乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查.ppt

乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查,報告人：付紅偉 天津醫(yī)大總醫(yī)院 檢驗(yàn)中心 2011.1.21,我國HBV感染概況,一般人群HBsAg攜帶率高達(dá)7.18%；現(xiàn)有慢性HBV感染者約9 300萬人，占全世界的1/4； 其中慢性乙型病毒性肝炎患者超過 2 000萬例，占全世界慢性乙肝患者的1/3； 15歲以下兒童HBsAg攜帶率下降顯著，1-4歲組僅為0.96%；1 4歲組HBsAb陽性率由1992年15.75%升至72.25%; 抗HBcAb陽性率由1992年30.08%降至3.76%；,2,HBV基因組,HBV DNA是由長鏈L (負(fù)鏈) 和短鏈S (正鏈) 組成的不完全雙鏈環(huán)狀DNA，短鏈的長度相當(dāng)于長鏈的50%85%。 HBV DNA長鏈載有病毒蛋白質(zhì)的全部密碼，有4個開放讀碼框架(ORF)，分別稱為S、C、P和X區(qū) 。編碼7個蛋白質(zhì)。 HBV DNA易發(fā)生變異，特別是前S或S區(qū)基因較易突變。,嗜肝DNA病毒的共同特點(diǎn)： 內(nèi)含33.3kb松散環(huán)狀、部分雙鏈DNA基因組 及DNA聚合酶；病毒的復(fù)制需逆轉(zhuǎn)錄過程。,3,HBV抗原和抗體系統(tǒng),表面抗原(HBsAg)： HBV外膜糖蛋白=S+L+M蛋白 S蛋白：狹義的HBsAg指S蛋白。 HBsAg陽性說明機(jī)體有HBV感染。 中分子蛋白：preS2+S 大分子蛋白：preS1+preS2+S,S蛋白,中分子蛋白,大分子蛋白,1.HBsAg和抗-HBs,e抗原(HBeAg)： 是可溶性蛋白質(zhì) 只存在于血液中 是病毒復(fù)制和傳染性的標(biāo)志 e抗體(抗-HBe)： 對HBV感染有一定的保護(hù)作用 其出現(xiàn)標(biāo)志著病毒復(fù)制減少、傳染性降低,前C區(qū),C區(qū),前C / C 蛋白,HBeAg,HBcAg,表達(dá),切割、加工,HBeAg只存在于血清中,HBV C基因,分泌到細(xì)胞外,2. HBeAg 和抗-HBe,5,HBV 的三種形態(tài),1,Hepatitis B virion(Dane particle) 2,secreted filament 3,secreted sphere,6,7,HBV 自然復(fù)制周期,8,HBV感染的實(shí)驗(yàn)室檢查,1.乙型肝炎的生物化學(xué)檢測,主要指標(biāo)： ALT, AST, ASTm， 血清白蛋白， 血清膽紅素， 膽堿酯酶, 甲胎蛋白, 凝血酶原時間(PT)及部分凝血因子；,9,方法學(xué)的發(fā)展 ELISA：靈敏性高，成本低，適用于普通病人篩查； 膠體金免疫層析法(金標(biāo)法)：簡便易行，可用于急診病人快速檢測； 化學(xué)發(fā)光法定量檢測：價格昂貴，可用于HBVMs為臨界值的病人的確證；可間接反映宿主HBV的復(fù)制水平，在評價抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答、療效和判斷預(yù)后方面有重要意義。 新增檢測指標(biāo) PreS1、PreS2及其相應(yīng)抗體 對乙肝兩對半的新認(rèn)識,10,2. HBV 血清標(biāo)志物檢測,11,HBV血清標(biāo)志物檢測方法的成本效果分析(1),12,HBV血清標(biāo)志物檢測方法的成本效果分析(2),Back,13,Terminal protein,Spacer,Reverse Transcriptase (RT),RNaseH,rt1,rt344,preS1,preS2,S,s1,s266,HBsAg,X,Mutation of S & Pre-S,S基因“a”決定簇 G 145 R 變異，與抗-HBs 的親和力降低,S 基因變異可導(dǎo)致隱匿性HBV 感染(occult HBV infection) ，表現(xiàn)為血清HBsAg 陰性，但仍可有HBV 低水平復(fù)制 (血清HBV DNA 常 104 拷貝/ml),獻(xiàn)血員人群，隱匿性HBV感染的檢出率可達(dá)0.19%,14,15,16,PreS1檢測的臨床價值,前S1蛋白主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上，在HBV感染宿主細(xì)胞 過程及在病毒復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中起重要作用; 前S1抗原與HBeAg之間有高度相關(guān)性，并可區(qū)別因變異種及其他原因造成的乙肝病毒e抗原(HBeAg)假陰性，可作為HBeAg假陰性補(bǔ)充，從而準(zhǔn)確反映患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況； 可作為HBV感染及復(fù)制的標(biāo)注，與其它血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測，相互補(bǔ)充。,Back,17,大三陽,小三陽,vs,HBV血清學(xué)標(biāo)志檢測結(jié)果分析,16,19,1916例HBV血清標(biāo)志物陽性類型分布模式,20,21,22,HBV DNA 定量檢測 病毒復(fù)制水平最可靠，最直接的證據(jù)，與傳染性和疾病進(jìn)展密切相關(guān)； 主要用于HBV感染的判斷，治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷。 HBV基因分型 基因分型的必要性； 基因分型的主要方法； HBV耐藥突變的檢測,3.HBV 分子生物學(xué)診斷,慢性HBV感染治療適應(yīng)癥的選擇,HBeAg 陽性，HBV DNA 載量 105 copies/ml, ALT 2 ULN; HBeAg 陰性，HBV DNA 載量 104 copies/ml, ALT 2 ULN; HBV DNA持續(xù)陽性，年齡40歲，ALT大于正常上限，也可給予抗病毒治療； HBV DNA持續(xù)陽性，年齡40歲，ALT持續(xù)正常，應(yīng)密切隨訪，動態(tài)觀察疾病進(jìn)展，必要時行肝組織檢測，有病變證據(jù)時，可以給予抗病毒治療；,23,HBV 感染抗病毒治療的療效評估,治療終點(diǎn)：HBV DNA 明顯下降或低于檢測下限，并伴有ALT正常； HBV DNA 水平治療開始后3個月內(nèi)持續(xù)下降1 log以上才說明治療有效； 每日0.5mg恩替卡韋治療1年時, HBeAg 陽性和陰性慢性乙型肝炎患者HBV DNA 檢測不到率分別為67% 和90%, 恩替卡韋的HBeAg轉(zhuǎn)換率為21% , 與其他口服抗病毒藥相似。 并不以HBeAg轉(zhuǎn)陰或HBsAg轉(zhuǎn)陰為治療終點(diǎn)或目標(biāo)。,24,HBV DNA 定量檢測試劑盒的性能對比,25,26,同時可以實(shí)現(xiàn)對HCV,HIV-1,衣原體，及淋病的一體化檢測,Back,病毒基因突變,疾病進(jìn)展,臨床表現(xiàn),對干擾素應(yīng)答,耐藥變異,生化學(xué)改善,HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,HBV DNA清除,急性乙型肝炎,慢性乙型肝炎,肝硬化 (LC),肝細(xì)胞癌 (HCC),27,HBV基因型/基因亞型,常用HBV基因分型方法比較,28,B型特異性“引物對”的特異度分析,B型特異性引物HB（正義鏈）：5-ACC GTG AAC GCC CAC MGG AA-3,29,Back,4.HBV 臨床藥物治療監(jiān)測,乙肝病毒的耐藥性檢測，是精準(zhǔn)治療乙肝的關(guān)鍵！ 目前由于治療不夠規(guī)范，造成我國目前超過95%的乙肝患者發(fā)生耐藥、病毒變異、病毒耐藥，變異檢測勢在必行！ 拉米夫定是第一個被批準(zhǔn)治療慢性乙型肝炎的口服抗病毒藥, 已在全世界廣泛應(yīng)用。但其耐藥發(fā)生率高, 治療1年時耐藥發(fā)生率為23%, 2年為46% , 3年為55% , 4和5年分別為65%和71% 。,30,耐藥-核苷(酸)類似物 (NA) 治療失敗最重要原因,31,拉米夫定LMV,阿德福韋酯ADV,替比夫定LdT,恩替卡韋ETV,HBV,替諾福韋TDV,NAs：,抑制病毒復(fù)制,長期使用,耐藥變異,臨床耐藥,表型耐藥,基因耐藥,耐藥 研究,32,33,34,Polymerase,Terminal protein,Spacer,Reverse Transcriptase (RT),RNaseH,rt1,rt344,逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT) 區(qū)某些位點(diǎn)變異與耐藥相關(guān),preS1,preS2,HBsAg,s1,s266,可同時分析：耐藥變異，HBsAg變異，基因型，血清型,全長RT區(qū)分析技術(shù)路線,HBV DNA 提取,snPCR擴(kuò)增RT區(qū),PCR 產(chǎn)物直接測序,生物信息學(xué)分析與數(shù)據(jù)信息挖掘,血清與資料收集,可同時分析：耐