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文檔簡介
安縣中學,一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細菌利用尿素的原因,土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶,CO(NH2),脲酶,+ CO2,NH3,+ H2O,3、常見的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌,某些真菌和放線菌也能分解尿素。,4、課題目的,從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌,統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌,一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計菌落數(shù)目,.設置對照,(一)篩選菌株,水生耐熱細菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高溫的Taq DNA聚合酶 美國微生物學科布魯克(T.Brock) 1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細菌,篩選菌株 1.自然界篩選:根據(jù)它對生存環(huán)境的要求,到相應的環(huán)境中去尋找。 2.實驗室篩選:人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等),同時抑制或阻止其他微生物生長。 選擇培養(yǎng)基:在微生物學中,將允許特定種類的微生物生長,同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。目的是從眾多微生物中分離所需要的微生物。,土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類?,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源?,碳源:葡萄糖、尿素 氮源:尿素,培養(yǎng)基的氮源為尿素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖,而受到抑制,所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,測定微生物數(shù)量的方法: 1、直接計數(shù)法:最常用的顯微鏡直接計數(shù)。 先將待測樣品制成懸液,然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進行計數(shù)(血球計數(shù)板)。 根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。 優(yōu)點:設備簡單、能觀察微生物的形態(tài)特征。 缺點:不能區(qū)分死菌和活菌;不適于運動的細菌計數(shù) 難以計數(shù)微小的細菌。 應用:一般用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細胞菌體的計數(shù)。,(二)統(tǒng)計菌落數(shù)目,2.間接計數(shù)法(活菌計數(shù)法) 原理:在稀釋度足夠高時,微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的,即一個菌落代表原先的一個單細胞。 常用方法:稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中,C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù),V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml),M代表稀釋倍數(shù)。,注意事項 為了保證結果準確,一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。 為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中,經(jīng)涂布,培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。 涂布平板法所選擇的稀釋度很重要,一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為最好。,說明設置重復組的重要性。第一位同學只涂布了一個平板,沒有設置重復組,因此結果不具有說服力。第二位同學考慮到設置重復組的問題,涂布了3個平板,但是,其中1個平板的計數(shù)結果與另2個相差太遠,說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤,因此,不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。這個實例啟示學生,在設計實驗時,一定要涂布至少3個平板,作為重復組,才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結果時,一定要考慮所設置的重復組的結果是否一致,結果不一致,意味著操作有誤,需要重新實驗。,(三)設置對照,1、對照實驗:指除了被測試條件以外,其他條件都相同的實驗,作用是比照實驗組,排除任何其他可能原因的干擾,證明確實是所測試條件引起的相應結果。,2、對照實驗的目的:排除實驗組中非測試因素對實驗結果 的影響,提高實驗結果的可信度。,一是由于土樣不同,二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個原因,可以通過實驗來證明。實驗方案有兩種。一種方案是可以由其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗,如果結果與A同學一致,則證明A無誤;如果結果不同,則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。另一種方案是將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng),作為空白對照,以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個事例可以看出,實驗結果要有說服力,對照的設置是必不可少的。,(小結)操作:設置重復組,增強實驗的說服力和準確性。將待測樣品經(jīng)過一系列的稀釋,然后選擇三個稀釋度的菌液均勻涂布在平板上,然后培養(yǎng)。 (注意):為了結果接近真實值,可將同一稀釋度菌液涂布到3個或3個以上的平板上,經(jīng)培養(yǎng),計算出菌落的平均數(shù)。 對照原則:判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染,將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。 判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用,對照培養(yǎng)基接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。 計算公式:每克樣品中的菌株數(shù)=(C/V)*M,(1)原理:尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥,只有當土壤中 的 細菌將尿素分解成氨之后,才能 被植物利用。尿素細菌能合成脲酶,在脲酶的作用下尿素被分解成氨。 CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3,二、實驗設計,(2)實驗設計的內(nèi)容包括實驗方案、材料用具、實施步驟和時間安排等。 (3)實驗流程: 土壤取樣 樣品系列稀釋 涂布平板與培養(yǎng) 觀察并記錄結果,菌落計數(shù),二.實驗的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右,再取樣,將樣品裝入事先準備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。 .制備培養(yǎng)基: 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。,應在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中,每一步都要在火焰旁進行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因:不同微生物在土壤中含量不同 目的:保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板,三樣品的稀釋,為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度?測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量,選用的稀釋范圍相同嗎?,原因:土壤中各類微生物的數(shù)量(單位:株/kg)是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中:好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2 185萬,放線菌數(shù)約為477萬,霉菌數(shù)約為23.1萬。 結論:為獲得不同類型的微生物,就需要按不同的稀釋度進行分離,同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,.取樣涂布,實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板,則說明稀釋操作比較成功,并能夠進行菌落的計數(shù),如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大,表明試驗不精確,需要重新實驗。,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計數(shù)時,每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果,以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細菌:3037培養(yǎng)12d 放線菌:2528培養(yǎng)57d 霉菌:2528的溫度下培養(yǎng)34d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,一無菌操作 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中,塞好棉塞。 3、在稀釋土壤溶液的過程中,每一步都要在火焰旁操作。 二做好標記 注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。 三規(guī)劃時間,1、結合對照,分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。 2、是否獲得了某一稀釋度下,菌落數(shù)目在30300的平板。在這稀釋度下,是否至少有兩個平板的菌落數(shù)相近? 3、你統(tǒng)計的每克土壤中含有能分解尿素的細菌的菌落數(shù)是多少?與其他同學的結果接近嗎?如果差異很大,可能是什么原因引起的?,五.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后,如果PH升高,指示劑將變紅,說明該細菌能夠分解尿素。,測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后,將濾膜放到 伊紅美藍 培養(yǎng)基上培養(yǎng),大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色,通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征,(一)空氣中微生物總數(shù)的檢測 (二)水中細菌總數(shù)的檢測 (三)牛奶中細菌的分離與計數(shù) (四)土壤中真菌(或放線菌)的分離與計數(shù),1.對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是( ) A.在液體培養(yǎng)基上進行 B.至少接種一種細菌 C.接種一個細菌 D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是( ) A.培養(yǎng)細菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,實踐訓練,A,C,D,4.下列說法不正確的是( ) A.科學家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5,以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響,提高實驗結果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比,土壤中的微生物數(shù)量最大,種類最多。 5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌,常在培養(yǎng)基中加入( ) A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B,C,例3(2005年江蘇)抗生素作為治療細菌感染的藥物,其高效性和巨大的經(jīng)濟價值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應用具有劃時代的意義。 青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型是 ,青霉素是青霉菌的 代謝產(chǎn)物。 在生產(chǎn)和科研中,常選用處于 期的青霉菌作為菌種或研究材料,因為此時的青霉菌代謝旺盛, 和 比較穩(wěn)定。 對青霉菌菌體生長情況的測定:取一定體積的發(fā)酵液,經(jīng)離心分離、反復洗滌后, ,再計算發(fā)酵罐中菌體的總重量。,異養(yǎng)需氧型,次級,對數(shù),個
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