實時熒光定量PCR技術(shù).ppt

,實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應用 (Real time Quantitative PCR),北京天為時代科技有限公司 歐陽志荃 2005-05-20,天為時代核酸系列講座之 華中科技大學同濟醫(yī)學院,講 座 提 綱,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR醫(yī)學和科研中的應用,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR醫(yī)學和科研中的應用,實時熒光定量PCR定義,在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,實時熒光定量PCR 原理 實時原理,常 規(guī) PCR技術(shù)： 對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析 無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測,實時定量PCR技術(shù)： 利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析,實時熒光定量PCR原理 定量原理,介紹三個概念： 擴增曲線、熒光閾值、Ct值,如何對起始模板定量？,通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析,實時熒光定量PCR 原理 - 擴增曲線,實時熒光定量PCR 原理 -熒光閾值,熒光信號閾值 （threshold ）： 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 熒光域值的缺省設置是315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍 手動 設置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99 真正的信號:熒光信號超過域值,實時熒光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定義： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù),實時熒光定量PCR 原理 -Ct值的重現(xiàn)性,Ct值的特點： 相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性,實時熒光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反應： X=X0*2n 非理想的PCR反應： X=X0 (1+Ex)n n：擴增反應的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率,實時熒光定量PCR 原理 - 定量原理,在擴增產(chǎn)物達到閾值線時: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量. 在閾值線設定以后,它是一個常數(shù),我們設為M 方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量,實時熒光定量PCR 原理 - 標準曲線,模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量,確定未知樣品的 C(t)值 通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量,實時熒光定量PCR原理 絕對定量,講 座 提 綱,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR實驗設計及應用,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR實驗設計及應用,非特異性熒光標記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標記： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor,實時熒光定量PCR 原理 - DNA 產(chǎn)物的熒光標記,實時熒光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green,SYBR Green 法 工作機理,SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位,SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光 復性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。,SYBR Green,實時熒光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,實時熒光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析,實時熒光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析,將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT),Tm,SYBR Green 法 融解曲線分析,Cycle number,SYBR Green 法 定量原理,模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量,SYBR Green 法 -PCR反應的建立,反應體系的建立及優(yōu)化: SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測 Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準 MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物 反應Buffer 體系的優(yōu)化 反應溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定 其他與常規(guī)PCR相同,天為時代公司利用SYBR Green 法定量檢測樣品DNA,SYBR Green 法 應用范圍,起始模板的測定 基因型的分析 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應的條件，對常規(guī)PCR有指導意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。,SYBR Green 法 優(yōu)缺點,實時熒光定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型雜交探針,5端標記有報告基團(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針,TaqMan法 工作原理,每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光,TaqMan 法 PCR反應的建立,1、引物、探針的設計： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴增片段400 bp，引物Tm為59-60 2、反應參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 ，45 S， 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM 4、其他與常規(guī)PCR相同,已肝病人血液中HBV的絕對定量 目的：利用核酸檢測，縮短檢驗時間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù) 方法：從血液中提取病毒DNA，擴增病毒基因，以TaqMan探針進行檢測 設置對照：濃度為106、105 、104 103 的標準樣品各一個，設陰性和空白對照 實驗步驟：提取HBV DNA 設計特異引物 設計TaqMan探針并標記探針 擴增程序 結(jié)果：獲取血液樣品中HBV DNA的精確copy數(shù),天為時代公司利用TaqMan法 檢測血液中的HBV,數(shù)據(jù)分析,分析結(jié)果： HBV DNA的精確copy數(shù)為3.7X105,天為時代公司利用TaqMan法 檢測血液中的HBV,TaqMan法 應用范圍,起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 產(chǎn)物鑒定 SNP分析,TaqMan法 優(yōu)缺點,實時熒光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信標),標記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標序列互補 莖由互補配對序列組成,發(fā)夾型雜交探針,Molecular beacon (分子信標) 工作原理,熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） 探針與DNA雜交時產(chǎn)生熒光 -變性過程：產(chǎn)生非特異性熒光 -延伸過程：不產(chǎn)生熒光 -退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號,Molecular beacon (分子信標) 應用范圍,起始模板的定量 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析,Molecular beacon (分子信標) 優(yōu)缺點,講 座 提 綱,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR實驗設計及應用,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR實驗設計及應用,實時熒光定量PCR法 標準樣品,相對定量中的內(nèi)標 內(nèi)標通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小 內(nèi)標定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量,絕對定量的標準樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA,實時熒光定量PCR法 標準樣品DNA拷貝數(shù),用于生成標準曲線的樣品如何設定？ 含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒 含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA 紫外分光光度計或熒光酶標測定濃度 根據(jù)質(zhì)?；騝DNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋,實時熒光定量PCR法 定量方法,絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標準曲線 相對定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達差異（不同時相） 2-C（t） 雙標準曲線法,實時熒光定量PCR法 TaqMan法舉例,TaqMan法研究ERBB2 在乳腺腫瘤 組織標本中的表達差異,TaqMan法舉例 標記探針,使用 TaqMan 探針進行雙通道熒光定量,Fam標記目標基因探針 VIC標記看家基因探針,TaqMan法舉例 材料準備,從正常乳腺組織中提取的總 RNA 從乳腺癌組織中提取的 總RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的質(zhì)粒用于生成標準曲線 單雙通道同時進行，獨立分析 Controls no RNA：陰性對照 RNA + no reverse transcriptase：基因組對照,TaqMan法舉例 反應程序,RT-qPCR 反應程序：,TaqMan法舉例 癌癥標記物表達,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,TaqMan法舉例 實驗結(jié)果 單雙通道相互驗證,TaqMan法舉例 實驗結(jié)果 定量,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法舉例 實驗結(jié)果 定量分析,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法舉例 實驗結(jié)果 表達差異,Healthy Tissue,Carc. Tissue,Relative Expression,ERBB2的表達差異,TaqMan法舉例 實驗結(jié)果 討論,通過RT-qPCR成功檢測了ERBB2基因在不同組織的 表達差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達量是正常水平的1.8倍,實時熒光定量PCR法 SYBR Green I法舉例,利用SYBR Green 1進行GMO定量 (SGI) for GMO soy detection,SYBR Green I法 GMO概念,轉(zhuǎn)基因生物又稱遺傳修飾生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是經(jīng)基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的生物，包括轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物和轉(zhuǎn)基因動物。,SYBR Green I法 GMO概念,1983年：首例轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因煙草 1986年：轉(zhuǎn)基因植物首次進入田間實驗 1994年：首例轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品Flavr Savr 延熟保鮮轉(zhuǎn)基因番茄進入市場 1996年至今：轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展期,SYBR Green I法 檢測方法,轉(zhuǎn)基因生物包括了特異的核酸序列，調(diào)控序列、目標基因、報告基因 通過內(nèi)源基因來對每個樣品DNA進行定量（Normalization) 利用插入基因的定量來進行GMO含量檢測,SYBR Green I法 材料準備,Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56） 普通非轉(zhuǎn)基因大豆 從超級市場買來的下列食物用來作為測試樣品： 大豆餅,豆制甜點 和兩個牌子的大豆粉,SYBR Green I法 樣品制備,標準品的制備:轉(zhuǎn)基因成分含量分別為 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2% 和 5% 轉(zhuǎn)基因大豆 實驗樣本 從含大豆成分的樣本中提取DNA,SYBR Green I法 引物設計,Lectin 擴增片段長度為318bp 其引物為： 正向：5-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3， 反向：5-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3 EPSPS 擴增片段長度為356bp 其引物為： 正向：5-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3 反向：5-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3,SYBR Green I法 C（t）定量,log A/B = logA- logB A: EPSPS GMO B: Lectin all bean A/B: %GMO,SYBR Green I法測GMO 數(shù)據(jù)收集與分析,標準曲線log%GMO對應C（t）獲得 熔解曲線分析，檢測擴增產(chǎn)物,數(shù)據(jù)處理： C（t）EPSPS-C（t）lectin=C（t） 處理條件： 假定兩對引物有相同的擴增效率并且相互獨立擴增。,SYBR Green I法測GMO 熔解曲線分析,Tm = 92oC,Tm = 88.5oC,SYBR Green I法測GMO 實驗結(jié)果