GB5009.222-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中桔青霉素的測(cè)定.pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9.2 2 22 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中桔青霉素的測(cè)定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.2 2 22 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T5 0 0 9.2 2 22 0 0 8 紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測(cè)定 、S N/T2 4 2 62 0 1 0 進(jìn)出口糧谷中桔霉素含量檢測(cè)方法 液相色譜法 和S N/T2 9 1 62 0 1 1 出口食品中桔霉素的測(cè)定方法 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T5 0 0 9.2 2 22 0 0 8相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中桔青霉素的測(cè)定” ; 增加了凈化步驟; 增加了適用范圍。G B5 0 0 9.2 2 22 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中桔青霉素的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中桔青霉素的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大米、 玉米、 辣椒、 紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測(cè)定, 第二法適用于大米、 大麥、 燕麥、 小麥中桔青霉素的測(cè)定。第一法 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法2 原理試樣中的桔青霉素用甲醇-水提取, 提取液經(jīng)過(guò)濾、 稀釋后, 用免疫親和柱凈化, 采用液相色譜結(jié)合熒光檢測(cè)器測(cè)定桔青霉素的含量, 外標(biāo)法定量。3 試劑和材料除非另有說(shuō)明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B6 6 8 2規(guī)定的二級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。3.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。3.1.3 磷酸(H3P O4) : 色譜純。3.1.4 冰乙酸(C2H4O2) : 色譜純。3.1.5 氫氧化鈉(N a OH) 。3.1.6 吐溫2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。3.1.7 氯化鈉(N a C l) 。3.1.8 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。3.1.9 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。3.1.1 0 氯化鉀(K C l) 。3.2 試劑配制3.2.1 氫氧化鈉溶液(2m o l/L) : 稱取8 0.0g固體氫氧化鈉, 溶于1L水中。3.2.2 磷酸溶液(1 0mm o l/L,p H7.5) : 準(zhǔn)確移取1.3 7 6m L磷酸加水定容至20 0 0m L, 用2m o l/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)p H至7.5。3.2.3 磷酸溶液(1 0mm o l/L,p H2.5) : 準(zhǔn)確移取1.3 7 6m L磷酸加水定容至20 0 0m L, 用2m o l/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)p H至2.5。3.2.4 P B S緩沖溶液: 稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀, 用水溶解,G B5 0 0 9.2 2 22 0 1 62 調(diào)節(jié)p H至7.0, 用水定容至10 0 0m L。3.2.5 0.1%吐溫2 0 - P B S溶液: 準(zhǔn)確移取1m L吐溫2 0以P B S緩沖溶液定容至10 0 0m L。3.2.6 0.1%磷酸溶液: 準(zhǔn)確移取1m L磷酸加水定容至10 0 0m L。3.2.7 洗脫液: 甲醇- 1 0mm o l/L磷酸溶液(p H2.5) (7 0+3 0) 。3.2.8 洗脫液: 甲醇- 0.1%磷酸溶液(7 0+3 0) 。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品桔青霉素(C1 3H1 4O5,C A S號(hào):5 1 8 - 7 5 - 2) , 純度9 9.0%?；蚪?jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱取一定量的桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品, 以甲醇溶解并定容至1 0.0m L作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 濃度為1 0 0g/m L, 于4下保存。3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液: 準(zhǔn)確移取1.0m L桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于1 0m L容量瓶中, 用甲醇定容, 濃度為1 0g/m L, 于4下保存。3.4.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液: 根據(jù)需要, 取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間液, 用空白樣品提取液配成不同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液, 現(xiàn)用現(xiàn)配。3.5 材料3.5.1 桔青霉素免疫親和柱: 柱體積3m L, 最大柱容量2 0n g, 或等效柱。3.5.2 玻璃纖維濾紙: 直徑1 1c m, 孔徑1.5m。4 儀器和設(shè)備4.1 高效液相色譜儀, 配熒光檢測(cè)器。4.2 分析天平: 感量0.0 0 01g和0.0 1g。4.3 高速均質(zhì)器:1 20 0 0r/m i n。4.4 混勻器。5 分析步驟5.1 提取5.1.1 大米、 玉米、 辣椒稱取經(jīng)充分粉碎均質(zhì)試樣1 0.0g( 精確至0.1g) 于1 5 0m L具塞錐形瓶中, 加入5 0m L甲醇-水(7 0+3 0) 提取液, 以高速均質(zhì)器高速均質(zhì)提取2m i n, 過(guò)濾提取液, 移取1.0m L濾液, 置于另一干凈的容器中, 加入4 9m L1 0mm o l/L磷酸溶液(p H7.5) 稀釋、 混勻; 以玻璃纖濾紙過(guò)濾待免疫親和柱凈化。5.1.2 紅曲及其制品稱取經(jīng)充分粉碎均質(zhì)試樣1.0g( 精確至0.1g) 于5 0 m L具塞錐形瓶中, 加入2 0 m L甲醇-水(7 0+3 0) 提取液, 以高速均質(zhì)器高速均質(zhì)提取2m i n, 過(guò)濾提取液, 移取1.0m L濾液, 置于另一干凈的容器中, 加入3 9m LP B S緩沖溶液稀釋、 混勻; 以玻璃纖濾紙過(guò)濾待免疫親和柱凈化。G B5 0 0 9.2 2 22 0 1 63 5.2 凈化5.2.1 大米、 玉米、 辣椒將免疫親和柱連接于1 0m L玻璃針筒下, 準(zhǔn)確移取1 0.0m L( 相當(dāng)于0.0 4g試樣) 上述澄清濾液過(guò)免疫親和柱, 以1滴 /s 2滴 /s的流速全部通過(guò)親和柱; 加入5m L1 0mm o l/L磷酸(p H7 .5) 以1滴 /s 2滴/s的流速淋洗柱子, 直至空氣進(jìn)入到親和柱中, 棄去全部流出液。準(zhǔn)確加入1.0m L洗脫液進(jìn)行洗脫, 洗脫流速為1滴/s 2滴/s。收集全部洗脫液于玻璃試管中, 供檢測(cè)用。5.2.2 紅曲及其制品將免疫親和柱連接于1 0m L玻璃針筒下, 準(zhǔn)確移取1 0 .0m L上述澄清濾液過(guò)免疫親和柱, 以1滴 /s 2滴/s的流速全部通過(guò)親和柱; 加入1 0m L0.1%吐溫2 0 - P B S溶液, 以1滴/s 2滴/s的流速淋洗柱子, 直至空氣進(jìn)入到親和柱中, 棄去全部流出液。準(zhǔn)確加入1.0m L洗脫液( 紅曲及其制品) 進(jìn)行洗脫, 洗脫流速為1滴/s 2滴/s。收集全部洗脫液于玻璃試管中, 供檢測(cè)用。5.3 空白試驗(yàn)除不加試樣外, 均按上述操作步驟進(jìn)行。5.4 測(cè)定5.4.1 液相色譜參考條件5.4.1.1 大米、 玉米、 辣椒液相色譜分析條件列出如下:a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長(zhǎng)1 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 粒徑5m, 或等效柱;b) 柱溫:3 0;c) 流速:1.0m L/m i n;d) 進(jìn)樣量:5 0L;e) 檢測(cè)條件: 激發(fā)波長(zhǎng)3 5 0n m, 發(fā)射波長(zhǎng)5 0 0n m;f) 流動(dòng)相A液: 乙腈, 流動(dòng)相B液:1 0mm o l/L磷酸(p H2.5) 。流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1。表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件時(shí)間/m i n流動(dòng)相A液/%流動(dòng)相B液/%02 08 01 02 08 01 47 03 01 82 08 02 02 08 05.4.1.2 紅曲及其制品液相色譜分析條件列出如下:a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長(zhǎng)1 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 粒徑5m, 或等效柱;G B5 0 0 9.2 2 22 0 1 64 b) 柱溫:3 0;c) 流速:0.7m L/m i n;d) 進(jìn)樣量:5 0L;e) 檢測(cè)條件: 激發(fā)波長(zhǎng)3 5 0n m, 發(fā)射波長(zhǎng)5 0 0n m;f) 流動(dòng)相A液: 乙腈, 流動(dòng)相B液:0.1%磷酸。流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表2。表2 流動(dòng)相及梯度洗脫條件時(shí)間/m i n流動(dòng)相A液/%流動(dòng)相B液/%04 06 014 06 079 01 099 01 01 04 06 01 54 06 05.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作配制0.0n g/m L、1.0n g/m L、2.0n g/m L、5.0n g/m L、1 0.0n g/m L、2 0.0n g/m L6個(gè)濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。在儀器最佳工作條件下, 用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣, 以相應(yīng)的桔青霉素的色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo), 以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中桔青霉素的濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖參見(jiàn)圖A.1和圖A.2。5.4.3 試樣溶液的測(cè)定將試樣溶液注入高效液相色譜儀, 測(cè)定相應(yīng)的峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中桔青霉素的濃度。6 分析結(jié)果的表述試樣中桔青霉素含量按式(1) 計(jì)算:X=Vfm(1) 式中:X 試樣中桔青霉素的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ; 樣液中桔青霉素的濃度, 單位為微克每升(g/L) ;V 定容體積, 單位為毫升(m L) ;f 樣液稀釋倍數(shù);m 樣液所代表的試樣量, 單位為克(g) 。計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。7 精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的1 0%。G B5 0 0 9.2 2 22 0 1 65 8 其他本方法中大米、 玉米、 辣椒粉樣品的檢出限和定量限分別為8g/k g和2 5g/k g; 紅曲及其制品的檢出限和定量限分別為2 5g/k g和8 0g/k g。第二法 C1 8固相萃取小柱凈化-高效液相色譜法9 原理用乙腈-異丙醇-水的混合溶液提取試樣中桔青霉素,C1 8固相萃取小柱凈化, 用配熒光檢測(cè)器的液相色譜儀測(cè)定, 外標(biāo)法定量。1 0 試劑和材料除非另有說(shuō)明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B6 6 8 2規(guī)定的二級(jí)水。1 0.1 試劑1 0.1.1 異丙醇(C3H8O) : 色譜純。1 0.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。1 0.1.3 磷酸(H3P O4) : 優(yōu)級(jí)純。1 0.1.4 甲醇(CH3OH) 。1 0.2 試劑配制1 0.2.1 提取溶劑: 乙腈-異丙醇-水(3 5+1 0+5 5) , 用磷酸調(diào)p H為1.5。1 0.2.2 磷酸溶液(0.0 8m o l/L) : 取5.6m L磷酸, 以水定容至1L。1 0.2.3 流動(dòng)相: 乙腈-異丙醇-磷酸溶液(3 5+1 0+5 5) 。1 0.3 標(biāo)準(zhǔn)品桔青霉素(C1 3H1 4O5,C A S號(hào):5 1 8 - 7 5 - 2) , 純度9 9%?；蚪?jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。1 0.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 0.4.1 桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液: 稱取適量桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 用乙腈溶解并定容至1.0m g/m L,0 4保存。1 0.4.2 桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液: 根據(jù)需要用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成2 5n g/m L、5 0n g/m L、1 0 0n g/m L、5 0 0n g/m L、10 0 0n g/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。1 0.5 材料1 0.5.1 C1 8固相萃取柱: 填料5 0 0m g, 柱體積3m L, 或等效柱。1 0.5.2 玻璃纖維濾紙: 直徑1 1c m, 孔徑1.5m。G B5 0 0 9.2 2 22 0 1 66 1 1 儀器和設(shè)備1 1.1 高效液相色譜儀: 配有熒光檢測(cè)器。1 1.2 振蕩器。1 1.3 離心機(jī):65 0 0r/m i n。1 1.4 真空固相萃取裝置。1 1.5 氮吹儀。1 1.6 分析天平: 感量0.0 0 01g和0.0 1g。1 2 分析步驟1 2.1 提取取樣品5 0 0g, 用粉碎機(jī)粉碎并通過(guò)8 3 0m圓孔篩, 混勻, 分成2份, 裝入潔凈容器內(nèi), 密封保存。稱取試樣約5g( 精確至0.0 1g) 于5 0m L離心管中, 加1 0m L提取溶劑(1 0.2.1) , 在振蕩器上振蕩提取3 0m i n。以35 0 0r/m i n離心4 m i n, 上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。在殘?jiān)性偌尤? m L提取溶劑(1 0.2.1) , 重復(fù)上述操作, 合并上清液。在提取液中加水至4 0m L, 并用磷酸調(diào)p H為1.5, 過(guò)玻璃纖維濾紙, 待凈化。1 2.2 凈化將上述溶液過(guò)預(yù)淋洗好的C1 8固相萃取柱, 用5m L水淋洗柱子。待淋洗液全部流出柱子后, 減壓抽干3m i n。用1 0m L甲醇以1.0m L/m i n的速度洗脫, 收集全部洗脫液, 在4 0 下,N2吹干, 再以1.0m L流動(dòng)相溶解, 過(guò)0.2 2m的有機(jī)相微孔濾膜, 供液相色譜測(cè)定。1 2.3 空白試驗(yàn)除不加試樣外, 均按上述操作步驟進(jìn)行。1 2.4 測(cè)定1 2.4.1 液相色譜參考條件a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長(zhǎng)2 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 粒徑5m, 或等效者;b) 流動(dòng)相: 乙腈-異丙醇-磷酸溶液(3 5+1 0+5 5) ;c) 流速:1.0m L/m i n;d) 進(jìn)樣量:5 0L;e) 柱溫:2 8;f) 檢測(cè)波長(zhǎng): 激發(fā)波長(zhǎng)3 3 1n m, 發(fā)射波長(zhǎng)5 0 0n m。1 2.4.2 色譜測(cè)定根據(jù)樣液中被測(cè)桔青霉素含量情況, 選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液中桔青霉素響應(yīng)