凝血.ppt

,血栓與止血檢測,血栓與止血檢測,一、止血、凝血和纖溶機制,二、凝血及纖溶實驗室檢測進展,三、血凝質控四、目前開展血凝項目的臨床意義五、常見分析錯誤的原因分析,血栓與止血檢測,一、止血、凝血和纖溶機制,（一）血管壁的作用,1.血管的收縮（神經反射；內皮素、血管緊張素；TXA2、5-HT）。2.血小板的激活（表達并釋放血管性血友病因子vWf，導致血小板在損傷部位黏附和聚集）。3.啟動內、外源凝血（因子的激活和組織因子TF的釋放）。4.局部血黏度增高。,血栓與止血檢測,（二）血小板的作用,1.形成血小板血栓(白色血栓)，機械性修復受損血管。2.血管受損GPb經vWf粘附3.釋放血小板第三因子（PF3）直接參與凝血反應。4.活化血小板在前激肽釋放酶及高分子量激肽原存在的條件下，直接激活F及F。5.ADP(來自紅細胞)、凝血酶、膠原血小板GPb/a結合Fg,血栓與止血檢測,（三）凝血因子的作用,(目前至少有14種),包括12個經典的凝血因子（因子I-XIII,除因子VI)以及激肽釋放酶原（PK）、高分子量激肽原(HMWK).除因子IV（Ca2+）外，其他均為蛋白質除因子III(TF)外，其他均存在于血漿中整個凝血過程分三期：凝血活酶形成期凝血酶形成期纖維蛋白形成期,血栓與止血檢測,（三）凝血因子的作用,1.外源性凝血途徑,2.內源性凝血途徑,3.凝血共用途徑,注意,12個凝血因子除F、F、和部分F外，主要產生于肝臟。F、F、F、F是維生素K依賴因子血友?。?、乙、丙）三種分別缺少F、F、F，均影響內源性凝血途徑。,IntrinsicXII,XI,IX,VIII(APTT),Extrinsic-VII(PT),ProthrombinThrombin,FibrinogenFibrin,CommonPath(TT)FXFXa,XIIIa,XIII,Thrombin,Fibrin(strong),Fibrinogen,Fibrin(weak),IX,XI,XIa,IXa,Xa,Va,XIIa,Prothrombin,TF-VIIa,(Prothrombinase),PL,PL,(Tenase),VIIIa,PL,X,IntrinsicPathway,HKa,ExtrinsicPathway,TFPathway,ProteinC,ProteinS,AntithrombinIII,血栓與止血檢測,（四）抗凝血系統(tǒng)的作用,1.細胞抗凝作用：包括單核巨噬細胞、肝細胞、血管內皮細胞,2.體液抗凝作用,抗凝血酶（AT-）,肝素介導下,滅活凝血酶、Fa、Fa、Fa、Fa,滅活TF/a、Fa,TFPI,蛋白C和蛋白S,滅活Fa、Fa激活纖溶系統(tǒng),血栓與止血檢測,（五）纖維蛋白溶解（纖溶）系統(tǒng)的作用,組織型纖溶酶原激活物（t-PA）,尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA),激活,纖溶酶原（PLG）,纖溶酶（PL）,抗纖纖溶酶（2-AP）,纖溶酶原激活抑抑制物PAI、PAI2,降解,降解,纖維蛋白原,纖維蛋白,凝血因子,降解為X、Y、D、E等碎片，生成D-D、r-r二聚體。上述碎片多聚體統(tǒng)稱為FDP,抗血小板聚集及抗血液凝固作用,二、凝血及纖溶實驗室檢測進展,血液凝固是一個復雜的生理生化代謝過程實質是通過一系列酶促反應，使血漿中呈液態(tài)的纖維蛋白原轉變成固態(tài)的纖維蛋白絲，因而凝血是屬于生理生物化學范疇的課題涉及血液學、分子生物學和免疫學等諸多領域由于這些相關學科研究的日益深入，不斷地給凝血的理論和實踐注入新的內容，因此，在測定方法學上也由過去精密度低的方法過渡到精密度高的方法。,凝血及纖溶檢測方法,凝血及纖溶檢測項目越來越多，目前應用的實驗大體分為：篩篩選試驗和確證試驗方法學上又可分為三大類：功能測定免疫學測定化學測定,功能測定,即傳統(tǒng)的最終以出現(xiàn)纖維蛋白作為判斷依據(jù)的方法如凝血酶原時間（PT）、活化的部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT），以及用各種缺乏因子血漿測定某一凝血因子含量的方法等,功能測定,PT測定是檢測凝血因子、的過篩試驗，要用統(tǒng)一標有國際敏感指數(shù)(ISI)的凝血活酶試劑，在抗凝治療監(jiān)控和決定用藥劑量時，一定要用國際標準化比率(INR)報告APTT是公認較好的檢測“內源性”凝血因子缺陷的過篩試驗，基本上可用于代替了過去的凝血時間測定，凝血時間的測定不管是玻片法還是試管法，都過于粗糙，敏感性太差。以前用于個別凝血因子缺乏的一些“糾正”試驗以及所謂的“凝血活酶生成”試驗，都因操作繁瑣，敏感性不高，已經淘汰,免疫學測定,是近年來發(fā)展最快的檢測方法，其原理是以純化的被檢物質為抗原，制備相應的抗體，然后用抗原抗體反應原理對被檢物質進行定性或定量測定其方法采用ELISA、膠乳微粒凝集、火箭電泳等方法。對許多新發(fā)現(xiàn)的抗凝因子，纖溶和纖溶抑制因子，纖維蛋白原裂解，纖維蛋白原和纖維蛋白降解產物，凝血酶原活化等過程中被切下的小肽，如我們目前開展的FDP、D-二聚體等的測定，基本上都用免疫學方法檢測,免疫學測定,從理論上講，免疫學測定不可能全部取代功能測定。因為免疫學測定的僅是該因子的抗原性，只能表明體內存在該因子，但卻不能說明其是否有生物活性，而功能測定則是測該因子在凝血或纖溶中的生理生化功能。,化學測定,理論根據(jù)是：許多凝血、抗凝及纖溶因子本身是水解酶，可以用人工合成含有該酶酶切位點并帶有色原（指示劑）的寡肽作為底物，用常規(guī)的生化比色法加以測定。國內外已有一些合成的底物用于測定，諸如AT、凝血酶、F、Fa，以及纖溶酶等等。,三、凝血及纖溶實驗質控,質量是醫(yī)學檢驗工作的生命線，是當今醫(yī)學檢驗工作中的關鍵問題凝血與纖溶檢驗質量，關鍵在于診斷試劑。以往，大量凝血檢測試劑由于各實驗室自行制備，手工操作難以達到規(guī)定的質量標準和全國、全球標準化，也難以達到室內、室間質控的要求為此WHO和血栓和止血委員會（ICTH）制定了一些標準或提供少數(shù)統(tǒng)一的標準品供各國校準各種試劑和方法。國內市場上能購到的商品試劑來源，國外主要有美國、法國；國內有天津、上海、北京、福建等。,凝血及纖溶實驗質控,我們臨床檢驗工作者都要從方法學與試劑的標準化等方面嚴把質量關，全面系統(tǒng)地掌握新的知識動態(tài)，進一步提高質量意識，使我國在凝血與纖溶測定總體水平上進一步提高，與國際接軌。,凝血及纖溶實驗質控,良好的檢測結果靠三方面來獲得:精確度儀器：靠保養(yǎng)、靠校準可靠的試劑：合格，優(yōu)質規(guī)范的操作：嚴格按SOP文件,凝血及纖溶實驗質控,重復性-靠什么來保證？1、儀器的重復性：包括儀器內部各個通道自身與各個通道之間的一致性2、試劑、消耗品的重復性只能在穩(wěn)定的儀器上獲得,凝血及纖溶實驗質控,準確性：是儀器、試劑、消耗品、操作人員的綜合體現(xiàn)包括：儀器的計算公式、標準曲線試劑的保存、制備、存放效期試劑污染來源的控制,質控不規(guī)范洗針問題,高濃度清洗液洗針腐蝕樣品針導致重復性下降次氯酸鈉殘留導致干擾結果低濃度清洗液洗針不能有效滅活凝血酶，造成交叉污染結果不準針容易堵塞、半堵塞造成樣本、試劑加樣不準,日常工作中應注意的問題,（一）血標本應注意的問題1.采血后標本在低溫保存時間范圍：有報道在32保存血漿6、12、24h因子活性可分別消失50%、60%、95%，即使保存在4也分別消失5%、55%、70%。V因子活性在32分別消失25%、40%、80%，而在4則僅損失0%、5%、10%。因此測定APTT的血漿在-80至少可保存1個月、4為6h、20為4h、而32僅為2h。測定PT的血漿，在4為24h、20為6h、32為2h。,日常工作中應注意的問題,2.血液與抗凝劑比例：國際血液學標準化委員會（ICSH）、國際血栓與止血委員會（ICTH）推薦使用3.2g/dl（含2H2O）或0.109mol/L的枸櫞鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑。血液與抗凝劑按9：1比例混合，實際上是指抗凝劑與正常紅細胞壓積血液之間的比例而言。因此應根據(jù)患者紅細胞比積（Hct）狀況隨時調整抗凝劑用量。,（二）實驗操作應注意的問題,許多試驗誤差都來源于技術的錯誤。在實驗技術、試劑、溫度及pH值上很微小的變化都會導致試驗結果明顯的變化離心因素。APTT、PT需乏血小板血漿，一般3000r/min離心10min后分離血漿。離心前注意標本量，離心后注意血漿的量（Hct）以保證抗凝劑與標本量最適比例試驗前檢查血漿是否有溶血、黃疸、脂血和出現(xiàn)凝塊。紅細胞膜含有磷脂，溶血標本具有與血小板第因子（磷脂）相似的凝血活性，這種磷脂能縮短溶血血漿的APTT值。標本中如果出現(xiàn)凝塊，無論凝塊多么小，均會影響試驗結果。,四、開展出凝血檢測的內容與臨床意義,意義：1出血性疾病進行診斷與分型(血友病，血小板病)2血栓性疾病的診斷與分型(易栓癥，高凝狀態(tài))3DIC診斷與分期，療效觀察4藥物治療監(jiān)測(抗凝、抗血小板、溶栓治療)5術前常規(guī)檢查,(一）凝血功能檢測,血漿凝血酶原時間測定(PT)活化部分凝血活酶時間測定(APTT)血漿纖維蛋白原測定(Fbg)凝血時間（CT）單因子抗原含量,血漿凝血酶原時間（PT）,血漿凝血酶原時間（PT）原理：該測定是在受檢血漿中加入鈣離子和組織因子后，觀察其凝固時間。本試驗是反映外源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況的篩選試驗。為外凝血途徑常用篩選試驗。正常參考范圍為11-13秒，超過3秒以上為異常PT延長先天性因子、缺乏癥，DIC，Vitk缺乏癥,肝臟疾病，抗凝劑使用后PT縮短高凝狀態(tài)，血栓性疾病。如DIC早期、心肌梗塞、腦血栓形成、多發(fā)性骨髓瘤。,INR值：國際標準化比率計算公式：INR=（測量PT/正常PT）ISI意義：它不但建立了測量值與正常人的對照，而且，排除了不同實驗室、不同試劑之間的差異，使它的值更具有臨床統(tǒng)一的意義。在口服抗凝劑的監(jiān)測中更有統(tǒng)一標準的臨床意義。,血栓與止血檢測,活化部分凝血活酶時間（APTT）,原理,參考值,該測定是在受檢血漿中加入APTT試劑（接觸因子激活劑和部分磷脂）和鈣離子后，觀察其凝固時間。本試驗是反映內源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況的篩選試驗。,手工法：2840秒，較正常對照值延長10秒以上為異常。,APTT,臨床應用：活化部分凝血活酶時間（APTT）是檢查內源性凝血因子的一種過篩試驗，是用來證實先天性或獲得性凝血因子、的缺陷或是否存在它們相應的抑制物，同時，APTT也可用來激肽釋放酶原(PK)和高分子量激肽釋放酶原(HMWK)是否缺乏，由于APTT的高度敏感性和肝素的作用途徑主要是內源性凝血途徑，所以APTT成為監(jiān)測普通肝素首選指標，前后之比1.5-2.5為佳。APTT縮短：DIC高凝期，血栓性疾病等。,E,XII,XI,Ca+,Ca+,Ca+,I,VII,II,X,V,IX,VIII,Ca+,纖維蛋白原（Fg）測定,正常凝血反應的最終結果為纖維蛋白原反應生成纖維蛋白，所以，纖維蛋白原的檢測也十分重要。參考值：2-4g/L增高見于糖尿病、急性心肌梗塞、急性感染、結締組織病、急性腎炎、燒傷、多發(fā)性骨髓瘤、休克、大手術、妊高癥、惡性腫瘤、血栓前狀態(tài)、放射治療.減低見于DIC、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎和肝硬化、先天性纖維蛋白原缺乏癥,（二）抗凝血功能檢測,1.凝血酶時檢查Fg有無異常間測定(TT)檢查循環(huán)血中有無抗凝物共同途徑異常標志2.抗凝血酶AT-活性增高出血AT-活性降低血栓形成3.血漿蛋白細胞抗原測定(PC)必須轉換成活化的蛋白細胞(APC)才發(fā)揮抗凝作用減低:見于先天或獲得性PC缺乏癥，后者鑒于DIC、肝病,血栓與止血檢測,血漿凝血酶時間,參考值,1618s，受檢TT值延長超過正常對照3s以上為延長,臨床意義,延長見于:低（無）纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥；血中FDP增高（如DIC）；血中有肝素或類肝素物質存在（如肝素治療中、SLE和肝臟疾病等。）縮短：高FIB血癥鈣離子存在時或標本有微小凝結塊及PH呈酸性,抗凝血酶-3（AT-）,AT-是一種單鏈糖蛋白，屬于2球蛋白，主要由肝臟合成。AT-是依賴肝素的絲氨酸蛋白酶抑制物，故肝素作用于AT-的賴氨酸殘基，可使AT-的抗凝血酶作用增強1000倍。AT-除對凝血酶有抑制作用外，對Xa、a、a、a、纖溶酶（血漿素），胰蛋白酶也有抑制作用，而且它對因子a的親和力大于凝血酶，所以對因子,抗凝血酶-3（AT-）,AT-活性增高：見于某些出血性疾病，如血友病、再生障礙性貧血、心瓣膜?。ㄐ牧λソ吒文[大者）AT-活性增高。腎臟疾病尿毒癥腎移植后12年內個別AT-活性不增高者可因肺栓塞而死亡。服肝素類抗凝藥物后，AT-的活性會增高，停藥后即可恢復正常AT-活性減低：見于彌漫性血管內凝血（DIC）、肝硬化、敗血癥、血栓形成性疾病（心肌梗塞，靜脈血栓形成等），先天性AT-缺陷，口服避孕藥.動態(tài)觀察血中AT-含量的變化對監(jiān)護治療效果及了解預后情況均是有力的依據(jù),（三）纖維蛋白溶解功能檢測,1.纖溶酶原測定(PLG)增高表示纖溶活性見于血栓前狀態(tài)和血栓降低表示纖溶活性見于原發(fā)繼發(fā)纖溶和PLG缺乏2.纖溶酶纖溶酶抑制物復合體(PIC)能較快地反映纖溶活性(PIC半衰期6h)，體內纖溶情況的指標3.血漿硫酸魚精蛋白副凝試驗(3p試驗)了解血中FDP.FM.尤其是X片段存在4.D二聚體測定(D-dimer)鑒別原發(fā)性、繼發(fā)性纖溶癥重要指標5.纖維蛋白(原)降解產物(FDP)纖溶亢進的標志,D-dimers檢測臨床應用,深靜脈血栓(DVT)和肺栓塞(PE)活動性深靜脈血栓形成肺栓塞時，血漿D-D顯著升高；而陳舊性靜脈血栓，D-D往往不增高；動脈血栓性疾病，如冠心病，動脈硬化等，D-D增高不如靜脈血栓顯著。排除肺栓塞（PE）D-D總體敏感性90-95%，特異性(45%68%),值得納入診斷標準。當D-D陰性,臨床上中低度可疑PE，并且V/Q造影不確定的患者，可不再進一步檢查。,D-dimers檢測臨床應用,彌散性血管內凝血(DIC)和凝血因子消耗繼發(fā)的纖溶(與膿血癥，腫瘤，燒傷，先兆子癇等相關）纖溶治療,D-dimers檢測臨床應用,D-二聚體不增高見于：原發(fā)性纖溶癥時，D-二聚體不增高，是與繼發(fā)性纖溶亢進的鑒別要點。陳舊性血栓形成時，D-二聚體不增高。短時間內的D-二聚體改變，常見于藥物應用后。,血栓與止血檢測,血漿纖維蛋白（原）降解產物測定,參考值,小于5mg/L,臨床意義,增高見于:原發(fā)性纖溶癥、DIC、惡性腫瘤、急性早幼粒細胞白血病、肺梗塞、DVT、肝臟疾病等。判定纖溶發(fā)展的階段監(jiān)測外科手術是否使器官陷于纖溶酶原活化的高風險狀態(tài),D-dimers與FDP聯(lián)合應用的意義,1）DIC的診斷：原發(fā)性纖溶亢進時，由于無血栓形成，F(xiàn)DP顯著升高，D-D一般不增高；繼發(fā)性纖溶亢進時，血漿D-D顯著升高，二者聯(lián)合檢測有利于提高DIC實驗室診斷的靈敏度和特異性，尤其對早期DIC的診斷更有意義2）溶栓治療的監(jiān)測：溶栓治療深靜脈血栓或急性腦梗后2天內D-dimers增高23倍，但FDP升高1013倍，以后逐漸下降；到7天時，D-D已低于溶栓前水平，但FDP仍比溶栓前高5倍。,（四）凝血和抗凝血功能篩選指標,1、凝血時間測定（CT）2、活化部分凝血活酶時間測定（APTT）3、血漿凝血酶原時間測定（PT）4、血漿纖維蛋白原測定(Fbg)5、復鈣交叉試驗（CRT)輕癥時過篩試驗可陰性,（五）纖溶活性檢查的篩選試驗,1、優(yōu)球蛋白溶解試驗（ELT)2、血漿凝血酶時間（TT)3、血漿硫酸魚精蛋白副凝集試驗（3P)4、血漿纖維蛋白（原）降解產物測定（FDP）5、D-二聚體檢測,血栓與止血檢測,血小板檢測,（一）血小板計數(shù)（PC或plt）,參考值,（100300）109/L,臨床意義,1。血小板減少：PC低于100109/L稱為血小板減少。常見于：,血小板生成障礙,血小板破壞或消耗過多,血小板分布異常,血栓與止血檢測,2。血小板增高：PLT高于400109/L稱為血小板增多。常見于：,原發(fā)