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2O2處理大塊牛松質(zhì)骨后成分分析作者:羅卓荊胡蘊(yùn)玉劉智廣【關(guān)鍵詞】骨移植關(guān)鍵詞:骨移植;氨基酸分析;移植,異種摘要:目的研究大塊牛松質(zhì)骨(MBCB)處理后的各種成分及高濃度H2O2消除異種骨抗原性的機(jī)制.方法采用干燥失重法及殘?jiān)z測(cè)經(jīng)過(guò)系統(tǒng)去抗原處理后的大塊異種骨的有機(jī)、無(wú)機(jī)質(zhì)及水份含量;將25塊大塊新鮮牛松質(zhì)骨均分為5組,分別用高濃度H2O2浸泡0,24,48,72和96h,采用氨基酸分析方法研究不同H2O2處理時(shí)間的骨塊中羥脯氨酸、脯氨酸含量.結(jié)果經(jīng)處理后,MBCB為色白,并呈現(xiàn)出多孔樣結(jié)構(gòu),掃描電鏡觀察,松質(zhì)骨呈清晰的多孔結(jié)構(gòu),孔壁光滑;5組檢測(cè)樣品中羥脯氨酸及脯氨酸的含量隨著H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)均有同步下降的趨勢(shì),但各組間無(wú)顯著性差異(P>;0.05);5組檢測(cè)樣品中18種氨基酸含量及氨基酸總量隨著H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)亦有同步下降的趨勢(shì),僅0h與96h組間18種氨基酸以及總氨基酸含量有顯著性差異(P<;0.05),其余各組間無(wú)顯著性差異(P>;0.05);5組檢測(cè)樣品中羥脯氨酸及脯氨酸在總氨基酸總量所占比例隨著H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化,各組間無(wú)顯著性差異(P>;0.05).結(jié)論大塊異種骨經(jīng)系統(tǒng)去抗原處理后,保持了一定的有機(jī)及無(wú)機(jī)質(zhì)比例,既具有良好的力學(xué)特性又消除了其抗原性,提示高氧化劑引起蛋白質(zhì)變性是消除大塊異種骨抗原性的主要原因.Keywords:bonetransplantation;aminoacidanalysis;com-ponent,heterologousAbstract:AIMToanalysethecomponentsofantigen-elimi-natedmassivebovinecancellousbone(MBCB)andtostudythemechanismofhighconcnH2O2eliminatingtheantigenici-tyofxenogenicbone.METHODSDry-weightlostmethodwasappliedtomeasuretheorganic,mineral,andwatercom-ponentsinMBCB;25massivefleshbovinecancellousboneblocksweredistributedinto5groups,whichweredippedin300mL・;L-1concnH2O2for0,24,48,72,96h.Thequan-titiesofhydroxyprolineandprolineinthefivegroupsweremeasuredbyaminoacidanalysis.RESULTSAftertheanti-geneliminatingprogram,MBCBoccurredaswhitecolourandporousstructure.SEMshowedthewallofbonetrabeculainthecenterpartofMBCBwasquiteclear.ThequantitiesofhydroxyprolineandprolinedecreasedalittlewiththetimetreatedinhighconcnH2O2inthefivegroups,butnodiffer-encesbetweenthefivegroupswerefound;thesamedecreas-ingtendencywasfoundtothequantitiesof18aminoacidsoftheboneblocksinthefivegroups;differencewasonlyfoundbetween0hand96hgroup(P<;0.05).Thepercentofhy-droxyprolineandprolineinaminoacidswasnotfoundanydifferenceinthefivegroups(P>;0.05).CONCLUSIONTheMBCBmaycontainreasonablerateoforganicandminer-almaterial,whichisbeneficialtokeepingthemechanicprop-ertyofMBCBafteritsantigen-eliminatingprogram.Denatu-ralizationofproteinintheconditionofoxidationofhighcon-cnH2O2wouldbethemajormechanismtoeliminatetheanti-genicityofmassivexenogenicbone.0引言在以往顆粒型異種松質(zhì)骨處理與應(yīng)用的基礎(chǔ)上1,為了更廣泛地應(yīng)用大塊異種骨修復(fù)四肢大節(jié)段骨缺損,我們對(duì)高濃度H2O2去抗原處理異種骨的機(jī)制進(jìn)行研究,同時(shí)對(duì)異種骨經(jīng)去抗原處理后的成分進(jìn)行分析,為異種骨塊的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料新鮮牛肱骨上端松質(zhì)骨.1.2方法大塊去抗原牛松質(zhì)骨(antigen-extractedmassivebovinecancellousbone,MBCB)選取新鮮牛肱骨上端松質(zhì)骨,截取15mm20mm30mm形狀規(guī)則長(zhǎng)方體骨塊,用50壓力水反復(fù)沖洗,瀝干;50下11氯仿甲醇脫脂24h;50下300mL・;L-1H2O2浸泡24h;重復(fù)步驟2次,脫脂共24h3,H2O2處理24h3;雙蒸水透析12h2;0.3mol・;L-1的HCl內(nèi)脫鈣處理5min,雙蒸水反復(fù)沖洗至pH6.0;冷凍干燥,密封包裝.1.2.1MBCB的掃描電鏡SEM觀察4mm大小的電鏡樣品分別取材于新鮮牛松質(zhì)骨及MBCB,多聚甲醛固定,鋨酸及乙晴處理,真空鍍膜,掃描電鏡觀察.1.2.2MBCB的成分檢測(cè)參照中華人民共和國(guó)藥典1995版,干燥失重法及殘?jiān)?檢測(cè)步驟:取相同小坩鍋4個(gè),置80烘烤24h,蒸發(fā)坩鍋內(nèi)水分;選取密封的MBCB凍干骨4塊,編號(hào)A,B,C,D,分別準(zhǔn)確稱質(zhì)量(m),再分別放入坩鍋內(nèi)稱質(zhì)量(m1);將MBCB及坩鍋同置于110烘烤24h,干燥塔內(nèi)涼至室溫后稱質(zhì)量(m2);將塊型牛松質(zhì)骨載體及坩鍋再置于馬佛電阻爐內(nèi),800灼熾7h,干燥塔內(nèi)涼至室溫后準(zhǔn)確稱質(zhì)量(m3);計(jì)算方法含水量mwater=m1-m2,含有機(jī)質(zhì)morganic=m2-m3,含無(wú)機(jī)質(zhì)mmineral=m3-(m1-m).1.2.3MBCB的氨基酸分析將25塊新鮮牛肱骨松質(zhì)骨塊經(jīng)水洗、脫脂后分為5組,各組5枚骨塊,分別置于50300mL・;L-1H2O2溶液中0,24,48,72和96h進(jìn)行浸泡處理,將處理后的異種骨塊進(jìn)行氨基酸檢測(cè)分析.將上述各組樣品均置于80下烘干24h,在干燥室內(nèi)冷卻至室溫后準(zhǔn)確稱取20mg,放于消化管中;加入6mol・;L-1HCl共3mL,立即旋緊管蓋,置110下酸水解22h;將酸水解液倒入蝶型坩鍋內(nèi),于100水浴揮發(fā)鹽酸,再加入少量蒸溜水,蒸干共3次;用適量pH2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解,使其終濃度為干骨樣品20g・;L-1;12589g離心15min,取上清液備用,做羥脯氨酸、脯氨酸及氨基酸總量定量分析.羥脯氨酸、脯氨酸測(cè)定:Beckman121MB型氨基酸分析儀,分析程序?yàn)樽跃幠z原特異性氨基酸分析程序2;填充樹(shù)脂為BeckmanAA10型,柱床10cm,pH2.20,配制pH3.0檸檬酸鈉緩沖液和茚三酮試劑3,600mol・;L-1羥脯氨酸、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(上海華美生物工程公司)用pH2.20緩沖液配制;柱溫46恒溫;上樣量50L;緩沖液流速10mL・;h-1,茚三酮流速5mL・;h-1;檢測(cè)波長(zhǎng)440nm,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為HP-3394A積分儀.骨樣品中羥脯氨酸、脯氨酸含量用下式計(jì)算1,4Cs=S樣品氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度樣品稀釋倍數(shù)氨基酸分子質(zhì)量S標(biāo)準(zhǔn)1000Cs干骨羥脯氨酸或脯氨酸含量(mg・;g樣品標(biāo)準(zhǔn)液中羥脯氨酸或脯氨酸波峰面積;S標(biāo)準(zhǔn)樣品液中羥脯氨酸或脯氨酸波峰面積.采用方差分析方法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),比較H2O2不同浸泡處理時(shí)間的各組中羥脯氨酸、脯氨酸含量.氨基酸總量的測(cè)定:紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(BeckmanDU-60),氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(Beckman公司,內(nèi)含18種氨基酸,每種氨基酸濃度為100mol・;L-1,氨基酸終濃度1800mol・;L-1),分別準(zhǔn)確吸取各組骨水解液10L、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液20L、空白對(duì)照之雙蒸水20L,用雙蒸水補(bǔ)足定容至2mL,加入茚三酮試劑2mL,置100水浴5min,流水冷卻至室溫,測(cè)吸光度,檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm.在波長(zhǎng)570nm條件下,骨樣品中羥脯氨酸及脯氨酸吸光度極低,故骨樣品中總氨基酸含量Cs總由18種氨基酸含量Cs18加上由440nm檢測(cè)的羥脯氨酸Cs羥脯及脯氨酸Cs脯含量組成.Cs18用以下公式計(jì)算Cs18=A樣品18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度稀釋倍數(shù)18種氨基酸平均分子質(zhì)量A標(biāo)準(zhǔn)Cs18骨樣品中18種氨基酸含量(mg・;g-1);A樣品樣品液中吸光度;A標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)液中吸光度.氨基酸總量Cs總=Cs18+Cs羥脯+Cs脯2結(jié)果2.1MBCB的大體及SEM觀察MBCB經(jīng)系列化學(xué)處理后,色白,并呈現(xiàn)出多孔樣結(jié)構(gòu),具有一定的韌性及堅(jiān)硬度.新鮮牛松質(zhì)骨掃描電鏡觀察,未顯示出多孔隙結(jié)構(gòu),孔隙被骨髓及油脂等充滿;MBCB掃描電鏡觀察,松質(zhì)骨呈清晰的多孔結(jié)構(gòu),孔壁光滑(Fig1(略).2.2MBCB成分檢測(cè)結(jié)果MBCB中水分、無(wú)機(jī)質(zhì)、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)Tab1.w(水)=m水m=65.61392.0100%=4.7%;w(有機(jī)質(zhì))=m有m=666.71392.0100%=47.9%;w(無(wú)機(jī)質(zhì))=m無(wú)m=659.71392.0100%=47.4%.表1MBCB中水分、無(wú)機(jī)質(zhì)、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(略)2.3H2O2處理異種骨的氨基酸分析5組檢測(cè)樣品中羥脯氨酸及脯氨酸的含量隨著H2O2處理時(shí)間延長(zhǎng)均有同步下降的趨勢(shì),但變化程度并不明顯,各組間無(wú)顯著性差異(P>;0.05,Tab2).骨樣品中18種氨基酸及總氨基酸含量隨著H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)均有同步下降趨勢(shì),但變化并不明顯,僅0h與96h組間18種氨基酸以及總氨基酸含量有顯著性差異(P<;0.05,Tab3),其余各組間無(wú)顯著性差異(P>;0.05).5組檢測(cè)樣品中羥脯氨酸及脯氨酸在總氨基酸總量中所占比例隨著H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化,各組間無(wú)顯著性差異(P>;0.05,Tab4).表2骨樣品中羥脯氨酸、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(略)表3骨樣品中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)表4氨基酸中羥脯氨酸、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(略)3討論松質(zhì)骨由骨小梁及骨小梁間的骨髓成分構(gòu)成,骨髓內(nèi)包含大量的各種血細(xì)胞以及血管、神經(jīng)、脂肪等組織,骨髓將骨小梁間隙填充,在掃描電鏡下未能見(jiàn)到松質(zhì)骨的多孔樣結(jié)構(gòu).異種骨抗原分布研究資料表明,骨中的主要抗原成分集中于骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞、血漿等5.在本實(shí)驗(yàn)中,反復(fù)采用50壓力水沖洗,使松質(zhì)骨中細(xì)胞低滲裂解,氯仿甲醇脫脂清除骨小梁間的大量脂肪組織,以高濃度H2O2浸泡處理,二者交替進(jìn)行,結(jié)合離心處理,將牛松質(zhì)骨內(nèi)的脂肪、細(xì)胞及殘片均有效清除.處理后的牛松質(zhì)骨在SEM觀察下顯示清晰的多孔結(jié)構(gòu),孔壁干凈、光滑,未見(jiàn)其他物質(zhì)殘留,徹底清除異種骨中的主要抗原物質(zhì),為骨生長(zhǎng)因子的復(fù)合及新骨的長(zhǎng)入提供理想的微環(huán)境4.正常成熟骨中含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%25%、有機(jī)質(zhì)40%和無(wú)機(jī)鹽60%,無(wú)機(jī)鹽決定骨的強(qiáng)度,而有機(jī)質(zhì)決定骨的彈性和韌性.本實(shí)驗(yàn)中凍干MBCB的成分檢測(cè)結(jié)果表明,MBCB的水分殘留質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%,而膠原等有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)骨礦各占47%左右,由于保持了合理的有機(jī)及無(wú)機(jī)質(zhì)比例,故也保持MBCB一定的韌性和強(qiáng)度6.成熟骨的有機(jī)質(zhì)中大約90%為膠原,其余為氨基多糖、其他蛋白質(zhì)、肽類及脂類.骨基質(zhì)中的膠原主要是型膠原,由兩條1肽鏈和一條2肽鏈相互擰成的三聯(lián)螺旋結(jié)構(gòu).肽鏈組成有以下兩個(gè)主要特點(diǎn)肽鏈的氨基酸排列順序中,每隔兩個(gè)其他氨基酸殘基就有一個(gè)甘氨酸;肽鏈中含有其他蛋白質(zhì)中含量極少的羥脯氨酸與羥賴氨酸,脯氨酸及賴氨酸的含量也較多,羥脯氨酸與脯氨酸殘基是維持原膠原分子三聯(lián)螺旋構(gòu)型的重要組成部分.在型膠原肽鏈的1000個(gè)氨基酸殘基中,甘氨酸約占330個(gè),脯氨酸約占129個(gè),羥脯氨酸約占96個(gè),賴氨酸約占30個(gè),羥賴氨酸約占4個(gè).不同組織中的膠原所含羥脯氨酸及羥賴氨酸殘基差很大,因此,檢測(cè)骨基質(zhì)中羥脯氨酸及脯氨酸含量,可特異地反應(yīng)骨基質(zhì)有機(jī)質(zhì)中包括膠原蛋白在內(nèi)的各種組成成分的變化.以往認(rèn)為,高濃度H2O2處理異種骨,其消除抗原性的原理在于清除骨基質(zhì)中抗原性較強(qiáng)的蛋白成分,即脫蛋白過(guò)程.我們發(fā)現(xiàn),骨基質(zhì)中的氨基酸總量隨著H2O2處理的時(shí)間延長(zhǎng)并無(wú)明顯的降低,而羥脯氨酸及脯氨酸在氨基酸總量中所占比例也未發(fā)生明顯改變,沒(méi)有表現(xiàn)出大量去除蛋白的現(xiàn)象.回顧以往的研究結(jié)果,牛松質(zhì)骨在H2O2浸漬時(shí)間越長(zhǎng),骨塊機(jī)械強(qiáng)度損失越嚴(yán)重6,以及H2O2處理時(shí)間越長(zhǎng),異種骨抗原性消除越徹底7,分析H2O2消除異種骨抗原性的機(jī)制可能在于強(qiáng)氧化
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