（森林培育專業(yè)論文）擬南芥懸浮細胞生物學及其遺傳轉(zhuǎn)化模式.pdf

中文摘要 本文從擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織生物學特性研究入手，以期制備適合農(nóng) 桿菌高效轉(zhuǎn)化的受體材料，并制定科學、合理、有效的轉(zhuǎn)化方案；利用所構(gòu)成的 多個質(zhì)粒載體，進行擬南芥懸浮細胞基因轉(zhuǎn)化，以檢驗多種轉(zhuǎn)化方案的可行性， 并優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件：檢測轉(zhuǎn)化細胞報告基因的瞬時表達和穩(wěn)定表達，以期建立有效 的轉(zhuǎn)化模式，并獲得可利用的轉(zhuǎn)化材料。本論文所做的主要工作如下： 1 、擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織生長特性與培養(yǎng)條件 試驗研究了擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織的生長特性及其繼代培養(yǎng)條件，旨 在摸索維持擬南芥懸浮細胞正常穩(wěn)定生長的培養(yǎng)技術(shù)，并為擬南芥懸浮細胞進一 步的遺傳操作提供良好的受體材料和科學依據(jù)。結(jié)果表明，在每個7 d 一次的繼 代周期中，擬南芥懸浮細胞的生長表現(xiàn)明顯的s 型生長曲線。正常培養(yǎng)條件下， 繼代后2 - 4d 出現(xiàn)快速生長時期，此后生長量迅速下降，但接種量不同，其繼代 后懸浮細胞生物量及快速增長發(fā)生時期不同。維持7 d 繼代周期的理想接種量為 起始懸浮液按1 0 m l 5 0 m l 稀釋。接種量小，生長遲緩，甚至不能增殖。培養(yǎng)基中 不同激素及不同蔗糖含量均會對其生長產(chǎn)生極明顯的影響，在b 5 + 0 2 m g ln a a 條件下反復繼代后的細胞，再加入外源n a a 時，反而會抑制其生長。蔗糖含量 以3 0 9 l 最好；蔗糖含量低，懸浮生物量及細胞活性明顯下降。 擬南芥愈傷組織生長也呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，正常條件下，需經(jīng)歷約各1 0 d 的誘導時期、快速生長時期和生長停滯及老化時期。愈傷組織誘導及其生長對外 界條件也特別敏感，一定的表面濕度及較低的培養(yǎng)溫度是必須的。 2 、擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織對抗生素的反應(yīng) 試驗研究了擬南芥懸浮及其愈傷組織對潮霉素、卡那霉素、頭孢霉素等3 種抗生素的反應(yīng)，為擬南芥懸浮細胞轉(zhuǎn)化子抗生素選擇濃度和選擇方案的制定提 供依據(jù)。結(jié)果表明：潮霉素對擬南芥懸浮細胞生長、愈傷組織誘導及其生長均有 極明顯的抑制作用，但作用效果和特性均有所不同。擬南芥懸浮細胞繼代培養(yǎng)階 段、愈傷組織誘導階段和愈傷組織增殖階段的臨界致死濃度分別為2 5 ，2 5 ， 1 5 m g l ，液體與固體培養(yǎng)條件下差異極大。當采用潮霉素抗性標記篩選轉(zhuǎn)化子 時，應(yīng)當分別采用相應(yīng)階段的臨界致死濃度作為轉(zhuǎn)化子選擇濃度。與此同時，潮 霉素需要一定處理時間才能充分表現(xiàn)其抑制細胞生長或殺死細胞的效果，一般液 體培養(yǎng)條件下3 d 以后、固體培養(yǎng)條件下5 d 以后效果趨于穩(wěn)定，但不同的處理濃 度有較大差異，建議選擇時間在液體培養(yǎng)條件下不少于3 d ，在固體培養(yǎng)條件下 不少于5 d 。否則，假陽性率會很高，從而大大加重后續(xù)轉(zhuǎn)化子檢測的工作量。 卡那霉素與潮霉素有類似的影響，在愈傷組織誘導階段，適宜的選擇濃度為 5 0 m g l ，根據(jù)潮霉素作用特性推測，其在液體培養(yǎng)階段和愈傷組織生長階段的 適宜選擇濃度分別在1 0 0 m g l 、2 5 m g l 左右。后續(xù)的轉(zhuǎn)化試驗中，若利用卡那 霉素選擇，我們將采用這一選擇濃度。 試驗中意外發(fā)現(xiàn)頭孢霉素能促進綠色懸浮細胞的獲得，并具有逆轉(zhuǎn)懸浮細胞 “白化”的穩(wěn)定效果。有關(guān)懸浮細胞“白化”原因及頭孢霉素逆轉(zhuǎn)效應(yīng)機理，有 待進一步研究。 3 、擬南芥懸浮細胞耐受性試驗 選擇與其遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)的常溫靜置、低溫靜置、高溫振蕩、蔗糖饑餓和常溫 振蕩( 對照) 幾種不同處理方式，從其生長和細胞活性兩個方面，研究其對環(huán)境 脅迫的耐受性，以更好地制定擬南芥懸浮細胞基因轉(zhuǎn)化時細胞同步化或預(yù)處理及 共培養(yǎng)的方案和條件。結(jié)果表明：擬南芥懸浮細胞對各種脅迫處理的耐受性表現(xiàn) 出明顯的差異，整體耐受性強弱依次為：常溫振蕩( 對照) 蔗糖饑餓 高溫振 蕩 低溫靜置 常溫靜置，常溫靜置最低。擬南芥懸浮細胞對脅迫處理的不適應(yīng) 表現(xiàn)在多個方面，總生物量增長很少或不能增長，細胞相對活性及活細胞生物量 不斷下降，耐受系數(shù)低。隨著時間的變化，擬南芥懸浮細胞對脅迫處理的耐受性 或不適應(yīng)性的表現(xiàn)呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，這種變化的可能機制與細胞間協(xié)同與競 爭、細胞自我適應(yīng)機制的調(diào)節(jié)等有關(guān)。 4 、擬南芥懸浮細胞超低溫保存試驗 探索一般實驗室條件下擬南芥懸浮細胞的簡便保存技術(shù)，為中長期保存遺傳 背景穩(wěn)定一致的擬南芥懸浮細胞起始材料提供有效的方法。通過一系列試驗，本 文獲得了擬南芥超低溫保存的適宜方法。優(yōu)化方案如下：選擇繼代后2 d 的擬南 芥懸浮細胞，洗滌1 次，細胞沉淀重懸浮于6 蔗糖培養(yǎng)基，于4 0 c 低溫下鍛煉 6 h ；濃縮細胞使之有較高的細胞密度( 0 2 5 - 0 3 0 9 m 1 ) ，加入1 6 ( w v ) 甘油 作為冰凍保護劑，直接置于一8 0 深冷冰箱保存；使用時以3 7 快速解凍，離 心后除去保護劑，然后可用去離子水洗滌后進行活性檢測，也可用基本培養(yǎng)基洗 滌后重新進行懸浮培養(yǎng)。此方法保存3 0 d 后的細胞相對活性達o 8 左右，可以滿 足實驗室一般研究用。如果對其保存后的活性要求不很嚴，還可以進一步簡化， 例如，預(yù)處理前以懸浮細胞自然沉降代替離心洗滌后收集細胞沉淀：免去高滲預(yù) 處理，直接加入冰凍保護劑后在低溫下鍛煉6 h ；室溫下解凍等。 5 、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與制備 對本文擬使用的p b i b g u s 、p b m s a r s 、p b i n m g f p 5 - e r 等幾種質(zhì)粒載體 構(gòu)建和工程菌制備及其生長特性等進行了系列試驗。通過酶切和p c r 檢測實驗， 證明所構(gòu)建的p b i b g u s 、p b i b s a r s 載體正確，含有相應(yīng)的標志基因，可以用 于后續(xù)的擬南芥懸浮細胞基因轉(zhuǎn)化。采用電轉(zhuǎn)化法，成功地將p b i n m - g f - p 5 e r 質(zhì)粒d n a 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌細胞，轉(zhuǎn)化頻率為2 1 5 2 x 1 0 4 個舢g 質(zhì)粒，并在一系列檢測 實驗中得到證明。擬用的幾種不同質(zhì)粒具有基本相似但不完全相同的生長特性， 而且接種量及培養(yǎng)條件等，對其生長量有很大影響。采用本文方法，成功地制備 了可用于植物基因轉(zhuǎn)化的一系列工程菌株。 6 、轉(zhuǎn)化模式與轉(zhuǎn)化細胞選擇 比較3 種擬南芥懸浮細胞轉(zhuǎn)化方案，共培養(yǎng)后均獲得g u s 的瞬時表達，但 僅模式成功地獲得抗性愈傷組織。在模式基礎(chǔ)上，對所獲得的抗性愈傷組織 進行二次選擇，發(fā)現(xiàn)一次選擇后的轉(zhuǎn)化細胞“假陽性”現(xiàn)象十分普遍，推測農(nóng)桿 菌潛伏與爆發(fā)、懸浮細胞存在大量細胞團結(jié)構(gòu)并導致嵌合體形成，是轉(zhuǎn)化細胞“假 陽性”現(xiàn)象的主要原因。預(yù)處理方法、靜置共培養(yǎng)時間、恢復培養(yǎng)與液體選擇時 間、載體種類等轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化效率有重要影響，以2 0 ：m o l l 乙酰丁香酮預(yù)培 養(yǎng)l d 、靜置共培養(yǎng)3 6 h 、液體選擇培養(yǎng)2 d 、p b i b s a r s 為質(zhì)粒載體，可以獲得 較高的轉(zhuǎn)化效率，并大大降低假陽性率。對以上條件進行綜合優(yōu)化后，假陽性率 從8 2 降為1 7 。研究結(jié)果表明，在模式基礎(chǔ)上對轉(zhuǎn)化條件進行適當優(yōu)化， 可用于擬南芥懸浮細胞高效轉(zhuǎn)化。 7 、報告基因診斷與分子檢測 對所獲得的抗性愈傷組織進行g(shù) u s 活性檢測和p c r 分析。結(jié)果表明：具有 g u s 活性抗性愈傷組織均擴增出目的基因片段，初步證明，所選擇的7 4 份抗性 愈傷組織已成功地轉(zhuǎn)化。對低溫、高溫、高鹽及對照4 種處理后的懸浮細胞進行 蛋白質(zhì)抽提，表明懸浮細胞的蛋白質(zhì)組與葉片的蛋白質(zhì)組有很大不同；分別用 l - p s l 0 h 3 和l 。p s l 0 a c k l 4 h 3 作為第一抗體進行蛋白質(zhì)免疫雜交，表明各處理 均不同程度地發(fā)生組蛋白h 3 磷酸化及乙?；邷靥幚斫档土肆姿峄蛞阴?化水平。 8 、本文的所取得的重要進展及主要創(chuàng)新點 1 ) 系統(tǒng)研究了擬南芥懸浮細胞及其愈傷組織有關(guān)生物學特性、對抗生素的反 應(yīng)和對環(huán)境脅迫的耐受性，不僅積累了這一重要模式植物的細胞生物學資料，同 時使其遺傳轉(zhuǎn)化方案和條件的制定建立在細胞生物學依據(jù)之上，為實現(xiàn)擬南芥懸 浮細胞高效轉(zhuǎn)化提供了新的途徑，也為類似轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立提供了新的思路。 2 ) 摸索了擬南芥懸浮細胞維持培養(yǎng)的繼代條件，提出“繼代指數(shù)”概念， 同時建立了擬南芥懸浮細胞理論生長模型，為受體材料的制備提供了科學依據(jù)。 3 ) 摸索了擬南芥懸浮細胞在不同培養(yǎng)條件下和不同生長階段對抗生素的反 應(yīng)，使抗生素抗性標記選擇方案更加科學，改善了抗生素選擇效果。 4 ) 檢測或轉(zhuǎn)化了多種質(zhì)粒載體系統(tǒng)，建立了不同質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌的理論生 長模型，比較了不同質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌的生長特性，制備了可用于植物基因轉(zhuǎn)化的 一系列工程菌株。 5 ) 改進和優(yōu)化了擬南芥懸浮細胞遺傳轉(zhuǎn)化方案及條件，證明所建立的優(yōu)化模 式能夠大幅度提高基因轉(zhuǎn)化效率，促進了擬南芥懸浮細胞高效轉(zhuǎn)化目標的實現(xiàn)。 6 ) 發(fā)現(xiàn)并證明了頭孢霉素能顯著地促進擬南芥綠色懸浮細胞的獲得，成功解 決了懸浮細胞“白化”的技術(shù)難題，并且有可能發(fā)掘這一抗生素新的利用途徑。 7 ) 初步建立了擬南芥懸浮細胞的簡便保存技術(shù)，為中長期保存遺傳背景穩(wěn) 定一致的擬南芥懸浮細胞起始材料提供了有效的方法。 關(guān)鍵詞：擬南芥；根癌農(nóng)桿菌；懸浮細胞；遺傳轉(zhuǎn)化；生物學特性；細胞耐受性； 超低溫保存；抗生素抗性選擇 i a b s t r a c t t r a n s f o r m a t i o no fa r a b i d o p s i st h a l i a n a s u s p e n s i o n c e l l sw a sp e r f o r m e d d i f f e r e n tp r o t o c o l sa n dp a r a m e t e r sa f f e c t i n gt h et r a n s f o r m a t i o np r o c e d u r ew e r et e s t e d a n da no p t i m i z e dp r o t o c o lw a sd e t e r m i n e d t r a n s f o r m a n t sw a ss e l e c t e dw i t l l a n t i b i o t i cr e s i s t a n tg e n es c r e e n i n ga n dc h e c k e dw i t l lh i s t o c h e r n i c a lg u sa n dp c r a s s a y p r i o rt ot r a n s f o r m a t i o ne x p e r i m e n t s ，s o m er e l a t i o n a lb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c so f a r a b i d o p s i st h a l i a n as u s p e n s i o nc e l l sa n da g r o b a c t e r i ah a b o r i n gc e r t e i np l a s m i d w e r eo b s e r v e d 1 1 1 em a i nw o r k sa n dr e s u l t sa r es h o w na sf o l l o w s s u b c u l t u r ec o n d i t i o n sa n dg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fa r a b i d o p s i ss u s p e n s i o n c u l t u r e t h ee x p e r i m e n t so fa r a b i d o p s i st h a l i a n as u s p e n s i o nc u l t u r ew e r ep e r f o r m e d s o m e s u b c u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d ，a n dt h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fs u s p e n s i o n c u l t u r ew a so b s e r v e d t h et y p i c a ls l i k eg r o w t hc u r v ei nas u b c u l t u r ec y c l ew a s o b t a i n e d i nn o r m a lc o n d i t i o n , al o g a r i t h m i cp h a s eo fg r o w t ho fs u s p e n s i o nb i o m a s s w a so c c u r r e di n2 - 4d a y sa f t e rs u b c u l t u r e t h a nt h eg r o w t ho fb i o m a s ss l o w e dd o w n q u i c k l y h o w e v e r , i t sg r o w t ha n dt i m eo fl o g a r i t h m i cp h a s ew e r ec h a n g e dw i t l l i n o c u l a t i o na m o u n t 1 0 m l 5 0 m lo fd i l u t i n gr a t i oi sa d v i s a b l et os u b c u l t u r e t h e g r o w t hw a ss l o w e dd o w ne v e nh a l t e dw i t l l1 0 m l 5 0 r a lo fd i l u t i n gr a t i o d i f f e r e n t h o r m o n e si nm e d i aa f f e c t e dg r o w t ho f s u s p e n s i o nc e l l s b u tt h er e s u l tw a su n e x p e c t e d t h eb i o m a s so fs u s p e n s i o nc e l l ss u b c u i t u r e di nb 5m e d i u mw i t h o u ta n yh o r m o n e s w a sh i g h e rt h a nw i t ho 1 m g lo fb a pa n d0 2 m g ln a a ( a sn o r m a lm e d i u m ) c o n c e n t r a t i o no fs u c r o s eg r e a t l ya f f e c t sg r o w t ho fs u s p e n s i o nc e l l s c h a n g i n gi tf r o m n o r m a l3 0 9 ，lt o1 0 ，2 0 ，4 0g l ，m o r eo rl e s si n h i b i t i o no fg r o w t ha n dv i a b i l i t yw e r e o b s e r v e d t h ep a t t e r no fc a l l u sg r o w t hw a so b s e r v e d i ng e n e r a l ，e a c ha1 0do f p e r i o di s p r e s e n t e di nc a l l u si n d u c t i o np h a s e ，l o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s ea n dg r o w t h - s t o p p e d p h a s e i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r ea n dh u m i d i t yh a dar e m a r k a b l ei m p a c to nb o t h i n d u c 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o n so f h y g r o m y c i n bf o r a r a b i d o p s i s t h a l i a n ac e i l s w e r e 2 5 ，2 5 ，1 5 m g li nt u r n al o n go rs h o r tt i m eo ft r e a t m e n tw i t hh y g r o m y c i nb w a s n e c e s s a r yt oi m p a c to na r a b i d o p s i st h a l i a n ac e l l sf u l l y t h ei n h i b i t i o ne f f i c i e n c y b e c a m es t a b i l i z a t i o ni n3 - d a y si nl i q u i da n di n5 - d a y so ns o l i da f t e rt r e a t m e n tw i t h h y g r o m y c i nb ，b u tac o n s i d e r a b l ec h a n g ep r e s e n t e da m o n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s f u r t h e r m o r e ，t h ep r o b a b l ec a u s e so ft h ed i f f e r e n ti n h i b i t i o ne f f i c i e n c yb e t w e e nl i q u i d a n ds o l i dc u l t u r ec o n d i t i o nw e r ed i s c u s s e d ，a n ds o m es u g g e s t i o n sf o rs e l e c t i o no f h y g r o m y c i n r e s i s t a n c em a r k e ro nt r a n s f o r m a t i o no fa r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l s w e l t em a d e t h ei m p a c to fk a n a m y c i no na r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l sw a ss i m i l a rt oo f h y g r o m y c i nb t h el e t h a lc r i t i c a lc o n c e n t r a t i o nw a s5 0 m g lo nc a l l u si n d u c t i o n t h e r e s tm a yb ed e d u c e db ya n a l o g yo ft h er e a c t i o no fa r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l so n h y g r o m y c i nb ，1 0 0 m g la n d2 5 m g lo fl e t h a lc r i t i c a lc o n c e n t r a t i o n ss h o u l db e r a t i o n a lo ns u s p e n s i o ns u b c u l t u r ea n dc a l l u ss u b c u l t u r er e s p e c t i v e l y t h ee f f e c to f c e f e t a x i m eo nk e e p i n gs u s p e n s i o nc o l o rg r e e nw a sf o u n db yc h a n c e t h ef u r t h e re x p e r i m e n t sw e r es h o w e dt h a ts u s p e n s i o nc o l o rc a nb ec h a n g e df r o mp a l e t og r e e nw i t hc e f o t a x i m e t h ep o t e n t i a lc a u s eo ft h er e s u l tw a su n d e f i n e d i ti s v a l u a b l et 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d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l sw e r ep r e s e n t e dw i t h v 。；#。f， ；i 離婚， t i m e2 a r t o r l gt o4s t r e s sf a c t o r s c r y o p e r s e r v a t i o no f a r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l s as e r i e so f e x p e r i m e n t so nc r y o p e r s e r v a t i o no f a r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l sw a s p e r f o r m e d ，a n dav i a b l es a m p l em e t h o dw a so b t a i n e d t h eo p t i m i z e dp r o t o c o li s s h o w na sf o l l o w s ：t a k i n ga r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l si n2d a y sa f t e rs u b c u l t u r e ， w a s h i n gt h e mf o ro n et i m e r e s u s p e n d i n gt h ec e l lp e l l e ti nb a s i cm e d i u m 謝t l6 o f s u c r o s e 。p r e t r e a t i n g t h e s u s p e n s i o n f o r6 hw i t h4 0 cd e g r e e t e m p e r a t u r e ， c o n c e n t r a t i n gt h es u s p e n s i o n , a d d i n g1 6 ( w v ) o f g l y c e r o la sc r y o p r e t e c t i v ea g e n t ， p l a c i n ga n dk e e p i n gi ti nc r y o g e n i cr e f r i g e r a t o r ( 一8 0 ) ，t h a w i n gi tw i t h3 7 。c d e g r e et e m p e r a t u r ew h e nu s i n g ，t h e nc h e c k i n gv i a b i l i t i e so f c r y o p r e s e r v e ds u s p e n s i o n c e l l sa f t e rw a s h i n go rr e s u s p e n d i n gt h e mi nl i q u i dm e d i u m a f t e rc r y o p e r s e r v a t i o n ， t h er e l a t i v ev i a b i l i t yo fc r y o p r e s e r v e ds u s p e n s i o nc e l l sc o u l dr e a c h0 8a f t e r3 0d a y s t h i sp r o t o c o lc a nb ef u r t h e rs i m p l i f i e dd e p e n d i n go nt h er e q u i r e m e n to fv i a b i l i t yo f c r y o p r e s e r v e ds u s p e n s i o nc e l l s ，s u c ha sw i t h o u tp r e t r e a t i n gi nl o wt e m p e r a t u r e ， t h a w i n gc r y o p r e s e r v e ds u s p e n s i o nc e l l si nr o o mt e m p e r a t u r e t r a n s f o r m a t i o no fa g r o b a c t e r i aw i t hp l a s m i d sa n dp r e p a r a t i o no f e n g n e e r i n g b a c t e r i a n l ec o r r e c tc l o n i n go fi n s e r t si n t op b i b g u s 、p b i b s a r sw a sc o n f i r m e db y d i g e s t i o no fe n z y n l e sa n dp c ra s s a yo fu i d ao rs a i l s n 地r e s u l ti n d i c a t e db o m p b i b g u sa n dp b i b s a r sc a r r i e dc o r r e s p o n d i n gm a r k e rg e n e s ，a n dm e yc a n b eu s e d f o rt r a n s f o r m a t i o no fa r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l s 1 1 1 ed n ai s o l a t e df r o m p b i n m - g f p 5 - e rw a st r a n s f e r r e di n t oa g r o b a c t e r i u mw i t he l e c t r o t r a n s f o r m a t i o n , a n d 2 1 5 2 x 1 0 4 t r a n s f o r m a n t s p e r l p , g o f p l a s m i d d n a w e r eo b t a i n e d n l es i m i l a r g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c sw a so b s e r v e da m o n gs e v e r a lc l o n i n g so fa g r o b a c t e r i aw i t hd i f f e r e n t p l a s m i d s ，a n dt h eg r o w t ho fa g r o b a c t e r i u mw a sa f f e c t e dw i t ht h ea m o u n to f i n o c u l a t i o na n dc u l t u r ec o n d i t i o n p r o t o c o lo f t r a n s f o r m a t i o na n ds e l e c t i o no f t r a n s f o r m a n t s t h r e ek i n do f a r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l st r a n s f o r m a t i o np r o t o c o l sw e r ep u ti n p r a c t i c e ，a n dt h et r a n s i e n te x p r e s s i o no fg u sg e n ew a so b s e r v e di na l lo ft h et h r e e p r o t o c o l s b u tt h er e s i s t a n tc a l l iw a so b t a i n e do n l yi np r o t o c o l b a s eo np r o t o c o l ，as e c o n ds e l e c t i o no fa n t i b i o t i c sr e s i s t a n c ew a sp e r f o r m e d , a n dav e r yh i 出 f r e q u e n c yo f f a l s ep o s i t i v e i nt h ef i r s ts e l e c t i o nw a st e s t e d as t r o n ge f f e c to n e f f i c i e n c yo fa r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l s 旺a n s f o r m a t i o ne x e r t e db yp r e t r e a t m e n t ， c o c u l t i v a t i o nw i t h o u ts h a k i n g ，r e v i v i s c e n c ec u l t u r eo rl q u i d - s e l e c t i o na n dv e c t o r s t h ee f f i c i e n c yo ft r a n s f o r m a t i o nw o u l db ei m p r o v e dw h i l et h ef r e q u e n c yo f f a l s e p o s k i v e w o u l db er e d u c e dn o t a b l yw i t hf o l l o w i n gt r a n s f o r m a t i o n c o n d i t i o n s ： p r e t r e a t m e n tf o r 1d a y 謝m2 mm o l lo fa c e t o s y r i n g o n e ，c o c u l t i v a t i o nf o r3 6 h w i t h o u ts h a k i n g ，s e l e c t i o nf o r2d a y si nl i q u i da n dm e d i a t i n gw i t hp b i b s a r s p u t t i n ge v e r ym e a s u r e sa b o v et o g e t h e r , t h ef r e q u e n c yo f f a l s ep o s i t i v e f a i l e dd o w n f r o m8 2 t o1 7 t h er e s u l t sw e r es h o w nt h a t ，a f t e ro p t i m i z i n gt r a n s f o r m a t i o n c o n d i t i o n si nac e r t a i ne x t e n t ，t h ep r o t o c o lmc a nb e u s e df o ra r a b i d o p s i s s u s p e n s i o nc e l l st r a n s f o r m a t i o n d i a g n o s e sa n dm o l e c u l a rd e t e c t i o no fr e p o r t e rg e n e h i s t o c h e m i e a lg u sa n dp c ra s s a yf o rd e t e c t i o no fr e s i s t a n tc a l l iw e r ec o n d u c t e d t h er e s u l t sw e r es h o w nt h a tt h es e g m e n t so f t a r g e tg e n ew e r ea m p l i f i e db yp c rf r o m e a c hr e s i s t a n tc a l l iw h i c hw e r et e s t e da sp o s i t i v e 誠t l lg u s s t a i n i n g i tw a si n d i c a t e d a l lo f7 4p i e c e so fc a l l ih a db e e nt r a n s f e r r e ds u c c e s s f u l l y t o t a lp r o t e i nw a si s o l a t e d f r o ma r a b i d o p s 括s u s p e n s i o nc e i l sa n dl e a v e sw h i c hw e r et r e a t e dw i t hc o l d ，h e a ta n d s a l tr e s p e c t i v e l y t w od i f f e r e n tp r o t e i nm a p sw e r eo b t a i n e db e t w e e ns u s p e n s i o nc e l l s a n dl e a v e s i m m u n o b l o t t i n go fh i s t o n eh 3o na r a b i d o p s i ss u s p e n s i o nc e l l sw a s p e r f o r m e d b yl - p s l 0 h 3a n dl - p s l 0 a c k l 4 h 3 t h er e s u l tw a ss h o w nt h a tt h e p h o s p h o r y l a t i o na n da c e t y l a t i o nw e r ep r e s e n t e di ne a c ht r e a t m e n t s h o w e v e r , t h e s t r e n g t ho fp h o s p h o r y l a t i o na n da c e t y l a t i o nw a sr e d u c e dw i t hh i g ht e m p e r a t u r e ( 3 7 0 c 、 k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，a g r o b a c t e r i u mt u m f a c i o n ，s u s p e n s i o nc e l l s ， b i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c s ，t o l e r a n c eo fe e h s ，c r y o p e r s e r v a t i o n ，a n t i b i o t i c r e s i s t a n tg e n es c r e e n i n g v l i 縮略詞 縮寫英文名中文名 2 4 一d 6 b a a s c a t b c d n a c e f d n a e b e d l a e r g f p g m p g u s h d g s h y g i a a k a n 【a r m a t m e n a a n o s n p t i i o d p c r p d g s p e g p m b e 2 4 d i c h l o r o p h e x o x y a c e t i ca c i d 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e a c e t o