ELISA基礎(chǔ)知識及常見問題的處理.ppt

ELISA基礎(chǔ)知識及常見問題處理,北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司技術(shù)工程師崔偉,ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）,ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）是一種酶免疫測定。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體于固相或液相載體中反應(yīng)檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。通過辣根過氧化物酶（HRP)與底物液TBM的反應(yīng)指示出所檢測物質(zhì)的有無。1抗原：抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。2抗體：抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。,ELISA檢測方法,夾心法:雙抗原（抗體）夾心法是檢測抗原最常用的方法，其檢測方法：雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗原Ag*Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標(biāo)抗體Ab*Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)顯色,間接法間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。其檢測方法：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)二抗Ab*Ag-Ab-抗Ab*+底物(TMB)顯色,競爭法其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗體Ab*Ag-Ab+底物(TMB)不顯色(+)固相(包被)抗原Ag+樣品(無抗體Ab)+酶標(biāo)抗體Ab*Ag-Ab*+底物(TMB)顯色(-),診斷試劑所用的質(zhì)量指標(biāo)及相互關(guān)系：,靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。相對靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）100%測定方法及表示方法：靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、陽性標(biāo)本稀釋終點、血清盤（pannel）及臨床標(biāo)本陽性率。靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，質(zhì)控血清可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，也可以自己配制。因為質(zhì)控血清不一定是原倍血清，或由于片段、亞型、位點等原因，評定試劑盒的靈敏度都帶有一定的片面性。陽性標(biāo)本稀釋終點的方法常用于不同試劑盒的比較，但也有上述的片面性。陽性pannel有些可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，如HBsAg陽性pannel，也可以自己配制。臨床標(biāo)本陽性率，是一種粗略的估計，但對臨床很實用。,特異性：真陰性標(biāo)本的檢出能力。相對特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）100%測定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤、臨床標(biāo)本陰性率。質(zhì)控血清、血清盤可以從衛(wèi)生部臨檢中心購買，也可以自己配制。自己配制時注意陰性標(biāo)本的在血清盤中的比例以及代表性。臨床標(biāo)本陰性百分率是臨床使用中對試劑盒特異性的粗略的判斷。如果數(shù)批產(chǎn)品都通過了特異性參比測定，是否產(chǎn)品的特異性就一樣了呢？不一定。因為特異性參比品的數(shù)量不可能很大（樣本與整體的差異），引起非特異性的因素很多，目前尚不完全清楚。質(zhì)控血清盤也存在同樣的問題。,有關(guān)名詞簡介,質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對實驗結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購置也可以自配。自己配制時要注意選用無脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽性對照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標(biāo)本不一致，應(yīng)該注意對結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動，不可用于標(biāo)定儀器或評價方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質(zhì)控品。,室內(nèi)質(zhì)控：實驗室內(nèi)部使用控制實驗結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。室間質(zhì)評：用于考核各個實驗室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國家級和地方級的室間質(zhì)評。可以理解為“各個實驗室的質(zhì)量評比”。,臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法確定的。許多試劑都會給出臨界值或臨界值的計算方法。本底：就是底色。如ELISAHBsAg，陽性顯色，陰性不顯色，本底就是整個陰性顯色的情況。ELISA抗HBcAb，陽性不顯色，陰性顯色，本底就是整個陽性顯色的情況。,陰性對照及陽性對照：陰、陽性對照若有正確的結(jié)果，對試劑盒操作的結(jié)果可以有粗略的判斷?？瞻讓φ眨簩LISA試劑來說，空白對照實際上是不加標(biāo)本不加酶做對照?？瞻讓φ罩饕獪y系統(tǒng)的吸光率?？瞻讓φ赵趩尾ㄩL測量時顯得尤其重要。,ELISA試劑常見問題及解答,ELISA試劑的原理基礎(chǔ)為抗原抗體免疫反應(yīng)，在生產(chǎn)、儲存、運(yùn)輸、使用等各環(huán)節(jié)中，對其質(zhì)量特性產(chǎn)生影響的因素眾多。此外，其顯色系統(tǒng)中的過氧化物酶在生物樣品中普遍存在，故在客戶使用過程中經(jīng)常會產(chǎn)生某種非期望的結(jié)