（預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)論文）豬β防御素2多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)書 學(xué)位論文 否 如需保密，解密時間年 月日 是否保密 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究 成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已 經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位 或證書而使用過的材料，指導(dǎo)教師對此進(jìn)行了審定。與我一同工作的同志對本研究 所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說明，并表示了謝意。 研究生簽名：髓i 妻 時間： 弘j 。 年爹月2 7 日 學(xué)位論文使用授權(quán)書 本人完全了解華中農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)生必須按照 學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存提交論文的印刷版和電 子版，并提供目錄檢索和閱覽服務(wù)，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、 匯編學(xué)位論文。本人同意華中農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué) 位論文的全部或部分內(nèi)容，并授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所和北京萬方數(shù)據(jù)股份有 限公司將本人學(xué)位論文收錄到中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行信息服務(wù)( 包括 但不限于匯編、復(fù)制、發(fā)行、信息網(wǎng)絡(luò)傳播等) ，同時本人保留在其他媒體發(fā)表論文 的權(quán)力。 注：保密學(xué)位論文( 即涉及技術(shù)秘密、商業(yè)秘密或申請專利等潛在需要提交保密的 論文) 在解密后適用于本授權(quán)書。 黼張譚孵 黜名：閣矧 簽名日期：弦f o 年占月7 日 簽名日期：山f 啤月廠日 注：請將本表直接裝訂在學(xué)位論文的扉頁和目錄之間 豬b - 防御素2 多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用 目錄 摘要荽l a b s t r a c t 2 縮略詞4 1 文獻(xiàn)綜述5 1 1 抗菌肽的研究進(jìn)展5 1 1 1 抗菌肽的性質(zhì)和自然作用5 1 1 2 陽離子抗菌肽的作用機制8 1 1 3 臨床應(yīng)用及前景9 1 2 豬的抗菌肽的研究進(jìn)展1 0 1 2 1 豬h d p 的組成成分和構(gòu)效關(guān)系1 l 1 2 2 抗菌活性l5 1 3 豬b 防御素2 1 9 2 研究背景、目的及意義。2 0 3 材料與方法2l 3 1 試驗材料2l 3 1 1 菌株、細(xì)胞及實驗動物2 1 3 1 2 培養(yǎng)基及主要試劑2 1 3 1 3 主要儀器設(shè)備2 l 3 2 主要溶液及其配制2 2 3 2 1 細(xì)胞培養(yǎng)基溶液2 2 3 2 2e l i s a 相關(guān)溶液2 2 3 2 3 免疫組織化學(xué)相關(guān)溶液一2 2 3 2 4 腹水提純相關(guān)溶液的配制一：2 3 3 3 方法2 3 3 3 1 單克隆抗體制備的方法2 3 3 3 2 免疫組織化學(xué)的方法2 8 4 結(jié)果與分析3 0 4 1 最佳抗原包被濃度的確定3 0 4 2 免疫小鼠抗體效價3 0 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 4 3 多克隆抗體的間接免疫熒光驗證3 1 4 4 細(xì)胞融合結(jié)果及亞克隆。3 2 4 5 單克隆抗體的生產(chǎn)和效價的測定3 3 4 6 單克隆抗體的特異性鑒定。3 4 4 7 免疫組化最佳一抗工作濃度的確定3 5 4 8 免疫組化最佳顯色時間的確定3 6 4 9 免疫組化的半定量結(jié)果3 7 1 ；討論：；9 5 1 免疫用抗原和檢測用抗原3 9 5 2 動物免疫。3 9 5 3 雜交瘤細(xì)胞的篩選4 0 5 4 雜交瘤細(xì)胞的亞克隆4 l 5 5 雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇4 1 5 6 基于p b d 2 單克隆抗體的免疫組化條件的優(yōu)化。4 2 5 7 關(guān)于免疫組織化學(xué)結(jié)果的討論4 3 6 結(jié)論4 4 參考文獻(xiàn)4 5 致謝。5 0 i i 豬d 一防御素2 多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用 。1 。1 摘要 抗菌肽是由動物機體自身分泌的抵抗外界病原微生物的一類微量的重要蛋白 質(zhì)，它在動物的先天免疫中發(fā)揮十分重要的作用。因其獨特的抗菌機制、廣泛的抗 菌譜以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點，近年來成為研究的熱門。防御素是其中一類重要 的小分子陽離子抗菌肽。目前有不少研究者試圖通過轉(zhuǎn)基因動物大量表達(dá)防御素， 以增強轉(zhuǎn)基因動物的抗病能力。為了建立檢測豬p 一防御素2 ( p b d 2 ) 在豬和轉(zhuǎn)基因 動物中的表達(dá)，本研究制備了p b d 2 的多克隆抗體和單克隆抗體，建立了間接免疫 熒光和免疫組織化學(xué)檢測方法。 本研究根據(jù)p b d 2 的氨基酸序列，人工合成了p b d 2 的1 1 肽，與鑰匙孔血藍(lán)蛋 白k l h 偶聯(lián)成全抗原p b d 2 k l h ，免疫b a l b c 小鼠，三次免疫后，以合成的3 7 肽作為p b d 2 抗體的檢測抗原，檢測小鼠血清效價，均達(dá)到1 ：1 2 8 0 0 以上，取其血 清制備小鼠抗p b d 2 的多克隆抗體，并利用該鼠源p b d 2 多抗建立了p b d 2 的間接 免疫熒光檢測方法。 通過間接e l i s a 方法篩選出抗體水平高的小鼠，取其脾細(xì)胞與s p 2 0 骨髓瘤細(xì) 胞融合，用間接e l i s a 方法篩選出陽性克隆，用有限稀釋法進(jìn)行兩次亞克隆，最后 獲得5 株雜交瘤細(xì)胞株1 c 2 、1 f 4 、2 h 2 、3 a 2 和4 8 1 ，均能夠穩(wěn)定分泌特異性好、 效價高的p b d 2 單克隆抗體；其細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體e l i s a 效價達(dá)到l ：2 1 0 以上， 腹水的抗體的e l i s a 效價達(dá)到l ：1 0 6 以上。 分別取臨床健康豬和胸膜肺炎放線桿菌血清1 型4 0 7 4 株感染豬的肝臟、脾臟、 腸系膜淋巴結(jié)、小腸等組織，用制備的單克隆抗體對其組織切片進(jìn)行s a b c 免疫組 化染色，分析p b d 2 在不同組織中的表達(dá)分布及表達(dá)差異。結(jié)果表明，豬p b d 2 在 肝臟中表達(dá)量最高，p b d 2 主要分布于肝臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞中也有廣泛分 布，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。不同動物和組織中p b d 2 的表達(dá)差異需要進(jìn)一 步結(jié)合熒光定量p c r 和雙抗夾心e l i s a 進(jìn)行驗證。 關(guān)鍵詞：豬d 防御素2 ；多克隆抗體；單克隆抗體；免疫組織化學(xué)；間接免疫熒光 a b s t r a c t a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ( a m p s ) a r eac l a s so fm i c r o p r o t e i n ss e c r e t e db ya n i m a l s t h e m s e l v e st or e s i s t p a t h o g e n i cm i c r o o r g a n i s m sf r o mt h ee x t e r n a lw o r l d a m p sa r e i m p o r t a n tf o ra n i m a li n n a t ei m m u n i t y b e c a u s eo ft h e i rs p e c i f i ca n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m b r o a da n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y , a n dg e n e r a t i n gt o l e r a n c eh a r d l y , a m p sa r eap o p u l a r r e s e a r c ha r e ar e c e n t l y am a j o rf a m i l yo fs h o r tc a t i o n i ca m p sf o u n di nm a m m a l s i st l l e d e f e n s i n s ，w h i c hc a nb ed i v i d e di n t ot w oc l a s s e s ，t h ea a n d1 3 - d e f e n s i n sa c c o r d i n gt ot h e i r s t r u c t u r a lf e a t u r e sa tt h eg e n ea n d p e p t i d el e v e l s b e t a - d e f e n s i n sa r ea m p so fk e yi n t e r e s t b e c a u s et h e yo p e r a t ei nb o t hi n n a t ea n da d a p t i v ei m m u n e r e s p o n s e si nm a m m a l s s o m e a m p g e n e sh a v eb e e nu s e dt og e n e r a t et r a n s g e n i ca n i m a l st oi m p r o v et h ea b i l i t yo f d i s e a s er e s i s t a n c e t h i ss t u d ya i m e dt og e n e r a t ep o l y c l o n a la n dm o n o c l o n a la n t i b o d i e s a g a i n s tp o r c i n e1 3 - d e f e n s i n2 ( p b d 2 ) ，a n dt oe s t a b l i s ht h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( i h c ) a n di n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c e ( i f a ) m e t h o d st oe v a l u a t et h ee x p r e s s i o no fp b d 2i n p i g sa n dt r a n s g e n i ca n i m a l su s i n gt h ea n t i b o d i e s a n11 。m e rp e p t i d e ( b e t w e e nt h et h i r da n df o u r t hc y s t e i n e s ) a n da 3 7 m e rm a t u r ep e p t i d e w e r es y n t h e t i z e da c c o r d i n gt ot h ek n o w n p r o t e i ns e q u e n c eo fm a t u r ep b d 2 t h e11 m e r p e p t i d ec o u p l e dw i t hk e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n ( p b d 2 k l h ) w a su s e da si m m u n o g e n t oi m m u n eb a l b cm i c e ，a n dt h es y n t h e t i s e d37 一m e tp e p t i d e ( p b d 2 ) w a su s e da sc o a t i n g a n t i g e nt os c r e e nt h ep b d 2a n t i b o d i e sv i ai n d i r e c te l i s a a f t e rt h r e et i m e si m m u l l e b a l b cm i c e ，g e tt h e i rs e r u mt od e t e c tt h et i t e r s ，a l lo ft h e i re l i s a t i t e r sr e a c h e du pt o 1 ：12 8 0 0 w eg e tt h eb a l b cm i c es e r u mt o p r e p a r e dm o u s ea n t i p b d 2p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s ，a ni n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a yw a sa l s oe s t a b l i s h e du s i n gt h ep b d 2 p o l y c l o n a la n t i b o d i e s t h es p l e e nc e l l sf r o mt h ei m m u n i z e dm i c ew i t hh i g h l ya n t i b o d yl e v e l sw e r ef u s e dw i t h t h es p 2 0m y e l o m ac e l l s t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r es e l e c t e db yi n d i r e c te l i s a m e m o d a f t e rt w ot i m e so fs u b c l o n i n gb y l i m i t i n gd i l u t i o n ，5s t r a i n so fh y b r i d o m a , 1c 2 ，1f 4 ，2 h 2 ， 3 a 2a n d4 b1 ，w e r ee v e n t u a l l yo b t a i n e d ，w h i c hc o u l ds e c r e th i g hl e v e l s o fm o n o c l o n a l a n t i b o d i e sw i t hg o o ds p e c i f i c i t y t h e i re l i s at i t e r si nt h es u p e r n a t a n t so fc e l l c u l t i 肛e s w e r e1 ：2 ，a n dt h o s ei nt h ea s c i t e sw e r e1 ：10 6r e s p e c t i v e l y 2 豬p - 防御素2 多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用 t h et i s s u e sf r o mc l i n i c a lh e a l t h ya n da c t i n b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a e4 0 7 4 一i n f e c t e dp i g s ， s u c ha sl i v e r , s p l e e n ，m e s e n t e r i cl y m p hn o d e sa n di n t e s t i n e s ，w e r es e l e c t e dt op r e p a r e h i s t o l o g i c a ls e c t i o n s t h es a b ci m m u n o h i s t o c h e m i s t r i c a ls t r a i n i n gw a s c a r r i e do u to n t h e s es e c t i o n su s i n gt h ep b d 2m o n o c l o n a la n t i b o d i e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e h i g h e s te x p r e s s i o no fp b d 2i si nt h el i v e r ，a n dt h ep b d 2i sm a i n l yd i s t r i b u t e di nt h e v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l sa n dl i v e rc e l l s ，b o t hi nc y t o p l a s ma n dn u c l e u s r e a l t i m e r t - p c ra n ds a n d w i c he l i s am a yb en e e d e dt od e t e r m i n et h eq u a n t i t a t i v ed i f f e r e n c eo f p b d 2e x p r e s s i o ni nd i f f e r e n tt i s s u e sa n da n i m a l s k e yw o r d s ：p o r c i n e1 3 - d e f e n s i n2 ；p o l y c l o n a la n t i b o d i e s ；m o n o c l o n a la n t i b o d i e s ； i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ；i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c e 3 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 縮略詞 縮寫 英文全稱中文全稱 a m p a b a g b s a d m s o d a b e l i s a f c a f i a g h h g p i 汀 h r p k g l m g m l m a b o d p h p b s p e g r r a i n s e c t a m p l i c i l l i n a n t i b o d y a n t i g e n b o v i n es e r u ma l b i u m d i m e t h y ls u l f o x i d e 3 , 3 - d i a m i n o b e n z i d i n eh y d r o c h l o r i d e e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t f r e u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n t g r a m h o u r h y p o x a n t h i n e g u a n i n e t r a n s f e r a s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i m m u n o g l o b u l i ng l i t e r m i l l i g r a m m i l l i l i t e r m o n o c l o n a la n t i b o d i e s o p t i c a ld e n s i t y h y d r o g e ni o ne x p o n e n t p h o s p h a t eb u f f e r ds a l i n e p o l y e t h y l e n eg l y c o l r o t a t i o np e rm i n u t e s e c o n d t h y r n i d i n e 氨芐青霉素 抗體 抗原 牛血清白蛋白 二甲基啞砜 3 ，3 二氨基聯(lián)苯胺 酶聯(lián)免疫吸附試驗 弗氏完全佐劑 弗氏不完全佐劑 克 小時 p h o s p h o r i b o s y l 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸 核苷酸轉(zhuǎn)移酶 辣根過氧化物酶 免疫球蛋白g 升 毫克 毫升 單克隆抗體 光密度 酸堿值 磷酸鹽緩沖液 聚乙二醇 每分鐘轉(zhuǎn)速 秒 胸腺嘧啶核苷 峙 m i c r o g r a m 微克 4 豬p - 防御素2 多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用 1 文獻(xiàn)綜述 1 1 抗菌肽的研究進(jìn)展 抗菌肽是近年來發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于人、動物、植物、微生物等所有生命形 式中的陽離子小分子兩極中性多肽，是先天性免疫防御的重要組成部分。在許多動 物中，尤其是無脊椎動物，這些肽提供了主要的免疫保護(hù)，在高等的脊椎動物中， 除了保持有效的抗菌活性，有些抗菌肽還具有抗病毒、抗原蟲、抗真菌、和抑制或 殺傷腫瘤細(xì)胞等作用，其中還有些多肽具有免疫調(diào)節(jié)活性，所以這些肽經(jīng)常被叫做 宿主防衛(wèi)肽。 這些宿主防衛(wèi)肽為抗菌藥物提供了模板，宿主防衛(wèi)肽的抗菌作用直接，快速， 有效，而且有非常廣譜的抗菌效果；所以它們非常有潛力成為一種新的抗生素，盡 管臨床試驗迄今為止只對之對局部表面的因子有效。但是這些復(fù)合物實現(xiàn)了它的臨 床治療目的，克服了臨床退步 1 1 1 抗菌肽的性質(zhì)和自然作用 陽離子宿主防御肽( 抗菌肽) 是由基因編碼和前體肽通過一個或者多個蛋白水 解激活產(chǎn)生。它們可以通過短肽( 1 0 5 0 個氨基酸) 、整體正電荷( 一般+ 2 ，+ 9 ) 和 高比例的疏水殘基( 3 0 ) 來確定( h a n c o c kr e w e t a 1 1 9 9 8 ；z a s l o f f m 2 0 0 2 ) 。這些 性質(zhì)使其在三維結(jié)構(gòu)中可以折疊成兩性結(jié)構(gòu)，經(jīng)常結(jié)合在膜的表面，因此它們與帶 正電荷和疏水氨基酸分離開來。折疊肽分為以下四個結(jié)構(gòu)組：2 至4 個二硫鍵穩(wěn)定 的1 3 折疊肽( 例如，人的q 和b 防御素，菌絲霉素和內(nèi)源性抗微生物多肽) ；q 螺旋肽( 例如，l l 3 7 ，蛾血素和滑爪蟾素) ；富甘氨酸、脯氨酸、色氨酸、精氨酸 和組氨酸延伸結(jié)構(gòu)( 例如，i n d o l i c i d i n ) 和含一個二硫鍵的環(huán)肽( 例如，b a c t e n e c i n ) 。 這是一個巨大的多樣性序列，其類似物在已確定的宿主防御肽的密切相關(guān)物種 中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)。一個包括8 9 5 個真核宿主防御肽( 2 0 0 4 年11 月) 的數(shù)據(jù)庫已建立， 圖1 從這個數(shù)據(jù)庫中選擇了一部分防御肽的初級空間結(jié)構(gòu)作為示例。來源于其抗菌 功能和不同致病微生物所面臨每個宿主有機體的免疫的陽離子多肽的巨大多樣性 引起人們的爭論，這是值得注意的，但是，包括免疫和再生功能的不同蛋白顯示了 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩上學(xué)位論文 類似“快速進(jìn)化到宿主防御肽( 抗菌肽) ( e m e sr d e t a 1 2 0 0 3 ) 。任何給定的哺乳 動物有機體可能需要許多不同的多肽，并且這些多肽大概有抗菌和天然免疫調(diào)節(jié)兩 種功能。因此基因敲除任何單個多肽可能產(chǎn)生相當(dāng)溫和的表型并不令人驚訝，有相 當(dāng)一部分人缺乏這些多肽( 這些包括特異性顆粒缺陷和m o r b u s - k o s t m a n n 綜合癥都 存在著復(fù)雜的其他潛在缺陷) 。 宿主防御肽甚至只在哺乳動物中就有實質(zhì)的不同。例如，c a t h e l i c i d i n 肽鼠 c r a m p 和人l l 3 7 只有6 7 的同源性，并且這兩個物種都缺乏大量的牛中的 c a t h e l i c i d i n ；小鼠缺乏嗜中性粒細(xì)胞q 防御素，它在人類嗜中性粒細(xì)胞中是最普通 的蛋白；牛在腸道和嗜中性粒細(xì)胞中完全缺乏q 防御素。事實上，防御素甚至在靈 長類中就有很大的差別，這些基因被認(rèn)為是受到積極的選擇，并且是哺乳動物蛋白 組中最快速的進(jìn)化。看了可能是天然免疫系統(tǒng)的一個組成部分以及相應(yīng)的微生物應(yīng) 對策略，包括抵抗能力和毒力( 反免疫力) 策略宿主防御肽快速進(jìn)化，有助于 推動生物王國中的多樣性發(fā)展( b o w d i s h d m e e t a 1 2 0 0 5 ；p e s c h e l a 2 0 0 6 ) 。 但是，一些宿主防御肽的結(jié)構(gòu)主題確實存在。防御素和所謂的c a t h e l i c i d i n s 哺 乳動物基因結(jié)構(gòu)相對保守，并且它們的前提蛋白區(qū)域序列也是保守的。在有二硫鍵 的多肽三維結(jié)構(gòu)的主題中，所謂的y 核，被保守的認(rèn)為是通過2 5 億年的進(jìn)化，目 前也存在于活性毒素膜和化學(xué)增活素中，暗示這一主題在效應(yīng)因子功能中的潛在作 用和進(jìn)化關(guān)系可能受宿主致病菌關(guān)系的控制。 與b 折疊肽不同，q 螺旋和擴展肽( 包括許多c a t h e l i c i d i n s ) 往往在溶液中高度 變通，并且通過兩性分子結(jié)構(gòu)結(jié)合到膜和類似膜的上面。這也適用于細(xì)菌肽( 也被 稱為細(xì)菌素) ，即使它們包括一個或者兩個二硫鍵。在革蘭氏陽性菌的細(xì)菌素中， 存在著一種特別的團(tuán)體，硫醚抗生素( 包含羊毛硫氨酸的肽類抗生素) ，它的主要 特征是由翻譯后修飾的絲氨酸和半胱氨酸殘基( 例如，乳酸鏈球菌肽和m e r s a c i d i n ； 圖1 ) 形成的基于硫醚鍵的分子內(nèi)環(huán)( m c a u l i f f eo ，e t a 1 2 0 0 1 ) 。羊毛硫氨酸環(huán)，其中 些代表保守結(jié)合為識別特異靶器官的基序，產(chǎn)生了在多肽中確定的空間結(jié)構(gòu)的片 段。這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)還提供抵御蛋白酶的穩(wěn)定性，可能包括抗原加工裝置，因為抵御 搞跨橋抗體比如m e r s a c i d i n 是很難獲得的。 除了在核糖體合成抗菌肽，微生物也能利用大量的多功能酶產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣性廣 泛的肽類抗生素，這些酶被稱為非核糖體肽合成酶( f i n k i n g ，r 2 0 0 4 ) 。這些酶具有模 塊化的結(jié)構(gòu)，每個模塊合成或者修飾成一個特定的氨基酸，容納殘基留在d 配位以 及與其他非蛋白氨基酸形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)、糖基化和?；?。一些非核糖體合成肽包括 6 豬爭防御素2 多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用 陽離子多肽多粘霉素b 和短桿菌肽s 的突出例子已用于外用治療感染，以及非陽離 子肽糖萬古菌素和脂糖達(dá)托霉素，它們已成為重要的儲備抗生素對付多抗耐藥性的 革蘭氏陽性茵。 由于許多細(xì)菌的衍生肽的有效的抗體活性，在低濃度范圍內(nèi)，人們經(jīng)常認(rèn)為這 些多肽是對付生態(tài)小境的有效武器。不過與其他抗生素化合物相比，實驗數(shù)據(jù)尚未 獲得來顯示，例如，硫醚抗生素在復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)如人胃腸道或者皮膚生產(chǎn)或者外 源性生產(chǎn)株可以有效地與先前存在的正常菌群競爭，因為它們能夠產(chǎn)生一種抗菌素 化合物。相比之下，金黃色葡萄球菌硫醚抗生素基因簇的敲除導(dǎo)致小鼠膿腫模型生 在抑制( c o u l t e r , s n e t a l 1 9 9 8 ) ，這表明細(xì)菌素可能有其他的生態(tài)功能。 l l - f f t h u m a nc 自增d t 幽 l n d c 曬0 i c - n b c m n o 白瞻n 刪 n 磚h 8 a m m a la r t t b a 盤 m g 曙a d 由 b a 由n a n x b p o h c m y 豳b n a 卜f j b 舢 一 攀匝互量圜 由l 二二一 d i 卜舟q - 咖i c t j 圖l 宿主防御肽的結(jié)構(gòu)和序列+ f i g u r e2 s e l e c t e ds t r u c t u r e sa n d s e q u e n c e so fh o s t - d e f e n s ep e p t i d e s 本圖引自：r o b e r tew h a n c o c k ，2 0 0 6 7 一如 f u 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 2 陽離子抗菌肽的作用機制 幾乎每一個帶有凈正電荷和一些疏水殘基的肽序列都會有抗菌活性，文獻(xiàn)中經(jīng) 常在緩沖液中或者在稀釋的培養(yǎng)基中檢測。然而，值得注意的是，陽離子宿主防御 肽的抗菌活性通過二價陽離子如m 9 2 十和c a 2 + ( 生理濃度1 - 2 r a m ) 、單價陽離子n r 和k + ( 1 0 0 m m ) 和多聚陰離子如氨基葡聚糖( 肝素和其他) 和粘蛋白拮抗可變程 度。因此，長期抗菌肽應(yīng)該留給那些能令人信服地證明有能力直接殺死這種條件下 的微生物。 抗微生物肽的陽離子和兩性分子性質(zhì)與它們的活性相關(guān)。整體正電荷可以確保 其聚集在聚陰離子微生物細(xì)胞表面，包括酸性聚合物，例如在革蘭氏陽性菌和革蘭 氏陰性菌中的脂多糖、與壁關(guān)聯(lián)的磷酸壁酸。它們通過自我促進(jìn)吸收方式將前體運 輸?shù)侥さ耐饷? h a n c o c k , r e w 1 9 9 8 ) 。隨后，這些肽以插入的方式結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)膜 的表面，跨越膜磷脂脂肪酸?；i鏈和親水性首基界面接口?？咕牟迦肽ず?，通 過細(xì)化膜，瞬態(tài)移位和破壞屏障作用，或者通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移和內(nèi)靶作用，破壞了雙 分子層的整體性。 幾個復(fù)雜的和有爭議的模型描述這些并發(fā)事件，包括調(diào)整肽分子垂直于膜的形 成或桶，木板或環(huán)形通道，作為負(fù)責(zé)淹沒膜由在界面地毯肽的結(jié)果擊穿細(xì)胞膜完整 性，洗滌劑，如解散膜補丁和雙層內(nèi)的肽脂質(zhì)聚集形成( j e n s s e n ，h e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。每 個成功預(yù)測陽離子抗菌肽能夠打破在細(xì)胞質(zhì)的膜，但只有環(huán)形通道和聚合模型解釋 某些肽作用細(xì)胞質(zhì)的目標(biāo)。事實上，在幾篇綜述的討論中描述了很多肽的作用無 法解釋中斷的膜的通透性障礙的( p e s c h e l ，a 2 0 0 6 ；j e n s s e n , h e ta 1 ，2 0 0 6 ；y e a m a n ，m 2 0 0 3 ) 。其他高電荷肽可能會干擾細(xì)胞外部的細(xì)胞壁水解酶的活性。類似的機制也應(yīng) 用于肽的抗病毒和抗真菌作用( j e n s s e n ，h e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 臨床可用常規(guī)抗生素的發(fā)展已被往往偏重于有一個單一的主要目標(biāo)和單模的 動作，每個抗生素的概念雖然這可能不完全正確( b r a z a s ，m d 2 0 0 5 ) 。大自然似乎已 選擇一個不同的概念演化的天生的宿主防御肽有利于打擾很多生物學(xué)功能與溫和 的效力的臟藥物的設(shè)計，而不是阻止特定的高親和靶標(biāo)( p e s c h e l ，a 2 0 0 6 ) 。多肽的 有效性可達(dá)幾十億年，因此這種路徑可能代表一種可以延長抗菌素的半衰期和在一 二十年以后依然可以使用這種抗生素的最傳統(tǒng)的的方法。毫無疑問，這種多肽最終 會誘發(fā)產(chǎn)生抵抗力( p e s c h e l ，a 2 0 0 6 ；p e r r o n , g g ，2 0 0 6 ) 。盡管這種抵抗力顯然很難達(dá)到 傳統(tǒng)抗生素，有人建議，如果它可以導(dǎo)致對天然人類抗微生物肽的交叉抵抗力，將 8 豬p - 防御素2 多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用 需要更嚴(yán)肅的思考( p e r r o n ，g g ，2 0 0 6 ) 。然而，幾個內(nèi)容也許可以緩解這些問題，包 括到目前為止的這一事實，( i ) 所有基因敲除宿主防御肽的動物相當(dāng)健康，只稍微改 變了動物易感性和感染的關(guān)系，( i i ) 實驗室篩選突變體的交叉抵抗力對其他多肽似乎 是有限的( s a m u e l s e n ，o e ta 2 0 0 5 ) ，對于這些多肽不會被耐藥性影響的免疫調(diào)節(jié)性能 的重要己逐漸被人認(rèn)定。 就硫醚抗生素來說，一個分子結(jié)合幾個抗生素的活性的概念在效價未達(dá)到以前 的效力之前的已經(jīng)被證實，例如，乳酸鏈球菌肽，乳鏈球菌菌素( b r e u k i n k , e 2 0 0 6 ) 。 此外，中度親和力的目標(biāo)，這些肽來對抗一個廣泛的革蘭氏陽性菌，它們也具有高 親和力的互動焦磷酸膜結(jié)合細(xì)胞壁前體脂質(zhì)i i ( b r e u k i n k , e 2 0 0 6 ) 。領(lǐng)導(dǎo)更有效地形 成，結(jié)合位點毛孔和或細(xì)胞壁肽聚糖合成的抑制作用。當(dāng)這些活動的共同操作，通 常是與生產(chǎn)密切相關(guān)的細(xì)菌菌株的情況下，亞單位濃度足以殺死。 1 1 3 臨床應(yīng)用及前景 自然界中陽性肽結(jié)構(gòu)多樣并且有一系列的臨床活性，這很大程度上鼓舞著我 們?nèi)ズ铣尚碌碾亩?。盡管經(jīng)過了二十多年的研究，臨床上只有很少的成功案例 ( z h a n g ，l 。2 0 0 6 ) 。 到現(xiàn)在為止，有四種陽性肽段進(jìn)入了3 期臨床實驗。這些肽段可能對膿皰病 或者糖尿病和口粘膜炎及敗血癥、尿道引起的感染有作用。只有兩種已經(jīng)被證明 有效。 注射p e x i g a n a n 和口服抗生素一樣， 通常用于糖尿病足底潰瘍患者，對9 0 的患者有治療作用。盡管如此，美國食品藥品管理局依然沒有批準(zhǔn)這種藥物的應(yīng) 用。在3 期臨床試驗a 中，預(yù)防尿路感染的藥物o m i g a n a n 因為缺少試驗病人而 沒有通過一線個初級臨床藥靶實驗。但是這藥物確實在預(yù)防感染和減少尿路細(xì)菌量 上有顯著的作用?，F(xiàn)在，驗證性的3 期臨床b 期正在進(jìn)行。 陽離子抗菌肽包含強效的、用途廣泛的分子，它們具有許多理想的屬性。在未 來的一年左右，人們很可能會發(fā)現(xiàn)陽離子抗菌肽應(yīng)用于醫(yī)療實踐的方法，在臨床與 導(dǎo)管相關(guān)聯(lián)的感染的環(huán)境中真正需要這樣一個解決辦法。雖然現(xiàn)在在臨床上的后續(xù) 產(chǎn)品還相對較少，但可以預(yù)見，多肽應(yīng)用于其他專題的用途將會得到更加廣泛的探 討。一個特別感興趣的下一步計劃就是探索氣溶膠構(gòu)想( z h a n g , l e ta t 2 0 0 5 ) ，雖然 傳遞到此方法的肺，可將其視為一個局部應(yīng)用，肺部感染構(gòu)成抗生素抗性發(fā)展關(guān)注 9 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 的嚴(yán)重的領(lǐng)域之一，并經(jīng)常提出使用抗生素腸外。因此肽可以克服對傳統(tǒng)抗生素 威脅生命感染由氣溶膠應(yīng)用時的阻力。 肽模擬技術(shù)的優(yōu)化作為另一個目標(biāo)似乎是指日可待的解決體內(nèi)穩(wěn)定性的穩(wěn)定， 它使得陽離子抗菌肽的蛋白酶耐模仿前景可行。另外成本問題通過模仿技術(shù)，特別 是與組合肽陣列的方法( 也使用相結(jié)合、建立多樣化的類似物) 也得到解決，這是 使用決策更小，具有廣泛活性肽的目標(biāo)。第三個目標(biāo)，這也許是較長期的，就是制 定或全身或口服應(yīng)用解決方案。為了達(dá)到這個目標(biāo)，首要目標(biāo)就是更詳細(xì)地了解潛 在毒性，可能限制肽系統(tǒng)應(yīng)用程序的性質(zhì)。盡管存在這些不確定性，但似乎可能會 發(fā)現(xiàn)肽抗生素在市場占據(jù)一席之地。 類似方法可能還會增強免疫調(diào)節(jié)宿主防御肽的發(fā)展。在這種情況下，當(dāng)抑制促 炎癥反應(yīng)細(xì)胞活素應(yīng)答時先天性免疫機制表達(dá)上調(diào)，提供了一個新的方法進(jìn)行抗感 染治療，因為引物肽不是通過直接作用于微生物而是通過于不同的先天性免疫系統(tǒng) 來發(fā)揮作用，所以不會刺激產(chǎn)生抗藥性。而陽離子肽不一定要解決日益嚴(yán)重的抗生 素耐藥性引起的所有問題，它們只是提供了一個新的方法來解決這一問題。 1 2 豬的抗菌肽的研究進(jìn)展 由于若干動物完整的基因組快速被測通并公布，許多抗菌肽的基因也通過生物 信息學(xué)分析的方法被確定。在豬里面，大約3 0 種豬的宿主防衛(wèi)肽( h d p ) 已經(jīng)被確 定，并部分了解了它們的結(jié)構(gòu)和功能( y o n g m i n gs a n g ，e ta 1 ，2 0 0 8 ) 。豬的h d p 在體外 具有廣譜的的抗菌活性，在體內(nèi)對動物機體具有保護(hù)性，這一點得到了大家的廣泛 評估，越來越多的證明顯示了h d p 在翻譯和分泌過程中機能上的區(qū)別以及它抗菌的 結(jié)構(gòu)單位和免疫調(diào)節(jié)功能是分開的，這些發(fā)現(xiàn)提出了在h d p 的基礎(chǔ)上進(jìn)行新的治療 藥物設(shè)計途徑的希望，包括豬的h d p 。 h d p 是內(nèi)源性免疫的重要成分，在動物和植物中無所不在。在許多動物中，特 殊的無脊椎動物，這些肽提供了主要的免疫保護(hù)，所以經(jīng)常被叫做抗菌肽，相反的， 在高等的脊椎動物中，除了保持有效的抗菌活性，其中還有些多肽有免疫調(diào)節(jié)活性， 所以這些肽經(jīng)常被叫做防衛(wèi)肽。最近的數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示大概有9 0 0 個基因編碼抗菌 肽，盡管h d p 顯示了非常多樣性的序列和生物功能，但在哺乳動物中，防御素和 c a t h e l i c i d i n s 仍然是最主要的兩種。 1 0 豬3 - 防御素2 多克隆和單克隆抗體的制備及應(yīng)用 c a t h e l i c i d i n s 包括一些主要存在于骨髓和上皮組織中的多肽，所有的 c a t h e l i c i d i n s 共用同一種前導(dǎo)肽序列，它與一種最先是從豬的粒性白細(xì)胞分離出來的 半胱氨酸蛋白酶抑制劑c y s t e i n e 類似，盡管在類似c y s t e i n e 的區(qū)域形成了兩個二硫 鍵，但是大多數(shù)c a t h e l i c i d i n s 在c 末端抗菌的區(qū)域沒有二硫鍵。許多c a t h e l i c i d i n s 都有豐富的疏水殘基，主要是螺旋結(jié)構(gòu)，其中，豬的內(nèi)源性抗菌肽p g s 是例外，它 含有兩個分子內(nèi)二硫鍵。 哺乳動物防御素是抗菌肽中一個富含半胱氨酸的大家族，它分成三類，q 一防 御素、1 3 一防御素、0 一防御素，q 一防御素與1 3 一防御素的不同之處在于二硫鍵 連接的半胱氨酸的位置不同，q 一防御素是由c y s l c y s 6 、c y s 2 - c y s 4 、c y s 3 一c y s 5 相 配對連接，而1 3 一防御素由c y s l c y s 5 、c y s 2 - c y s 4 、c y s 3 一c y s 6 相配對連接，o 一 防御素是從獼猴中分離出來的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的1 8 個氨基酸的多肽，從進(jìn)化的角度來說， 1 3 一防御素是防御素家族中最古老的。除了c a t h e l i c i d i n s 和防御素，還有一些富含 半胱氨酸的多肽，比如h e p c i d i n s ，肝臟表達(dá)的抗菌肽l e a p 2 ，肽聚糖識別多肽 p g r p ，以及在一些高等脊椎動物中鑒別出來的n k 分解素，包括豬。 因此，h d p s 包括從各種屬分離來的廣泛的小的陽離子多肽。成熟的多肽一般 有1 2 1 0 0 個氨基酸殘基，采取兩親的結(jié)構(gòu)。從機能上講，h d p s 的抗菌和免疫調(diào)節(jié) 的活性經(jīng)常分別與膜溶解和特異性的受體結(jié)合機制相關(guān)。 1 2 1 豬i - i d p 的組成成分和構(gòu)效關(guān)系 通過高等脊椎動物的種族發(fā)育來看，盡管大多數(shù)h d p s 都是保守的，但是依賴 于種族的多樣性是存在的。把豬的h d p s 和與他同源的人的，狗的，雞的進(jìn)行比較 ( 見表1 ) 。最早對于哺乳動物抗菌肽的研究已經(jīng)確定在所有物種中豬具有最多樣化 的c a t h e l i c i d i n s ，此外有很多c a t h e l i c i d i n s 亞型。成熟的豬c a t h e l i c i d i n s 多肽的分子 變化也是最大的( 表2 ) 。與人相似的，豬有多樣的1 3 防御素亞型；( 到目前為止被 確定的有1 3 種) ，q 防御素在豬體內(nèi)的沒有被確定過。其他的豬先天免疫效應(yīng)肽肽 如鐵調(diào)素、l e a p 2 、短異構(gòu)體p g r p 。s 、n k - l y s i n s 、脯氨酸豐富的乳鐵蛋白、粘膜 的s p b 都顯示有抗菌特性。然而天蠶抗菌肽p 1 ，一度被認(rèn)為是豬抗菌肽的同源的 昆蟲抗菌肽，現(xiàn)在知道是豬腸道寄生蟲和豬蛔蟲中得到的一種的隔離污染物。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 表1 比較豬的h d p 與人，狗，雞的h d p * t