課件：基因治療現(xiàn)狀研究生.ppt

基因治療,Gene Therapy,第一節(jié) 基因治療概念,經(jīng)典的基因治療：指正常的基因整合入細(xì)胞基因組以校正或置換致病基因的一種治療方法。 廣義的基因治療：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。 目前基因治療：凡是采用分子生物學(xué)的方法和原理，在核酸水平上開展的疾病治療方法都可以稱為基因治療。,基因治療分類,體細(xì)胞(somatic cell)基因治療 生殖細(xì)胞(germline)基因治療,只限于某一體細(xì)胞的基因的改變 只限于某個體的當(dāng)代 對缺陷的生殖細(xì)胞進行矯正 當(dāng)代及子代,1973年第一例人體實驗 1978年第二例基因治療實驗 基因治療動物實驗廣泛開展 Dr. Anderson（1980） 首先闡明基因治療前景和發(fā)展方向 Rosenberg （1990） 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)肽[瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL），并將TIF輸回體內(nèi)，TIF集中在腫瘤部位， 表達(dá)neoR。,1990年9月14日：第一例正式批準(zhǔn)的基因治療實驗開始進行 （美國，世界上開展基因治療最早的國家） 大規(guī)模進行基因治療臨床實驗必須經(jīng)歷以下階段： 體外試驗和動物試驗 I期臨床試驗6-10名志愿者 II期臨床試驗20-30名志愿者 III期臨床試驗充分分析療效、安全性 中國 1991年7月開始進行基因治療試驗,基因治療的策略,The Strategy of Gene Therapy,基因治療的策略大致可分為以下幾種,基因置換 gene replacement 基因修復(fù) gene correction 基因修飾 gene augmentation 基因干預(yù) gene inactivation 自殺基因治療 suicide gene therapy 基因免疫治療 immune adjustment 其他,（一）基因置換（gene replacement）,定義：將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。,目的：將缺陷基因的異常序列進行矯正。 對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。,又稱為基因打靶(gene targeting） 定點整合的條件: 轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與染色體上的DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實現(xiàn)。,基因同源重組技術(shù) ,要實現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組技術(shù)使相應(yīng)的正常基因定向?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。,定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/100萬，采用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達(dá)1/10。,基因置換必要條件：,1、對導(dǎo)入的基因及其產(chǎn)物有詳盡的了解 2、外來基因能有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞 3、導(dǎo)入基因能在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定存在 4、導(dǎo)入基因能有適度水平的表達(dá) 5、基因?qū)氲姆椒八幂d體對宿主細(xì)胞安全無害,（二） 基因修飾,基因添加或稱基因增補（gene augmentation）: 通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。,類型: 在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補償缺陷基因的功能； 向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。,基因干預(yù)(gene interference) 指采用特定的方式抑制某個基因的表達(dá)，或者通過破壞某個基因而使之不表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。,反義核酸： 封閉基因表達(dá) 核酶： 裂解特異的靶mRNA RNA干涉技術(shù)：,（三）基因干預(yù),（四）自殺基因治療 自殺基因治療(suicide gene therapy) 自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。 原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。,自殺基因的作用機制,TK/GCV 單純皰疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。,CD/5-FC 大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在細(xì)胞內(nèi)將無毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU）。,1.自殺基因系統(tǒng),5-氟尿嘧啶通過競爭性抑制胸苷酸合酶的活性，從而抑制脫氧胸苷三磷酸的合成。,旁觀者效應(yīng):“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。,2. 旁觀者效應(yīng),（五）基因免疫治療 immune adjustment,通過將抗癌免疫增強細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。,第二節(jié) 基因治療的必要條件 ,1、發(fā)病機制在DNA水平上已經(jīng)清楚； 2、要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達(dá)產(chǎn)物有詳盡的了解； 3、該基因正常表達(dá)的組織可在體外進行遺傳操作；,1、外源基因可有效導(dǎo)入靶細(xì)胞 2、外源基因能在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定存留 3、導(dǎo)入基因能適量表達(dá) 4、導(dǎo)入基因的方法及載體對宿主細(xì)胞安全無害,理想的基因治療還必須：,基因轉(zhuǎn)移技術(shù),The Technique of Gene Transfer,基因治療的兩種途徑,載體,目的基因,in vivo,ex vivo,靶細(xì)胞,基因治療途徑,1、間接體內(nèi)治療途徑（ex vivo） 是先從患者體內(nèi)取出某一器官組織的細(xì)胞，體外擴增后，將目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞形成表達(dá)外源基因的遺傳修飾細(xì)胞，選擇高表達(dá)的細(xì)胞擴增培養(yǎng)，以一定數(shù)量移植患者體內(nèi)。（安全、易控制但操作復(fù)雜） 2、直接體內(nèi)治療途徑（in vivo） 將目的基因體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，所用載體必須具有特異的導(dǎo)向性和轉(zhuǎn)移效率。（操作簡單但療效短、免疫排斥等）,基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)技術(shù)：,1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。 2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。,1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),病毒載體 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。,Retrovirus,（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒,（1）兩端各有一長末端重復(fù)序列LTR。,逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點,（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。,(1)在U3內(nèi)有增強子和啟動子； (2)U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS) ； (3)在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號。,（3）病毒有三個結(jié)構(gòu)基因,(1)gag基因，編碼核心蛋白及屬特異性抗原； (2)pol基因，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶； (3)env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,（4）5端LTR下游有一段病毒包裝所必需的包裝信號序列（）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。,逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點,（5）含有負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(PPT)。,逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點,構(gòu)成逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由兩部分組成：,(1)保留病毒顆粒的包裝信號而缺失病毒蛋白基因,(2) 輔助細(xì)胞株(如PA317)：它由缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建而成,Retroviral packaging system,LTR,gag,pol,env,LTR,Gag蛋白,PoL蛋白,Env蛋白,包裝細(xì)胞系,LTR,LTR,靶細(xì)胞,目的基因,標(biāo)記基因,LTR,LTR,目的基因,標(biāo)記基因,1,2,3,4,5,假病毒顆粒的產(chǎn)生并感染靶細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,重組逆轉(zhuǎn)錄病毒 (核酸部分只能是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體),輔病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點, 逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳 動物細(xì)胞膜上的特異性受體識別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進入靶細(xì)胞。, 逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。, 前病毒可以高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。, 包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點,隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7 kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體 腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細(xì)胞內(nèi)，腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細(xì)胞基因組中。 腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。,腺病毒載體的優(yōu)點,1.基因?qū)胄矢撸瑢θ祟惏踩?2.宿主范圍廣；,3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；,4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；,5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5 kb外源基因；,腺病毒載體缺點,2.宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。,3.有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。,4.靶向性差。,1.不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達(dá)時間相對較短。,(1)腺病毒產(chǎn)生過程中與293輔助細(xì)胞內(nèi)E1區(qū)序列發(fā)生同源重組； (2)腺病毒載體與被治療的患者體內(nèi)已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒發(fā)生重組。,（3）腺病毒相關(guān)病毒載體 腺病毒相關(guān)病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5 kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。,Structure of AAV Virus Genomic DNA,REP:病毒復(fù)制基因, CAP:編碼衣殼蛋白的基因,AAV的特點, 以潛伏感染為主； 病毒基因組與細(xì)胞共存； 只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)； 若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因，AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制； 產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。,AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。 AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點。,AAV載體的缺陷：,2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低 廉。 基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進行表達(dá)。,脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖,脂質(zhì)體介導(dǎo)法缺點： 脂質(zhì)體介導(dǎo)進入靶細(xì)胞內(nèi)，易被單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)選擇性吞噬、降解。,（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù),將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。,缺點：受體介導(dǎo)的DNA通常進入細(xì)胞溶酶體內(nèi)被降解。,2019/9/1,51,可編輯,受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖,（3）基因直接注射技術(shù) 不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。 1.將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%40%； 2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 3.肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等。,基因直接注射法的優(yōu)點,1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易； 2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用； 3.導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點； 4.基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。,三、基因轉(zhuǎn)移的靶細(xì)胞,靶細(xì)胞的選擇須考慮： 1、容易取出和移植。血液系統(tǒng)的細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞； 2、細(xì)胞具有較長的壽命 3、離體細(xì)胞較易受外源基因轉(zhuǎn)化 4、離體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和一定時間培養(yǎng)后再植回體內(nèi)，仍較易成活,體細(xì)胞,生殖細(xì)胞,目前常用的靶細(xì)胞有： 1、造血細(xì)胞 2、皮膚成纖維細(xì)胞 3、肝細(xì)胞 4、血管內(nèi)皮細(xì)胞 5、淋巴細(xì)胞 6、肌肉細(xì)胞 7、腫瘤細(xì)胞,基因干預(yù),Gene Interference,主要干擾特定細(xì)胞的mRNA 轉(zhuǎn)錄和翻譯,基因干預(yù)的種類：,1.反義RNA (antisense RNA) 2.干擾RNA (RNA interference) 3.核酶 (ribozyme),（一）反義RNA 1. 反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控 利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種： （1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。 缺點：RNA易降解 （2）構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用 缺點：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的反義RNA量不易控制,反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問題：,反義RNA進入靶細(xì)胞前的降解問題,專一性轉(zhuǎn)移問題：如何解決某一組織、器官或系統(tǒng)中部分細(xì)胞病變進行專一性轉(zhuǎn)移治療。,2.受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù),受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高； 被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層, 可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。,將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復(fù)合物，成為運載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA進入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。,借助受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就可以實現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA的轉(zhuǎn)移。,3. 反義RNA的應(yīng)用前景,受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點，而在 一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。,（l）安全性高,（2）反義RNA設(shè)計 和制備方便,（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng),（4）能直接作用于一些RNA病毒,反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，不留“殘渣”。,在治療RNA病毒感染性疾病時，受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。,（二）RNA干擾,對RNA干擾的認(rèn)識來源于用線蟲（C. elegans）和果蠅所進行的實驗。實驗結(jié)果顯示，有義鏈RNA（sense RNA）或反義鏈RNA（antisense RNA）均能抑制線蟲基因的表達(dá)，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達(dá)。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達(dá)途徑。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比反義RNA至少高2個數(shù)量級。,1.RNA干擾現(xiàn)象,RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。,2.RNA干擾的機制,RNA干擾過程主要有2個步驟：,（1）小干擾性RNA（siRNA）,（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。,該復(fù)合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。,長雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）。,A. 賈第鞭毛蟲Dicer的晶體結(jié)構(gòu)； RNA干擾機制示意圖,1. 體外化學(xué)合成;,2. 用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi) 穩(wěn)定地生成。,siRNA的產(chǎn)生,3.RNA干擾的應(yīng)用前景 RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進展，使其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。,（1） 研究基因功能的新工具,由于 RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具。,RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型；抑制基因表達(dá)的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。,（2） 腫瘤的基因治療,傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNA干擾技術(shù)可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個基因同時剔除的表型，也可以同時使用多種雙鏈RNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時剔除。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異?；虮磉_(dá)的惡性腫瘤。, K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需； bcr/ab1融合基因與人白血病有關(guān)， 用RNA干擾技術(shù) * 可以阻礙K-RAS蛋白的表達(dá)從而抑制腫瘤發(fā)生； * 或殺死有bcr/ab1的人白血病細(xì)胞系。 通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進 白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對化療藥物的反 應(yīng)性。,（3） 病毒性疾病的基因治療 RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機制。 用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達(dá)，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。 用RNA干擾技術(shù)抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可阻礙HIV感染細(xì)胞。 也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。,siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。,（三）核酶(ribozyme)用于基因治療,天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。,在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)泥徫?，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子達(dá)到治療疾?。ㄈ缜宄《净蚪MRNA）的目的。 只要兩個RNA分子通過互補序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級結(jié)構(gòu)（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。,錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu) 和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖,三個雙螺旋區(qū) 13個核苷酸殘基保守序列 剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3端自動發(fā)生,（N代表任意核苷酸， H代表A,U或C）,1. 核酶的設(shè)計,核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設(shè)計核酶。,（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。,（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。,在基因治療中，主要是根據(jù)治療的靶基因序列的特點，設(shè)計和合成特定的核酶。設(shè)計的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域。,核酶的作用機制,2.核酶的應(yīng)用,與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。,核酶導(dǎo)入細(xì)胞方法,1、外源導(dǎo)入法：可以通過化學(xué)合成；也可以采用體外轉(zhuǎn)錄方法 2、內(nèi)源導(dǎo)入法：利用表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生核酶分子。,治療基因的受控表達(dá),Regulated Expression of Therapeutic Gene,時間:,治療基因的受控表達(dá)包括控制治療基因表達(dá)的時間、空間和水平三個方面。,空間:,表達(dá)水平：希望治療基因能在一個適當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)。,1.控制治療的基因在患者需要實施治療時才表達(dá)，而平時不需要進行治療時則處于關(guān)閉狀態(tài)； 2.根據(jù)不同疾病的治療要求，控制治療基因持續(xù)表達(dá)的時間跨度。,是指為了提高基因治療的專一性和安全性，嚴(yán)格限制治療基因只在靶細(xì)胞中表達(dá)，避免治療基因指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)干擾非靶細(xì)胞的正常生活，產(chǎn)生毒副作用。,要實現(xiàn)治療基因的受控表達(dá)，必須建立 完善的基因表達(dá)調(diào)控體系。 基因調(diào)控策略大致有以下幾種： 基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機制 基因外部調(diào)節(jié)機制 利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)以及治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)等,使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動子、增強子元件 使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動子、增強子元件,（一）基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機制,1.使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動子、增強子元件,例如，酪氨酸酶是皮膚細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生色素途徑中的一種酶，可利用其啟動子驅(qū)動治療基因只在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)，而不在正常的周邊細(xì)胞中表達(dá)。,不同類型的正常細(xì)胞或組織中往往存在某些特有的蛋白質(zhì)，它們的基因表達(dá)調(diào)控元件可用于驅(qū)動治療基因的特異性表達(dá)，從而起到治療作用。,前列腺特異性抗原(PSA)是參與精液凝塊中蛋白質(zhì)降解、使精液液化的一種絲氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中產(chǎn)生，而在前列腺癌細(xì)胞中含量很高，可以利用PSA基因調(diào)控元件驅(qū)動治療基因在PSA陽性的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)而發(fā)揮作用，而其在PSA陰性細(xì)胞和非前列腺癌細(xì)胞中不能使治療基因表達(dá)。,2.使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動子、增強子元件,某些病變的細(xì)胞或組織產(chǎn)生一些特殊的蛋白質(zhì)，其基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件也可以用來控制治療基因的特異性表達(dá)。,甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細(xì)胞中表達(dá)，不在成年肝臟細(xì)胞中表達(dá)。肝細(xì)胞腺癌細(xì)胞中AFP基因異常激活，因此可利用該基因啟動子驅(qū)動治療基因(如自殺基因)在癌細(xì)胞中表達(dá)，使癌細(xì)胞經(jīng)給藥后被殺死。 癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成員，在許多腺癌細(xì)胞中表達(dá)很高，采用其啟動子可以使治療基因只在CEA陽性的癌細(xì)胞中表達(dá)，而不會在陰性細(xì)胞中表達(dá)。,（二）基因外部的調(diào)節(jié)機制,除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機制以外，還可通過施加外部刺激，促進治療基因在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)。,采用熱休克蛋白基因的表達(dá)調(diào)控元件來啟動治療基因，可以通過對病灶局部進行熱處理，達(dá)到使治療基因特異性表達(dá)的目的。,組織纖溶酶原激活物(t-PA)作為溶解血栓的藥劑，在中風(fēng)和心肌梗死等疾病治療中起著重要的作用。t-PA的活性在輻射后增加50倍，表明其基因表達(dá)調(diào)控元件中存在受輻射誘導(dǎo)的調(diào)控元件，故可利用其調(diào)控元件啟動治療基因的表達(dá)，增強放療效果。,（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá),病灶微環(huán)境與正常時往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達(dá)。,例如，在腫瘤病灶處，常常出現(xiàn)葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/Bip的含量也隨之增加，使癌細(xì)胞能夠抵御應(yīng)激。當(dāng)采用這種基因的啟動子來控制治療基因時，可以使治療基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，使腫瘤組織壞死。,腫瘤細(xì)胞生長速度快于形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞，造成供血不足，因此在腫瘤內(nèi)部形成酸性、缺氧和營養(yǎng)缺乏的區(qū)域。缺氧條件可以通過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和缺氧響應(yīng)元件(HRE)相互作用，調(diào)節(jié)一些基因的表達(dá)；如果采用缺氧響應(yīng)元件(HRE)來控制治療基因的表達(dá)，即可實現(xiàn)治療基因只在缺氧的腫瘤組織中表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)。,（三）利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性 表達(dá),（四）治療基因的誘導(dǎo)表達(dá) 采用組織特異性啟動子控制治療基因的表達(dá)，可能造成這些基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，不再受外界控制。為了避免這種情況發(fā)生，研究人員正在開發(fā)和完善一些可誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)。 這種系統(tǒng)的必要成分：一種是轉(zhuǎn)錄激活劑，它只在誘導(dǎo)藥物存在時才能與DNA結(jié)合；另一種則是特異性基因表達(dá)調(diào)控元件，僅對這種轉(zhuǎn)錄激活劑有所響應(yīng)。,四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理,四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受Tet阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控。,無四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)； 四環(huán)素存在時，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進行。,基因治療的應(yīng)用研究,The Application of Gene Therapy,世界上第一個正式被批準(zhǔn)用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗。,腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID),病因: 淋巴細(xì)胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆積 破壞免疫功能 患兒很少活到成年,第一個基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH),治療策略： 淋巴細(xì)胞ADA酶 恢復(fù)至正常水平的 5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能 改善病人癥狀,治療基本步驟:,ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 導(dǎo)入患者淋巴細(xì)胞 體外擴增 回輸病人體內(nèi) 淋巴細(xì)胞ADA酶恢復(fù)至正常水平的5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀,（一）遺傳病的基因治療研究,已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為4050。但真正了解病因，能進行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。,1.在DN