GB22031-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)干酪及加工干酪制品中添加的檸檬酸鹽的測(cè)定.pdf

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 220312010中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實(shí)施食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 干酪及加工干酪制品中添加的檸檬酸鹽的測(cè)定 National food safety standard Determination of added citrate content in cheese and processed cheese products GB 220312010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 22031-2008干酪及加工干酪制品中添加的檸檬酸鹽含量的測(cè)定 酶-比色法。 本標(biāo)準(zhǔn)附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB/T 22031-2008。 GB 220312010 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 干酪及加工干酪制品中添加的檸檬酸鹽的測(cè)定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了干酪及加工干酪制品中添加的檸檬酸鹽含量（以檸檬酸計(jì)）的測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于干酪及加工干酪制品中添加的檸檬酸鹽含量的測(cè)定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 測(cè)定樣品中總檸檬酸鹽的含量，扣除原料帶入樣品中的檸檬酸鹽的量（以0.04倍乳糖換算），即為樣品中添加的檸檬酸鹽含量。檸檬酸鹽以檸檬酸計(jì)。 4 分析步驟 樣品中的總檸檬酸鹽的測(cè)定和含量計(jì)算按附錄A的規(guī)定執(zhí)行。 樣品中的乳糖的測(cè)定和含量計(jì)算按附錄B的規(guī)定執(zhí)行。 5 分析結(jié)果的表述 樣品中添加的檸檬酸鹽含量按（1）式計(jì)算： wa=wcrwi （1） 式中： wa樣品中添加的檸檬酸鹽含量，以檸檬酸計(jì)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示； wc樣品中總檸檬酸含量，單位為質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）； wi 樣品中乳糖含量，單位為質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）； r 原料乳清粉或乳粉中檸檬酸含量與乳糖含量的比率（檸檬酸/乳糖） （r = 0.04） 。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。 6 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10 %。 GB 220312010 2 附 錄 A （規(guī)范性附錄） 干酪及加工干酪制品中檸檬酸鹽含量的酶法測(cè)定 A.1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)適用于酶法測(cè)定干酪及加工干酪制品中的檸檬酸鹽含量。 A.2 原理 檸檬酸鹽裂解酶（CL）將檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化為草酰乙酸鹽和乙酸鹽，蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的存在下催化脫羧草酰乙酸鹽以及脫羧產(chǎn)物丙酮酸鹽，分別轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸和L-乳酸。NADH在反應(yīng)中被氧化成了NAD+。在340 nm處測(cè)定樣品溶液中NADH的吸光度差值，計(jì)算樣品中檸檬酸鹽的含量。 A.3 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 A.3.1 三氯乙酸溶液（200 g/L）:稱取20 g三氯乙酸（CCl3COOH）溶于水中，混勻，并定容至100 mL。 A.3.2 氫氧化鈉溶液（200 g/L）:稱取20 g氫氧化鈉（NaOH） ，用水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.3 氫氧化鈉溶液（40 g/L）:稱取4 g氫氧化鈉（NaOH） ，用水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.4 氫氧化鈉溶液（4 g/L）:稱取0.4 g氫氧化鈉（NaOH） ，用水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.5 氯化鋅溶液（0.8 g/L）:稱取0.8 g氯化鋅（ZnCl2） ，用水溶解后轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.6 緩沖液 （pH 7.8） :稱取7.13 g雙甘氨肽(H2NCH2CONHCH2CO2H)， 溶解于70 mL水中， 轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中。用氫氧化鈉溶液（A.3.2）調(diào)節(jié)pH至7.8，加入10 mL氯化鋅溶液（A.3.5）并定容至100 mL。充分混合。儲(chǔ)存在0 4 的冰箱中，此溶液可以保存四周。 A.3.7 碳酸氫鈉溶液（4.0 g/L）:稱取4.0 g碳酸氫鈉（NaHCO3） ，用水溶解后轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.8 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）溶液:稱取50 mg煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽（C21H27N7O14P2Na2）和100 mg碳酸氫鈉（NaHCO3） ，溶解于10 mL水中。 A.3.9 硫酸銨溶液（422 g/L）:稱取42.2 g硫酸銨(NH4)2SO4，用水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容。充分混合。 A.3.10 蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）懸濁液:用硫酸銨溶液（A.3.9）分別溶解蘋果酸脫氫酶（豬心，EC 1.1.1.37）和乳酸脫氫酶（兔肉，EC 1.1.1.27） ，使蘋果酸脫氫酶（MDH）的活性不低于600 IU/mL和乳酸脫氫酶的活性不低于1400 IU/mL。 緩慢攪勻成懸濁液后， 儲(chǔ)存在0 4 冰箱中，此溶液可以保存一年。 A.3.11 檸檬酸鹽裂解酶（CL）溶液:用0 水溶解檸檬酸鹽裂解酶（產(chǎn)氣腸桿菌，EC 4.1.3.6） ，使檸檬酸鹽裂解酶的活性不低于40 IU/mL。緩慢攪勻成懸濁液后，儲(chǔ)存在0 4 冰箱中，此溶液可以保存一周；在-20 冰箱中，可以保存四周。 A.3.12 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 （160 g/mL） :稱取175 mg一水檸檬酸 （C6H8O7H2O） ， 用水溶解后轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，定容。充分混合。 GB 220312010 3 A.4 儀器和設(shè)備 A.4.1 天平：感量為0.1 mg。 A.4.2 pH計(jì)：精度為0.1。 A.4.3 粉碎機(jī)。 A.4.4 具塞刻度比色管：10 mL，分度值0.1 mL。 A.4.5 中速濾紙。 A.4.6 紫外可見分光光度計(jì)：340 nm，1 cm比色皿。 A.4.7 水浴鍋。 A.5 試樣制備 A.5.1 干酪 除去干酪的外殼或發(fā)霉的表層，使試樣具代表性。用粉碎機(jī)（A.4.3）將試樣粉碎，混勻。 A.5.2 干酪制品 選擇具有代表性的試樣，用粉碎機(jī)（A.4.3）粉碎，混勻。 A.6 分析步驟 A.6.1 試液制備 稱取1 g（精確至0.0001 g）試樣（A.5），溶于50 mL的溫水（40 50 ）中，全部轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶中，冷卻至20 。再加入10 mL三氯乙酸溶液（A.3.1），用水定容，混合均勻后靜置30 min。用濾紙（A.4.5）過(guò)濾，棄去初濾液約10 mL。吸取25 mL濾液于燒杯中，用氫氧化鈉溶液（A.3.3）調(diào)節(jié)濾液pH至4后，再用氫氧化鈉溶液（A.3.4）調(diào)節(jié)pH至8。將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶中，用水定容。同時(shí)做空白試驗(yàn)。 A.6.2 測(cè)定 A.6.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 試劑在使用前恢復(fù)至室溫。準(zhǔn)確吸取0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL(相當(dāng)于0、80、160、200、320g檸檬酸)兩組檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（A.3.12）,分別置于10 mL比色管（A.4.4）中，各加入1.00 mL緩沖液（A.3.6） 、0.10 mL NADH溶液（A.3.8） 、0.02 mL蘋果酸脫氫酶（MDH）和乳酸脫氫酶（LDH）懸濁液（A.3.10） ，搖勻。在20 25 水浴鍋（A.4.7）中保持5 min，用水定容至5.00 mL。其中一組用1 cm比色皿（A.4.6） ，以空氣作參比，在波長(zhǎng)340 nm處測(cè)定各比色管內(nèi)溶液的吸光度A0。另一組各加入0.02 mL的檸檬酸鹽裂解酶（A.3.11） ，混勻，在20 25 水浴鍋（A.4.7）中保持10 min，用1 cm比色皿（A.4.6） ，以空氣作參比，在波長(zhǎng)340 nm處測(cè)定各比色管內(nèi)溶液的吸光度A10。根據(jù)（2）式計(jì)算吸光度A，以檸檬酸含量為縱坐標(biāo)，吸光度A為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 A=A0A10 （2） 式中： A0 檸檬酸鹽裂解酶添加前的吸光度； A10 檸檬酸鹽裂解酶添加后水浴10 min的吸光度。 注：如果吸光度降低超過(guò)0.800，用水溶液稀釋樣品和空白測(cè)試，重復(fù)A.6.2.1步驟。 A.6.2.2 試液吸光度的測(cè)定 用移液管吸取兩份2.00 mL試液（A.6.1） ，置于10 mL比色管(A.4.4)中。以下步驟同A.6.2.1中“各加入1.00 mL緩沖液（A.3.6）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線”操作，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的檸檬酸含量。同時(shí)做空白試驗(yàn)。 A.7 分析結(jié)果的表述 GB 220312010 4 樣品中檸檬酸的含量按式（A.2）計(jì)算。 X =423110000VVmVVc（3） 式中： X 樣品中檸檬酸的含量，單位為克每百克（g/100g） ； c標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的試液中檸檬酸的含量，單位為微克（g） ； m試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ； V1 試樣經(jīng)脫蛋白處理后的定容體積，單位為毫升（mL） ； V2 吸取濾液體積，單位為毫升（mL） ； V3 濾液定容體積，單位為毫升（mL） ； V4 吸取試液體積，單位為毫升（mL） 。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 A.8 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10 %。 GB 220312010 5 附 錄 B （規(guī)范性附錄） 干酪及加工干酪中乳糖含量的酶法測(cè)定 B.1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)適用于酶法測(cè)定干酪及加工干酪制品中的乳糖含量。 B.2 原理 在-半乳糖苷酶 （-GLS） 催化下， 乳糖被酶解為D-葡萄糖 （G） 和D-半乳糖 （GL） 。 己糖激酶 （HK）將D-葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖（G6P），同時(shí)將三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷（ADP）。受6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）催化，6-磷酸葡萄糖氧化為6-磷酸葡萄糖酸（GA6P），同時(shí)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NADP+） 被還原成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （NADPH） 。 在波長(zhǎng)340 nm處NADPH的吸光度值與乳糖含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。 C12H22O11（L） + H2O -GLS D-C6H12O6（G） + D-C6H12O6（GL） D-C6H12O6（G）+ ATP HK G6P + ADP G6P + NADP+ + H2O G6PDH GA6P + NADPH + H+ B.3 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法中所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 B.3.1 乳糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C12H22O11H2O） ，純度99 %。 B.3.2 亞鐵氰化鉀溶液(36 g/L)：稱取3.6 g亞鐵氰化鉀K4Fe(CN)63H2O，用水溶解，定容至100 mL，混勻。 B.3.3 硫酸鋅溶液（72 g/L） ：稱取7.2 g硫酸鋅（ZnSO47H2O） ，用水溶解，定容至100 mL，混勻。 B.3.4 硫酸溶液（2 mol/L） ：量取60 mL硫酸，緩緩注入適量水中，冷卻至室溫后用水稀釋至1000 L，混勻。 警告：稀釋濃硫酸時(shí)應(yīng)當(dāng)將硫酸緩慢加入水中，且不斷攪動(dòng)。否則會(huì)引起爆炸。 B.3.5 氫氧化鈉溶液（200 g/L） ：稱取20.0 g氫氧化鈉（NaOH） ，用水溶解，定容至100 mL，混勻。 B.3.6 氫氧化鈉溶液（4 g/L） ：稱取4.0 g氫氧化鈉（NaOH） ，用水溶解，定容至1000 mL，混勻。 B.3.7 硫酸銨溶液(422 g/L)：稱取42.2 g硫酸銨(NH4)2SO4，用水溶解，定容至100 mL，混勻。 B.3.8 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.6） ：分別稱取2.8 g檸檬酸鈉（C6H5O7Na32H2O） ，0.042 g檸檬酸（C6H8O7H2O）和0.635 g七水硫酸鎂（MgSO4 7H2O）溶于40 mL水中，用硫酸溶液（B.3.4）或者氫氧化鈉溶液（B.3.6）調(diào)節(jié)pH至6.60.1后，用水定容至50 mL，混勻后放置0 4 冰箱中貯藏，可保存三個(gè)月，使用前放置至室溫。 B.3.9 三乙醇胺（TEA）緩沖液（pH 7.6） ：分別稱取14.0 g鹽酸三乙醇胺（C6H15NO3HCl） ，0.25 g七水硫酸鎂（MgSO47H2O） ，用 80 mL水溶解，用氫氧化鈉溶液（B.3.5）調(diào)節(jié)pH至7.60.1后，定容至100 mL，混勻后放置0 4 冰箱中貯藏，可保持兩個(gè)月。 B.3.10 NADP+ATPTEA緩沖懸濁液：分別準(zhǔn)確稱取65 mg煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉（C21H26N7O17P3Na2）和170 mg 5-三磷酸腺苷二鈉鹽（C10H14N5O13P3Na2） ，溶于 30 mL的三乙醇胺緩沖液（B.3.9）中，混勻后放置0 4 冰箱中貯藏可保持兩周，使用前放置至室溫。 GB 220312010 6 B.3.11 -半乳糖苷酶-硫酸銨-GLS-(NH4)2SO4懸濁液(pH約為7.6)：將-半乳糖苷酶 (-GLS，埃希氏大腸桿菌，EC 3.2.1.23)溶于硫酸銨溶液（B.3.7）中，使-半乳糖苷酶的活性不低于60 IU/mL。緩慢攪勻成懸濁液后放置0 4 冰箱中，可保存12個(gè)月。使用時(shí)該懸濁液的容器應(yīng)浸入冰水中。 B.3.12 己糖激酶-6-磷酸葡萄糖脫氫酶硫酸銨HK-G6PDH-(NH4)2SO4懸濁液：將己糖激酶（HK，酵母，EC 2.7.1.1)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH，酵母，EC 1.1.1.49）溶于硫酸銨溶液（B.3.7）中，使己糖激酶活性不低于280 IU/mL（25 ） ，6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性不低于140 IU/mL（25 ） 。緩慢攪勻成懸濁液后放置0 4 冰箱中，可保存12個(gè)月。使用時(shí)該懸濁液的容器應(yīng)浸入冰水中。 B.3.13 乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（80 g/mL） ：精確稱取經(jīng)87 烘烤2 h至恒重的乳糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（B.3.1）0.842 g，溶于水中， 定容至100 mL， 搖勻。 準(zhǔn)確吸取1.00 mL上述溶液， 用水稀釋到100 mL， 即得濃度為80 g/mL乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。該溶液放置0 4 冰箱中，臨用前配制。 B.4 儀器和設(shè)備 B.4.1 天平：感量為0.1 mg。 B.4.2 定量濾紙：中速，直徑15 cm。 B.4.3 比色管：10 mL，帶蓋。 B.4.4 分光光度計(jì)：340 nm，1 cm比色皿。 B.4.5 水浴鍋：能在20 36 保溫。 B.5 分析步驟 B.5.1 試樣制備 取有代表性的樣品至少200 g，充分混勻，置于密閉的玻璃容器內(nèi)。 B.5.2 試液的制備 準(zhǔn)確稱取1 g樣品于燒杯。用溫水（40 50 ）溶解，玻璃棒攪拌，將燒杯中樣品完全轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，用水定容，混勻。加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液（B.3.2）、5 mL硫酸鋅溶液（B.3.3）和10 mL NaOH溶液（B.3.6），每次添加后充分混合溶液，用水定容至100 mL，混合均勻后靜置30 min。過(guò)濾，棄去開始的部分濾液。吸取5.00 mL濾液于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，即為試液。 B.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用微量移液管吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL(相當(dāng)于0,16,32,48,64,80g乳糖)乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（B.3.13），分別置于比色管（B.4.3）中，各加入0.20 mL檸檬酸鹽緩沖溶液（B.3.8）、0.05 mL-半乳糖苷酶-硫酸銨懸濁液(B.3.11)，搖勻，于水浴鍋（B.4.5）中恒溫15 min。取出后加入1.00 mL NADP+ATPTEA緩沖溶液（B.3.10），0.05 mL己糖激酶-6-磷酸葡萄糖脫氫酶硫酸銨懸濁液（B.3.12），搖勻，于水浴鍋（B.4.5）中恒溫60 min。取出后，冷卻至室溫，用水定容至5.00 mL，搖勻，放置5 min。用1 cm比色皿（B.4.4），以乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液含量為零的試劑溶液作參比，