基取代,這是DNA的復(fù)制過(guò)程中所采用的一種有差錯(cuò)的修復(fù)方式。修復(fù)時(shí)，利用重組蛋白R(shí)ecA的核酸酶活性，將另一股健康親鏈與損傷缺口相互交換。,（三）重組修復(fù)(recombinationrepair),RecA的分子結(jié)構(gòu),DNA的重組修復(fù),胸腺嘧啶二聚體,復(fù)制,核酸酶及重組蛋白,修復(fù)復(fù)制,DNA聚合酶,DNA連接酶,重組,RecA重組蛋白修復(fù)DNA示意圖,當(dāng)DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。在E.coli中，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一個(gè)稱(chēng)為調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過(guò)SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而DNA保留的錯(cuò)誤