GB5009.5-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定.pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9 .52 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.52 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B5 0 0 9.52 0 1 0 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定 、G B/T1 4 4 8 9.22 0 0 8 糧油檢 驗(yàn) 植 物 油 料 粗 蛋 白 質(zhì) 的 測(cè) 定 、G B/T1 5 6 7 32 0 0 9 食 用 菌 中 粗 蛋 白 含 量 的 測(cè) 定 、G B/T5 5 1 12 0 0 8 谷物和豆類 氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算 凱氏法 、G B/T9 6 9 5.1 12 0 0 8 肉與肉制品 氮含量測(cè)定 和G B/T9 8 2 32 0 0 8 糧油檢驗(yàn) 植物油料餅粕總含氮量的測(cè)定 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B5 0 0 9.52 0 1 0相比, 主要變化如下: 增加附錄A蛋白質(zhì)折算系數(shù)。G B5 0 0 9.52 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法和第二法適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定, 第三法適用于蛋白質(zhì)含量在1 0g/1 0 0g以上的糧食、 豆類奶粉、 米粉、 蛋白質(zhì)粉等固體試樣的測(cè)定。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于添加無(wú)機(jī)含氮物質(zhì)、 有機(jī)非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的食品的測(cè)定。第一法 凱氏定氮法2 原理食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解, 產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定, 根據(jù)酸的消耗量計(jì)算氮含量, 再乘以換算系數(shù), 即為蛋白質(zhì)的含量。3 試劑和材料3.1 試劑除非另有說(shuō)明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的三級(jí)水。3.1.1 硫酸銅(C u S O45 H2O) 。3.1.2 硫酸鉀(K2S O4) 。3.1.3 硫酸(H2S O4) 。3.1.4 硼酸(H3B O3) 。3.1.5 甲基紅指示劑(C1 5H1 5N3O2) 。3.1.6 溴甲酚綠指示劑(C2 1H1 4B r4O5S) 。3.1.7 亞甲基藍(lán)指示劑(C1 6H1 8C l N3S3H2O) 。3.1.8 氫氧化鈉(N a OH) 。3.1.9 9 5%乙醇(C2H5OH) 。3.2 試劑配制3.2.1 硼酸溶液(2 0g/L) : 稱取2 0g硼酸, 加水溶解后并稀釋至10 0 0m L。3.2.2 氫氧化鈉溶液(4 0 0g/L) : 稱取4 0g氫氧化鈉加水溶解后, 放冷, 并稀釋至1 0 0m L。3.2.3 硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(12H2S O4) 0 .0 5 00m o l/L或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(H C l) 0 .0 5 00m o l/L。3.2.4 甲基紅乙醇溶液(1g/L) : 稱取0.1g甲基紅, 溶于9 5%乙醇, 用9 5%乙醇稀釋至1 0 0m L。3.2.5 亞甲基藍(lán)乙醇溶液(1g/L) : 稱取0.1g亞甲基藍(lán), 溶于9 5%乙醇, 用9 5%乙醇稀釋至1 0 0m L。G B5 0 0 9.52 0 1 62 3.2.6 溴甲酚綠乙醇溶液(1g/L) : 稱取0.1g溴甲酚綠, 溶于9 5%乙醇, 用9 5%乙醇稀釋至1 0 0m L。3.2.7 A混合指示液:2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合。3.2.8 B混合指示液:1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。4 儀器和設(shè)備4.1 天平: 感量為1m g。4.2 定氮蒸餾裝置: 如圖1所示。4.3 自動(dòng)凱氏定氮儀。說(shuō)明:1 電爐;2 水蒸氣發(fā)生器(2L燒瓶) ;3 螺旋夾;4 小玻杯及棒狀玻塞;5 反應(yīng)室;6 反應(yīng)室外層;7 橡皮管及螺旋夾;8 冷凝管;9 蒸餾液接收瓶。圖1 定氮蒸餾裝置圖5 分析步驟5.1 凱氏定氮法5.1.1 試樣處理: 稱取充分混勻的固體試樣0.2g2g、 半固體試樣2g5g或液體試樣1 0g2 5g( 約當(dāng)于3 0m g 4 0m g氮) , 精確至0.0 0 1g, 移入干燥的1 0 0m L、2 5 0m L或5 0 0m L定氮瓶中, 加入0.4g硫酸銅、6g硫酸鉀及2 0m L硫酸, 輕搖后于瓶口放一小漏斗, 將瓶以4 5 角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱, 待內(nèi)容物全部碳化, 泡沫完全停止后, 加強(qiáng)火力, 并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸, 至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后, 再繼續(xù)加熱0.5h1h。取下放冷, 小心加入2 0m L水, 放冷后, 移入1 0 0m L容量瓶中, 并用少量水洗定氮瓶, 洗液并入容量瓶中, 再加水至刻度, 混勻備用。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。5.1.2 測(cè)定: 按圖1裝好定氮蒸餾裝置, 向水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3處, 加入數(shù)粒玻璃珠, 加甲基紅乙醇溶液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸, 以保持水呈酸性, 加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。5.1.3 向接受瓶?jī)?nèi)加入1 0.0m L硼酸溶液及1滴2滴A混合指示劑或B混合指示劑, 并使冷凝管的G B5 0 0 9.52 0 1 63 下端插入液面下, 根據(jù)試樣中氮含量, 準(zhǔn)確吸取2.0m L1 0.0m L試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室, 以1 0m L水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi), 隨后塞緊棒狀玻塞。將1 0.0m L氫氧化鈉溶液倒入小玻杯, 提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室, 立即將玻塞蓋緊, 并水封。夾緊螺旋夾, 開(kāi)始蒸餾。蒸餾1 0m i n后移動(dòng)蒸餾液接收瓶, 液面離開(kāi)冷凝管下端, 再蒸餾1m i n。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部, 取下蒸餾液接收瓶。盡快以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至終點(diǎn), 如用A混合指示液, 終點(diǎn)顏色為灰藍(lán)色; 如用B混合指示液, 終點(diǎn)顏色為淺灰紅色。同時(shí)做試劑空白。5.2 自動(dòng)凱氏定氮儀法稱取充分混勻的固體試樣0 .2g 2g、 半固體試樣2g 5g或液體試樣1 0g 2 5g( 約當(dāng)于3 0m g 4 0m g氮) , 精確至0.0 0 1g, 至消化管中, 再加入0.4g硫酸銅、6g硫酸鉀及2 0m L硫酸于消化爐進(jìn)行消化。當(dāng)消化爐溫度達(dá)到4 2 0之后, 繼續(xù)消化1h, 此時(shí)消化管中的液體呈綠色透明狀, 取出冷卻后加入5 0m L水, 于自動(dòng)凱氏定氮儀( 使用前加入氫氧化鈉溶液, 鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及含有混合指示劑A或B的硼酸溶液) 上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)加液、 蒸餾、 滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)的過(guò)程。6 分析結(jié)果的表述試樣中蛋白質(zhì)的含量按式(1) 計(jì)算:X=(V1-V2)c0.0 1 40mV3/1 0 0F1 0 0(1) 式中:X 試樣中蛋白質(zhì)的含量, 單位為克每百克(g/1 0 0g) ;V1 試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積, 單位為毫升(m L) ;V2 試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積, 單位為毫升(m L) ;c 硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度, 單位為摩爾每升(m o l/L) ;0.0 1 40 1.0m L硫酸c(12H2S O4)=1.0 0 0m o l/L 或鹽酸c(HC l)=1.0 0 0m o l/L 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量, 單位為克(g) ;m 試樣的質(zhì)量, 單位為克(g) ;V3 吸取消化液的體積, 單位為毫升(m L) ;F 氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù), 各種食品中氮轉(zhuǎn)換系數(shù)見(jiàn)附錄A;1 0 0 換算系數(shù)。蛋白質(zhì)含量1g/1 0 0g時(shí), 結(jié)果保留三位有效數(shù)字; 蛋白質(zhì)含量1g/1 0 0g時(shí), 結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。注:當(dāng)只檢測(cè)氮含量時(shí), 不需要乘蛋白質(zhì)換算系數(shù)F。7 精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的1 0%。第二法 分光光度法8 原理食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解, 分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨, 在p H4.8的乙G B5 0 0 9.52 0 1 64 酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5 -二乙酰- 2,6 -二甲基- 1,4 -二氫化吡啶化合物。在波長(zhǎng)4 0 0n m下測(cè)定吸光度值, 與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量, 結(jié)果乘以換算系數(shù), 即為蛋白質(zhì)含量。9 試劑和材料9.1 試劑除非另有說(shuō)明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的三級(jí)水。9.1.1 硫酸銅(C u S O45 H2O) 。9.1.2 硫酸鉀(K2S O4) 。9.1.3 硫酸(H2S O4) : 優(yōu)級(jí)純。9.1.4 氫氧化鈉(N a OH) 。9.1.5 對(duì)硝基苯酚(C6H5NO3) 。9.1.6 乙酸鈉(CH3C OON a3 H2O) 。9.1.7 無(wú)水乙酸鈉(CH3C OON a) 。9.1.8 乙酸(CH3C OOH) : 優(yōu)級(jí)純。9.1.9 3 7%甲醛(HCHO) 。9.1.1 0 乙酰丙酮(C5H8O2) 。9.2 試劑配制9.2.1 氫氧化鈉溶液(3 0 0g/L) : 稱取3 0g氫氧化鈉加水溶解后, 放冷, 并稀釋至1 0 0m L。9.2.2 對(duì)硝基苯酚指示劑溶液(1g/L) : 稱取0.1g對(duì)硝基苯酚指示劑溶于2 0m L9 5%乙醇中, 加水稀釋至1 0 0m L。9.2.3 乙酸溶液(1m o l/L) : 量取5.8m L乙酸, 加水稀釋至1 0 0m L。9.2.4 乙酸鈉溶液(1m o l/L) : 稱取4 1g無(wú)水乙酸鈉或6 8g乙酸鈉, 加水溶解稀釋至5 0 0m L。9.2.5 乙酸鈉-乙酸緩沖溶液: 量取6 0m L乙酸鈉溶液與4 0m L乙酸溶液混合, 該溶液p H4.8。9.2.6 顯色劑:1 5m L甲醛與7.8m L乙酰丙酮混合, 加水稀釋至1 0 0m L, 劇烈振搖混勻( 室溫下放置穩(wěn)定3 d) 。9.2.7 氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液( 以氮計(jì)) (1.0g/L) : 稱取1 0 5干燥2h的硫酸銨0.4 7 20g加水溶解后移于1 0 0m L容量瓶中, 并稀釋至刻度, 混勻, 此溶液每毫升相當(dāng)于1.0m g氮。9.2.8 氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(0.1g/L) : 用移液管吸取1 0.0 0m L氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于1 0 0m L容量瓶?jī)?nèi), 加水定容至刻度, 混勻, 此溶液每毫升相當(dāng)于0.1m g氮。1 0 儀器和設(shè)備1 0.1 分光光度計(jì)。1 0.2 電熱恒溫水浴鍋:1 0 00.5。1 0.3 1 0m L具塞玻璃比色管。1 0.4 天平: 感量為1m g。1 1 分析步驟1 1.1 試樣消解稱取充分混勻的固體試樣0.1g 0.5g( 精確至0.0 0 1g) 、 半固體試樣0.2g1g( 精確至0.0 0 1g)G B5 0 0 9.52 0 1 65 或液體試樣1g 5g( 精確至0.0 0 1g) , 移入干燥的1 0 0m L或2 5 0m L定氮瓶中, 加入0.1g硫酸銅、1g硫酸鉀及5m L硫酸, 搖勻后于瓶口放一小漏斗, 將定氮瓶以4 5 角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。緩慢加熱, 待內(nèi)容物全部炭化, 泡沫完全停止后, 加強(qiáng)火力, 并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸, 至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后,再繼續(xù)加熱0.5h。取下放冷, 慢慢加入2 0m L水, 放冷后移入5 0m L或1 0 0m L容量瓶中, 并用少量水洗定氮瓶, 洗液并入容量瓶中, 再加水至刻度, 混勻備用。按同一方法做試劑空白試驗(yàn)。1 1.2 試樣溶液的制備吸取2.0 0m L5.0 0m L試樣或試劑空白消化液于5 0m L或1 0 0m L容量瓶?jī)?nèi), 加1滴2滴對(duì)硝基苯酚指示劑溶液, 搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色, 再滴加乙酸溶液至溶液無(wú)色, 用水稀釋至刻度, 混勻。1 1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制吸取0.0 0m L、0.0 5m L、0.1 0m L、0.2 0m L、0.4 0m L、0.6 0m L、0.8 0m L和1.0 0m L氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液( 相當(dāng)于0.0 0g、5.0 0g、1 0.0g、2 0.0g、4 0.0g、6 0.0g、8 0.0g和1 0 0.0g氮) , 分別置于1 0m L比色管中。加4.0m L乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4.0m L顯色劑, 加水稀釋至刻度, 混勻。置于1 0 0水浴中加熱1 5m i n。取出用水冷卻至室溫后, 移入1c m比色杯內(nèi), 以零管為參比, 于波長(zhǎng)4 0 0n m處測(cè)量吸光度值, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點(diǎn)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算線性回歸方程。1 1.4 試樣測(cè)定吸取0.5 0m L2.0 0m L( 約相當(dāng)于氮1 0 0g) 試樣溶液和同量的試劑空白溶液, 分別于1 0m L比色管中。加4.0m L乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4.0m L顯色劑, 加水稀釋至刻度, 混勻。置于1 0 0水浴中加熱1 5m i n。取出用水冷卻至室溫后, 移入1c m比色杯內(nèi), 以零管為參比, 于波長(zhǎng)4 0 0n m處測(cè)量吸光度值, 試樣吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。1 2 分析結(jié)果的表述試樣中蛋白質(zhì)的含量按式(2) 計(jì)算:X=(C-C0)V1V3mV2V410 0 010 0 01 0 0F(2) 式中:X 試樣中蛋白質(zhì)的含量, 單位為克每百克(g/1 0 0g) ;C 試樣測(cè)定液中氮的含量, 單位為微克(g) ;C0 試劑空白測(cè)定液中氮的含量, 單位為微克(g) ;V1 試樣消化液定容體積, 單位為毫升(m L) ;V3 試樣溶液總體積, 單位為毫升(m L) ;m 試樣質(zhì)量, 單位為克(g) ;V2 制備試樣溶液的消化液體積, 單位為毫升(m L) ;V4 測(cè)定用試樣溶液體積, 單位為毫升(m L) ;10 0 0 換算系數(shù);1 0 0 換算系數(shù);F 氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。蛋白質(zhì)含量1g/1 0 0g時(shí), 結(jié)果保留三位有效數(shù)字; 蛋白質(zhì)含量1g/1 0 0g時(shí), 結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。G B5 0 0 9.52 0 1 66 1 3 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的1 0%。第三法 燃燒法1 4 原理試樣在9 0 012 0 0高溫下燃燒, 燃燒過(guò)程中產(chǎn)生混合氣體, 其中的碳、 硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收, 氮氧化物被全部還原成氮?dú)? 形成的氮?dú)鈿饬魍ㄟ^(guò)熱導(dǎo)檢測(cè)器(T C D) 進(jìn)行檢測(cè)。1 5 儀器和設(shè)備1 5.1 氮/蛋白質(zhì)分析儀。1 5.2 天平: 感量為0.1m g。1 6 分析步驟按照儀器說(shuō)明書(shū)要求稱取0.1g 1.0g充分混勻的試樣( 精確至0.0 0 01g) , 用錫箔包裹后置于樣品盤(pán)上。試樣進(jìn)入燃燒反應(yīng)爐(9 0 012 0 0) 后, 在高純氧(9 9.9 9%) 中充分燃燒。燃燒爐中的產(chǎn)物(NOx) 被載氣二氧化碳或氦氣運(yùn)送至還原爐(8