2 O2 處理大塊牛松質(zhì)骨后成分分析.doc

2O2處理大塊牛松質(zhì)骨后成分分析作者：羅卓荊胡蘊(yùn)玉劉智廣【關(guān)鍵詞】骨移植關(guān)鍵詞:骨移植；氨基酸分析；移植，異種摘要:目的研究大塊牛松質(zhì)骨（MBCB）處理后的各種成分及高濃度H2O2消除異種骨抗原性的機(jī)制.方法采用干燥失重法及殘渣法檢測經(jīng)過系統(tǒng)去抗原處理后的大塊異種骨的有機(jī)、無機(jī)質(zhì)及水份含量；將25塊大塊新鮮牛松質(zhì)骨均分為5組，分別用高濃度H2O2浸泡0，24，48，72和96h，采用氨基酸分析方法研究不同H2O2處理時間的骨塊中羥脯氨酸、脯氨酸含量.結(jié)果經(jīng)處理后，MBCB為色白，并呈現(xiàn)出多孔樣結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀察，松質(zhì)骨呈清晰的多孔結(jié)構(gòu)，孔壁光滑；5組檢測樣品中羥脯氨酸及脯氨酸的含量隨著H2O2處理時間的延長均有同步下降的趨勢，但各組間無顯著性差異（P>；0.05）；5組檢測樣品中18種氨基酸含量及氨基酸總量隨著H2O2處理時間的延長亦有同步下降的趨勢，僅0h與96h組間18種氨基酸以及總氨基酸含量有顯著性差異（P<；0.05），其余各組間無顯著性差異（P>；0.05）；5組檢測樣品中羥脯氨酸及脯氨酸在總氨基酸總量所占比例隨著H2O2處理時間的延長無明顯變化，各組間無顯著性差異（P>；0.05）.結(jié)論大塊異種骨經(jīng)系統(tǒng)去抗原處理后，保持了一定的有機(jī)及無機(jī)質(zhì)比例，既具有良好的力學(xué)特性又消除了其抗原性，提示高氧化劑引起蛋白質(zhì)變性是消除大塊異種骨抗原性的主要原因.Keywords:bonetransplantation；aminoacidanalysis；com-ponent，heterologousAbstract:AIMToanalysethecomponentsofantigen-elimi-natedmassivebovinecancellousbone（MBCB）andtostudythemechanismofhighconcnH2O2eliminatingtheantigenici-tyofxenogenicbone.METHODSDry-weightlostmethodwasappliedtomeasuretheorganic，mineral，andwatercom-ponentsinMBCB；25massivefleshbovinecancellousboneblocksweredistributedinto5groups，whichweredippedin300mL・；L-1concnH2O2for0，24，48，72，96h.Thequan-titiesofhydroxyprolineandprolineinthefivegroupsweremeasuredbyaminoacidanalysis.RESULTSAftertheanti-geneliminatingprogram，MBCBoccurredaswhitecolourandporousstructure.SEMshowedthewallofbonetrabeculainthecenterpartofMBCBwasquiteclear.ThequantitiesofhydroxyprolineandprolinedecreasedalittlewiththetimetreatedinhighconcnH2O2inthefivegroups，butnodiffer-encesbetweenthefivegroupswerefound；thesamedecreas-ingtendencywasfoundtothequantitiesof18aminoacidsoftheboneblocksinthefivegroups；differencewasonlyfoundbetween0hand96hgroup（P<；0.05）.Thepercentofhy-droxyprolineandprolineinaminoacidswasnotfoundanydifferenceinthefivegroups（P>；0.05）.CONCLUSIONTheMBCBmaycontainreasonablerateoforganicandminer-almaterial，whichisbeneficialtokeepingthemechanicprop-ertyofMBCBafteritsantigen-eliminatingprogram.Denatu-ralizationofproteinintheconditionofoxidationofhighcon-cnH2O2wouldbethemajormechanismtoeliminatetheanti-genicityofmassivexenogenicbone.0引言在以往顆粒型異種松質(zhì)骨處理與應(yīng)用的基礎(chǔ)上1，為了更廣泛地應(yīng)用大塊異種骨修復(fù)四肢大節(jié)段骨缺損，我們對高濃度H2O2去抗原處理異種骨的機(jī)制進(jìn)行研究，同時對異種骨經(jīng)去抗原處理后的成分進(jìn)行分析，為異種骨塊的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料新鮮牛肱骨上端松質(zhì)骨.1.2方法大塊去抗原牛松質(zhì)骨（antigen-extractedmassivebovinecancellousbone，MBCB）選取新鮮牛肱骨上端松質(zhì)骨，截取15mm20mm30mm形狀規(guī)則長方體骨塊，用50壓力水反復(fù)沖洗，瀝干；50下11氯仿甲醇脫脂24h；50下300mL・；L-1H2O2浸泡24h；重復(fù)步驟2次，脫脂共24h3，H2O2處理24h3；雙蒸水透析12h2；0.3mol・；L-1的HCl內(nèi)脫鈣處理5min，雙蒸水反復(fù)沖洗至pH6.0；冷凍干燥，密封包裝.1.2.1MBCB的掃描電鏡SEM觀察4mm大小的電鏡樣品分別取材于新鮮牛松質(zhì)骨及MBCB，多聚甲醛固定，鋨酸及乙晴處理，真空鍍膜，掃描電鏡觀察.1.2.2MBCB的成分檢測參照中華人民共和國藥典1995版，干燥失重法及殘渣法.檢測步驟:取相同小坩鍋4個，置80烘烤24h，蒸發(fā)坩鍋內(nèi)水分；選取密封的MBCB凍干骨4塊，編號A，B，C，D，分別準(zhǔn)確稱質(zhì)量（m），再分別放入坩鍋內(nèi)稱質(zhì)量（m1）；將MBCB及坩鍋同置于110烘烤24h，干燥塔內(nèi)涼至室溫后稱質(zhì)量（m2）；將塊型牛松質(zhì)骨載體及坩鍋再置于馬佛電阻爐內(nèi)，800灼熾7h，干燥塔內(nèi)涼至室溫后準(zhǔn)確稱質(zhì)量（m3）；計算方法含水量mwater=m1-m2，含有機(jī)質(zhì)morganic=m2-m3，含無機(jī)質(zhì)mmineral=m3-（m1-m）.1.2.3MBCB的氨基酸分析將25塊新鮮牛肱骨松質(zhì)骨塊經(jīng)水洗、脫脂后分為5組，各組5枚骨塊，分別置于50300mL・；L-1H2O2溶液中0，24，48，72和96h進(jìn)行浸泡處理，將處理后的異種骨塊進(jìn)行氨基酸檢測分析.將上述各組樣品均置于80下烘干24h，在干燥室內(nèi)冷卻至室溫后準(zhǔn)確稱取20mg，放于消化管中；加入6mol・；L-1HCl共3mL，立即旋緊管蓋，置110下酸水解22h；將酸水解液倒入蝶型坩鍋內(nèi)，于100水浴揮發(fā)鹽酸，再加入少量蒸溜水，蒸干共3次；用適量pH2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，使其終濃度為干骨樣品20g・；L-1；12589g離心15min，取上清液備用，做羥脯氨酸、脯氨酸及氨基酸總量定量分析.羥脯氨酸、脯氨酸測定:Beckman121MB型氨基酸分析儀，分析程序?yàn)樽跃幠z原特異性氨基酸分析程序2；填充樹脂為BeckmanAA10型，柱床10cm，pH2.20，配制pH3.0檸檬酸鈉緩沖液和茚三酮試劑3，600mol・；L-1羥脯氨酸、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（上海華美生物工程公司）用pH2.20緩沖液配制；柱溫46恒溫；上樣量50L；緩沖液流速10mL・；h-1，茚三酮流速5mL・；h-1；檢測波長440nm，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為HP-3394A積分儀.骨樣品中羥脯氨酸、脯氨酸含量用下式計算1，4Cs=S樣品氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度樣品稀釋倍數(shù)氨基酸分子質(zhì)量S標(biāo)準(zhǔn)1000Cs干骨羥脯氨酸或脯氨酸含量（mg・；g樣品標(biāo)準(zhǔn)液中羥脯氨酸或脯氨酸波峰面積；S標(biāo)準(zhǔn)樣品液中羥脯氨酸或脯氨酸波峰面積.采用方差分析方法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，比較H2O2不同浸泡處理時間的各組中羥脯氨酸、脯氨酸含量.氨基酸總量的測定:紫外/可見光分光光度計（BeckmanDU-60），氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（Beckman公司，內(nèi)含18種氨基酸，每種氨基酸濃度為100mol・；L-1，氨基酸終濃度1800mol・；L-1），分別準(zhǔn)確吸取各組骨水解液10L、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液20L、空白對照之雙蒸水20L，用雙蒸水補(bǔ)足定容至2mL，加入茚三酮試劑2mL，置100水浴5min，流水冷卻至室溫，測吸光度，檢測波長為570nm.在波長570nm條件下，骨樣品中羥脯氨酸及脯氨酸吸光度極低，故骨樣品中總氨基酸含量Cs總由18種氨基酸含量Cs18加上由440nm檢測的羥脯氨酸Cs羥脯及脯氨酸Cs脯含量組成.Cs18用以下公式計算Cs18=A樣品18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度稀釋倍數(shù)18種氨基酸平均分子質(zhì)量A標(biāo)準(zhǔn)Cs18骨樣品中18種氨基酸含量（mg・；g-1）；A樣品樣品液中吸光度；A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)液中吸光度.氨基酸總量Cs總=Cs18+Cs羥脯+Cs脯2結(jié)果2.1MBCB的大體及SEM觀察MBCB經(jīng)系列化學(xué)處理后，色白，并呈現(xiàn)出多孔樣結(jié)構(gòu)，具有一定的韌性及堅硬度.新鮮牛松質(zhì)骨掃描電鏡觀察，未顯示出多孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙被骨髓及油脂等充滿；MBCB掃描電鏡觀察，松質(zhì)骨呈清晰的多孔結(jié)構(gòu)，孔壁光滑（Fig1（略）.2.2MBCB成分檢測結(jié)果MBCB中水分、無機(jī)質(zhì)、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見Tab1.w（水）=m水m=65.61392.0100%=4.7%；w（有機(jī)質(zhì)）=m有m=666.71392.0100%=47.9%；w（無機(jī)質(zhì)）=m無m=659.71392.0100%=47.4%.表1MBCB中水分、無機(jī)質(zhì)、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（略）2.3H2O2處理異種骨的氨基酸分析5組檢測樣品中羥脯氨酸及脯氨酸的含量隨著H2O2處理時間延長均有同步下降的趨勢，但變化程度并不明顯，各組間無顯著性差異（P>；0.05，Tab2）.骨樣品中18種氨基酸及總氨基酸含量隨著H2O2處理時間的延長均有同步下降趨勢，但變化并不明顯，僅0h與96h組間18種氨基酸以及總氨基酸含量有顯著性差異（P<；0.05，Tab3），其余各組間無顯著性差異（P>；0.05）.5組檢測樣品中羥脯氨酸及脯氨酸在總氨基酸總量中所占比例隨著H2O2處理時間的延長無明顯變化，各組間無顯著性差異（P>；0.05，Tab4）.表2骨樣品中羥脯氨酸、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（略）表3骨樣品中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)表4氨基酸中羥脯氨酸、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（略）3討論松質(zhì)骨由骨小梁及骨小梁間的骨髓成分構(gòu)成，骨髓內(nèi)包含大量的各種血細(xì)胞以及血管、神經(jīng)、脂肪等組織，骨髓將骨小梁間隙填充，在掃描電鏡下未能見到松質(zhì)骨的多孔樣結(jié)構(gòu).異種骨抗原分布研究資料表明，骨中的主要抗原成分集中于骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞、血漿等5.在本實(shí)驗(yàn)中，反復(fù)采用50壓力水沖洗，使松質(zhì)骨中細(xì)胞低滲裂解，氯仿甲醇脫脂清除骨小梁間的大量脂肪組織，以高濃度H2O2浸泡處理，二者交替進(jìn)行，結(jié)合離心處理，將牛松質(zhì)骨內(nèi)的脂肪、細(xì)胞及殘片均有效清除.處理后的牛松質(zhì)骨在SEM觀察下顯示清晰的多孔結(jié)構(gòu)，孔壁干凈、光滑，未見其他物質(zhì)殘留，徹底清除異種骨中的主要抗原物質(zhì)，為骨生長因子的復(fù)合及新骨的長入提供理想的微環(huán)境4.正常成熟骨中含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%25%、有機(jī)質(zhì)40%和無機(jī)鹽60%，無機(jī)鹽決定骨的強(qiáng)度，而有機(jī)質(zhì)決定骨的彈性和韌性.本實(shí)驗(yàn)中凍干MBCB的成分檢測結(jié)果表明，MBCB的水分殘留質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%，而膠原等有機(jī)質(zhì)和無機(jī)骨礦各占47%左右，由于保持了合理的有機(jī)及無機(jī)質(zhì)比例，故也保持MBCB一定的韌性和強(qiáng)度6.成熟骨的有機(jī)質(zhì)中大約90%為膠原，其余為氨基多糖、其他蛋白質(zhì)、肽類及脂類.骨基質(zhì)中的膠原主要是型膠原，由兩條1肽鏈和一條2肽鏈相互擰成的三聯(lián)螺旋結(jié)構(gòu).肽鏈組成有以下兩個主要特點(diǎn)肽鏈的氨基酸排列順序中，每隔兩個其他氨基酸殘基就有一個甘氨酸；肽鏈中含有其他蛋白質(zhì)中含量極少的羥脯氨酸與羥賴氨酸，脯氨酸及賴氨酸的含量也較多，羥脯氨酸與脯氨酸殘基是維持原膠原分子三聯(lián)螺旋構(gòu)型的重要組成部分.在型膠原肽鏈的1000個氨基酸殘基中，甘氨酸約占330個，脯氨酸約占129個，羥脯氨酸約占96個，賴氨酸約占30個，羥賴氨酸約占4個.不同組織中的膠原所含羥脯氨酸及羥賴氨酸殘基差很大，因此，檢測骨基質(zhì)中羥脯氨酸及脯氨酸含量，可特異地反應(yīng)骨基質(zhì)有機(jī)質(zhì)中包括膠原蛋白在內(nèi)的各種組成成分的變化.以往認(rèn)為，高濃度H2O2處理異種骨，其消除抗原性的原理在于清除骨基質(zhì)中抗原性較強(qiáng)的蛋白成分，即脫蛋白過程.我們發(fā)現(xiàn)，骨基質(zhì)中的氨基酸總量隨著H2O2處理的時間延長并無明顯的降低，而羥脯氨酸及脯氨酸在氨基酸總量中所占比例也未發(fā)生明顯改變，沒有表現(xiàn)出大量去除蛋白的現(xiàn)象.回顧以往的研究結(jié)果，牛松質(zhì)骨在H2O2浸漬時間越長，骨塊機(jī)械強(qiáng)度損失越嚴(yán)重6，以及H2O2處理時間越長，異種骨抗原性消除越徹底7，分析H2O2消除異種骨抗原性的機(jī)制可能在于強(qiáng)氧化