GB5009.245-2016食品安全國家標準食品中聚葡萄糖的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 6食品安全國家標準食品中聚葡萄糖的測定2 0 1 6 - 0 8 - 3 1發(fā)布2 0 1 7 - 0 3 - 0 1實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā) 布G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 61 食品安全國家標準食品中聚葡萄糖的測定1 范圍本標準規(guī)定了食品中聚葡萄糖的測定方法。本標準適用于食品中添加的聚葡萄糖的測定。2 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1 聚葡萄糖 (C6H1 0O5)n由葡萄糖、 山梨糖醇和檸檬酸( 或磷酸) 按一定比例混合, 在高溫下加熱聚合并精制、 干燥而成的多聚體, 平均聚合度1 2。屬于可溶性膳食纖維。3 原理食品中聚葡萄糖經(jīng)熱水浸提、 超濾離心后, 濾液經(jīng)酶解去除淀粉、 果聚糖等干擾物后, 再用離子色譜-脈沖安培檢測器定量測定聚葡萄糖含量。4 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。4.1 試劑4.1.1 氫氧化鈉溶液(5 0%) : 色譜純, 離子色譜專用。4.1.2 冰乙酸(CH3C OOH) 。4.1.3 三水合乙酸鈉(CH3C OON a3 H2O) 。4.1.4 無水乙酸鈉(CH3C OON a) 。4.1.5 果聚糖酶(f r u c t a n a s e) :20 0 0U/m L。4.1.6 淀粉葡糖苷酶(Am y l o g l u c o s i d a s e) :32 6 0U/m L( 可溶性淀粉) ;2 0 0U/m L( 對硝基酚-麥芽糖苷,p - N P -m a l t o s i d e) 。4.1.7 異淀粉酶(I s o a m y l a s e) :10 0 0U/m L。4.2 試劑配制4.2.1 乙酸溶液(0.2m o l/L) : 準確吸取1.2m L冰乙酸, 用水稀釋至1 0 0m L。4.2.2 乙酸鈉溶液(0.2m o l/L) : 準確稱取2.7 2g三水合乙酸鈉, 用水溶解并稀釋至1 0 0m L。4.2.3 乙酸鹽緩沖液(p H為4.5) : 將2 8m L乙酸溶液(0.2m o l/L) 與2 2m L乙酸鈉溶液(0.2m o l/L) 混G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 62 合, 用水稀釋至1 0 0m L。4.2.4 混合酶液: 分別吸取6 8 0L果聚糖酶、8 4L淀粉葡糖苷酶、1 7L異淀粉酶混合, 加乙酸鹽緩沖液稀釋至2 0m L?；旌厦敢号R用現(xiàn)配。4.3 流動相4.3.1 流動相A( 含0.1 5m o l/L氫氧化鈉) :準確吸取1 5.7m L氫氧化鈉溶液(5 0%) , 用預(yù)先脫氣的水稀釋2L, 惰性氣體保護。4.3.2 流動相B( 含0.1 5m o l/L氫氧化鈉,0.5 0m o l/L乙酸鈉) : 準確稱量4 1g無水乙酸鈉( 或6 8g三水合乙酸鈉) , 用流動相A溶解定容至1L, 混勻, 過0.4 5m膜, 脫氣。注:配制流動相時, 去離子水需預(yù)先脫氣0.5h, 定容后的流動相混勻時倒置混勻56次, 不可劇烈振搖。配好的流動相沿儲液瓶壁緩緩倒入, 脫氣0.5h后惰性氣體保護。4.4 參考物質(zhì)聚葡萄糖 (C6H1 0O5)n : 純度大于9 0%,C A S:6 8 4 2 4 - 0 4 - 4。注:為保證結(jié)果的準確性, 如能確定添加的聚葡萄糖來源, 應(yīng)選用食品中添加的聚葡聚糖同源的參考物質(zhì), 并達到F C C級。4.5 參考物質(zhì)溶液的配制4.5.1 參考物質(zhì)儲備液(2.0 0m g/g) : 準確稱取0.2 0g聚葡萄糖參考物質(zhì)( 精確至0.0 0 01g) 至已預(yù)先稱重的1 0 0m L具螺口塞的試樣瓶中( 精確至0.0 0 1g) 。加入約1 0 0g預(yù)熱至8 0的去離子水, 擰緊螺口塞, 渦旋振蕩3 0s, 將試樣瓶置于8 0水浴1 0m i n, 每隔5m i n振蕩一次, 以使聚葡萄糖充分溶解, 取出試樣瓶, 冷卻至室溫, 稱重( 精確至0.0 0 1g) 。參考物質(zhì)儲備液于4保存, 有效期1個月。4.5.2 參考物質(zhì)中間液: 分別精確稱量1 0.0g、7.5 0g、5.0 0g、3.7 5g、2.5 0g、1.5 0g參考物質(zhì)儲備液( 精確至0.0 0 01g) 加水至2 0.0g( 精確至0.0 0 01g) , 得到濃度為1.0 0 0m g/g、0.7 5 0m g/g、0.5 0 0m g/g、0.3 7 5m g/g、0.2 5 0m g/g、0.1 5 0m g/g的參考物質(zhì)中間液。4.5.3 參考物質(zhì)工作液: 取2m L離心管, 稱量( 精確至0.0 0 01g) , 精確稱量參考物質(zhì)中間液0.2 0g( 精確至0.0 0 01g) 轉(zhuǎn)移至已稱重的離心管中, 加入酶混合液0.8m L, 稱量( 精確至0.0 0 01g) , 振蕩混合均勻, 于5 0水浴6 0m i n, 沸水浴1 0m i n, 取出, 冰浴5m i n, 于1 00 0 0r/m i n離心1 0m i n。上清液過0.2 2m濾膜, 進樣分析, 得到 濃度分別為2 0 0g/g、1 5 0g/g、1 0 0g/g、7 5. 0g/g、5 0. 0g/g、3 0.0g/g的參考物質(zhì)工作液系列, 進樣分析。以此6點參考物質(zhì)工作液上機獲得工作曲線, 其回歸方程的決定系數(shù)(R2值) 應(yīng)不小于0.9 9 5。5 儀器與設(shè)備5.1 分析天平: 感量分別為1m g,0.1m g。5.2 恒溫水浴箱: 控溫精度1。5.3 高速離心機: 轉(zhuǎn)速1 00 0 0r/m i n。5.4 渦旋振蕩器。5.5 微量可調(diào)移液器:2 0L2 0 0L、2 0 0L10 0 0L。5.6 針筒式過濾器: 孔徑0.2 2m。5.7 超濾離心設(shè)備:1 0 00 0 0D a分子截留, 聚醚砜膜,0.5m L容積。5.8 磁力攪拌器: 帶攪拌子。5.9 離子色譜儀:配備脈沖安培檢測器、 梯度泵。G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 63 6 操作步驟6.1 試樣處理6.1.1 固體試樣: 研磨、 粉碎, 分析前密閉保存, 避免水分變化。6.1.2 液體試樣: 測定前需混合搖勻。6.2 聚葡萄糖提取6.2.1 固體試樣: 取1 0 0m L具塞試樣瓶, 加入1粒磁力攪拌子, 蓋上螺口塞, 稱量( 精確至0.0 0 1g) , 記為m1。準確稱取一定量試樣( 約含聚葡萄糖0.0 5g, 精確至0.0 0 01g, 記為m2) 至試樣瓶中, 加1 0 0m L預(yù)熱至8 0的水, 磁力攪拌3 0s,8 0水浴1 0m i n, 每5m i n磁力攪拌3 0s。取出試樣瓶冷卻至室溫后稱量( 精確至0.0 0 1g) , 記為m3。6.2.2 液體試樣( 飲料、 液態(tài)奶等) : 取1 0 0m L具塞試樣瓶, 稱量( 精確至0.0 0 1g) , 記為m1。準確吸取一定量試樣( 約含聚葡萄糖0.0 5g, 精確至0.0 0 01g, 記為m2) 至試樣瓶中, 加1 0 0m L水, 振蕩混合均勻, 稱量( 精確至0.0 0 1g) , 記為m3。6.2.3 適量吸取樣液至2.0m L的離心管中,1 00 0 0r/m i n離心1 5m i n, 取上清液過0.2 2m濾膜, 取0.4 5m L濾液加入1.5m L帶有分子截留膜的離心管中, 于1 00 0 0r/m i n超濾離心3 0m i n。注意觀察是否離心完全及離心液的澄清度, 如截留膜上方留有樣液或離心液混濁, 可加大轉(zhuǎn)速、 延長離心時間, 或增加稀釋倍數(shù)(F) 。6.3 酶解6.3.1 取2m L離心管, 稱量( 精確至0.0 0 01g) , 記為m4。6.3.2 吸取0.2 m L超濾離心液加入離心管中, 稱量( 精確至0.0 0 01g) , 記為m5; 加入酶混合液0.8m L,稱量( 精確至0.0 0 01g) , 記為m6; 振蕩混合均勻, 于5 0水浴6 0m i n, 沸水浴1 0m i n, 取出,冰浴5m i n, 于1 00 0 0r/m i n離心1 0m i n。上清液過0.2m濾膜, 進樣分析。上清液需在7 2h內(nèi)檢測。6.4 色譜參考條件檢測條件見附錄B。6.5 分析結(jié)果的表述試樣中聚葡萄糖含量按式(1) 計算:X=Fcm6-m4m5-m4m3-m1m21 0 01 06(1) 式中:X 試樣中聚葡萄糖的含量, 單位為克每百克(g/1 0 0g) ; 由標準曲線計算得到的聚葡萄糖的濃度, 單位為微克每克(g/g) ;F 稀釋倍數(shù);c 聚葡萄糖參考物質(zhì)的純度,%;m6 離心管、 酶解樣液、 混合酶液的總質(zhì)量, 單位為克(g) ;m4 空離心管質(zhì)量, 單位為克(g) ;m5 離心管、 用于酶解樣液總質(zhì)量, 單位為克(g) ;m3 加水后試樣瓶總質(zhì)量, 單位為克(g) ;m1 試樣瓶總質(zhì)量, 單位為克(g) ;G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 64 m2 試樣質(zhì)量, 單位為克(g) ;1 0 0 將結(jié)果表示為百分含量的系數(shù);1 06 微克(g) 與克(g) 的轉(zhuǎn)換系數(shù)。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示, 結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 0%。8 其他最小稱樣量為5g時, 固體試樣檢出限為0.2m g/1 0 0g, 定量限為0.5m g/1 0 0g; 液體試樣為檢出限為0.1 5m g/1 0 0g, 定量限為0.5m g/1 0 0g。G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 65 附 錄 A酶活性測定A.1 果聚糖酶酶活力測定方法A.1.1 原理在p H4.5, 溫度4 0, 底物( 蔗果三糖) 濃度為1 0mm o l/L的標準條件下,1m i n釋放1m o l果糖所需的酶量為1U。A.1.2 試劑和溶劑A.1.2.1 乙酸(0.2m o l/L) : 準確吸取1 2m L冰乙酸, 用水稀釋至10 0 0m L。A.1.2.2 乙酸鈉溶液(0.2m o l/L) : 準確稱取2 7.2g三水合乙酸鈉, 用水溶解并稀釋至10 0 0m L。A.1.2.3 乙酸鹽緩沖液(p H為4 .5) : 將2 8 0m L乙酸溶液(0 .2m o l/L) 與2 2 0m L乙酸鈉溶液(0.2m o l/L)混合, 用水稀釋至10 0 0m L。A.1.2.4 氫氧化鈉溶液(2m o l/L) : 準確稱取8 0g氫氧化鈉, 用水溶解并稀釋至10 0 0m L。A.1.2.5 3,5 -二硝基水楊酸試劑(D N S) : 將6.3g3,5 -二硝基水楊酸試劑和2 6 2m L2m o l/LN a OH溶液, 加到5 0 0m L含有1 8 5g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中, 再加5g苯酚和5g亞硫酸鈉, 攪拌溶解, 冷卻后加蒸餾水定容至10 0 0m L, 貯于棕色瓶中備用。A.1.2.6 果糖標準液(1m g/m L) : 準確稱取8 0烘至恒重的分析純果糖1 0 0m g, 置于小燒杯中, 加少量乙酸鹽緩沖液溶解后, 轉(zhuǎn)移到1 0 0m L容量瓶中, 用乙酸鹽緩沖液定容至1 0 0m L, 混勻,4冰箱中保存?zhèn)溆?。A.1.2.7 蔗果三糖溶液(1 0 mm o l/L) : 精確稱取5.0 4g蔗果三糖, 用乙酸鹽緩沖液溶解并稀釋至10 0 0m L。A.1.3 儀器A.1.3.1 分析天平。A.1.3.2 電熱恒溫水浴鍋。A.1.3.3 可見光分光光度計。A.1.3.4 計時器。A.1.4 分析步驟A.1.4.1 果糖標準曲線的繪制吸取乙酸鹽緩沖液4.0m L至2 5m L刻度試管中, 加入D N S試劑5.0m L, 沸水浴加入5m i n, 冷卻至室溫, 用水定容至2 5m L, 制成標準空白樣。分別吸取果糖標準液1.0 0m L、2.0 0m L、3.0 0m L、4.0 0m L、5.0 0m L、6.0 0m L、7.0 0m L于1 0 0m L容量瓶中, 用乙酸鹽緩沖液定容至1 0 0 m L, 配制成濃度0.1 0 m g/m L、0.2 0 m g/m L、0.3 0 m g/m L、0.4 0m g/m L、0.5 0 m g/m L、0.6 0 m g/m L、0.7 0 m g/m L果糖標準使用液, 吸取果糖標準使用液各2.0m L,分別加入到2 5m L刻度試管中, 再分別加入2.0m L乙酸鹽緩沖液和5.0m LD N S試劑。將各管搖勻, 在沸水浴中準確加熱5m i n, 取出, 冷卻至室溫, 加水定容至2 5m L, 加塞后顛倒混勻, 放置3 0m i n,以標準空白液為對照調(diào)零, 在5 4 0n m處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標, 果糖含量(m g)G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 66 為橫坐標, 繪制標準曲線。A.1.4.2 待測酶溶液的配制稱取測試酶樣品, 用乙酸鹽緩沖液進行稀釋、 定容( 稀釋后的酶液中果聚糖酶活力在0.0 4U/m L0.0 8U/m L之間) 。A.1.4.3 測定步驟吸取1 0.0m L蔗果三糖溶液,4 0平衡2 0m i n。吸取1 0.0m L待測酶液,4 0平衡2 0m i n。吸取2.0 0m L平衡后待測酶液, 加入到2 5m L刻度試管中, 再加入5.0m LD N S試劑, 混勻, 然后加入2.0m L平衡后的蔗果三糖溶液,4 0 平衡3 0m i n, 沸水浴加熱5m i n, 冷卻至室溫, 加水定容至2 5m L,加塞后顛倒混勻, 放置3 0m i n, 以標準空白液為對照調(diào)零, 在5 4 0n m處測定吸光度值A(chǔ)B。吸取2.0m L平衡后的待測酶液, 加入到2 5m L刻度試管中, 加入2.0m L平衡后的蔗果三糖溶液,混勻4 0平衡3 0m i n, 然后再加入5.0m LD N S試劑, 混勻以終止反應(yīng), 沸水浴加熱5m i n, 冷卻至室溫, 用水定容至2 5m L, 加塞后顛倒混勻, 放置3 0m i n, 以標準空白液為對照調(diào)零, 在5 4 0n m處測定吸光度值A(chǔ)E。A.1.5 酶活力計算果聚糖酶的酶活力按式(A.1) 計算:XD= (AE-AB)K+C0Mt10 0 0(A.1) 式中:XD 待測酶液的果聚糖酶活力, 單位為活力單位每毫升(U/m L) ;AE 酶反應(yīng)液的吸光度;AB 酶空白液的吸光度;K 標準曲線的斜率;C0 標準曲線的截距;M 果糖的摩爾質(zhì)量,M(C6H1 2O6)=1 8 0.2g/m o l;t 酶解反應(yīng)的時間, 單位為分(m i n) ;10 0 0 換算系數(shù)。A.2 異淀粉酶酶活力測定方法A.2.1 原理在p H4.0, 溫度4 0, 底物( 牡蠣糖,o y s t e rg l y c o g e n) 濃度為1 0m g/m L的標準條件下,1m i n釋放出1m o l還原糖當量( 以葡萄糖計) 所需要的酶量為1U。A.2.2 試劑和溶劑A.2.2.1 乙酸鹽緩沖液(p H為4.0) : 稱取5 4.4g三水和乙酸鈉(CH3C OON a3 H2O) , 溶于水, 加9 2m L乙酸( 冰醋酸) , 稀釋至10 0 0m L。A.2.2.2 氫氧化鈉溶液(2m o l/L) : 準確稱取8 0g氫氧化鈉, 用水溶解并稀釋至10 0 0m L。A.2.2.3 3,5 -二硝基水楊酸試劑(D N S) : 將6.3g3,5 -二硝基水楊酸試劑和2 6 2m L氫氧化鈉溶液, 加到5 0 0m L含有1 8 5g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中, 再加5g苯酚和5g亞硫酸鈉, 攪拌溶解, 冷卻后加蒸G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 67 餾水定容至10 0 0m L, 貯于棕色瓶中備用。A.2.2.4 葡萄糖標準液(1m g/m L) : 稱取無水葡萄糖1 0 0m g, 加乙酸鹽緩沖液溶解, 定容至1 0 0m L。A.2.2.5 牡蠣糖溶液(1 0m g/m L) : 精確稱取1.0g牡蠣糖, 用乙酸鹽緩沖液溶解并稀釋至1 0 0m L。A.2.3 儀器A.2.3.1 分析天平。A.2.3.2 電熱恒溫水浴鍋。A.2.3.3 分光光度計。A.2.3.4 計時器。A.2.4 分析步驟A.2.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制吸取乙酸鹽緩沖液4.0m L至2 5m L刻度試管中, 加入D N S試劑5.0m L, 沸水浴加入5m i n, 冷卻至室溫, 用水定容至2 5m L, 制成標準空白樣。分別吸取葡萄糖標準液1.0 0m L、2.0 0m L、3.0 0m L、4.0 0m L、5.0 0m L、6.0 0m L、7.0 0m L于1 0 0m L容量瓶中, 用乙酸鹽緩沖液定容至1 0 0m L, 配制成濃度0 .1 0m g/m L、0 .2 0m g/m L、0 .3 0m g/m L、0 .4 0m g/m L、0.5 0m g/m L、0.6 0m g/m L、0.7 0m g/m L葡萄糖標準使用液, 吸取葡萄糖標準使用液各2.0m L,分別加入到2 5m L刻度試管中, 再分別加入2.0m L乙酸鹽緩沖液和5.0m LD N S試劑。將各管搖勻, 在沸水浴中準確加熱5m i n, 取出, 冷卻至室溫, 加水定容至2 5m L, 加塞后顛倒混勻, 放置3 0m i n,以標準空白液為對照調(diào)零, 在5 4 0n m處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標, 葡萄糖含量(m g) 為橫坐標, 繪制標準曲線。A.2.4.2 待測酶溶液的配制稱取測試酶樣品, 用乙酸鹽緩沖液進行稀釋、 定容( 稀釋后的酶液中果聚糖酶活力在0.0 4U/m L0.0 8U/m L之間) 。A.2.4.3 測定步驟吸取1 0.0m L牡蠣糖溶液,4 0平衡2 0m i n。吸取1 0.0m L待測酶液,4 0平衡2 0m i n。吸取2.0m L平衡后待測酶液, 加入到2 5m L刻度試管中, 再加入5.0m LD N S試劑, 混勻, 然后加入2.0m L平衡后的牡蠣糖溶液,4 0平衡3 0m i n, 沸水浴加熱5m i n, 冷卻至室溫, 加水定容至2 5m L,加塞后顛倒混勻, 放置3 0m i n, 以標準空白液為對照調(diào)零, 在5 4 0n m處測定吸光度值A(chǔ)B。吸取2.0m L平衡后的待測酶液, 加入到2 5m L刻度試管中, 加入2.0m L平衡后的牡蠣糖溶液, 混勻4 0平衡3 0m i n, 然后再加入5.0m LD N S試劑, 混勻以終止反應(yīng), 沸水浴加熱5m i n, 冷卻至室溫,加水定容至2 5m L, 加塞后顛倒混勻, 放置3 0m i n, 以標準空白液為對照調(diào)零, 在5 4 0n m處測定吸光度值A(chǔ)E。A.2.5 酶活力計算異淀粉酶的酶活力按式(A.2) 計算:XD= (AE-AB)K+C0Mt10 0 0(A.2)G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 68 式中:XD 待測酶液的異淀粉酶活力, 單位為活力單位每毫升(U/m L) ;AE 酶反應(yīng)液的吸光度;AB 酶空白液的吸光度;K 標準曲線的斜率;C0 標準曲線的截距;M 葡萄糖的摩爾質(zhì)量,M(C6H1 2O6)=1 8 0.2g/m o l;t 酶解反應(yīng)的時間, 單位為分(m i n) ;10 0 0 換算系數(shù)。A.3 淀粉葡糖苷酶酶活力測定方法A.3.1 以可溶性淀粉為底物的酶活力以可溶性淀粉為底物的酶活力測定參照G B1 8 8 6.1 7 42 0 1 6 食品安全國家標準 食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑 附錄A.2-淀粉酶活力的測定。A.3.2 以對硝基酚-麥芽糖苷為底物的酶活力A.3.2.1 原理在p H4.5, 溫度為4 0, 底物( 對硝基酚-麥芽糖苷) 濃度為1 0mm o l/L, 有過量-葡糖苷酶存在的標準條件下, 每分鐘從對硝基酚-麥芽糖苷釋放出1m o l對硝基酚(p - N P) 所需要的酶量為1U。A.3.2.2 試劑和溶劑A.3.2.2.1 乙酸(0.2m o l/L) : 準確吸取1 2m L冰乙酸, 用水稀釋至10 0 0m L。A.3.2.2.2 乙酸鈉溶液(0.2m o l/L) : 準確稱取2 7.2g三水合乙酸鈉, 用水溶解并稀釋至10 0 0m L。A.3.2.2.3 乙酸鹽緩沖液(p H為4.5) : 將2 8 0 m L乙酸溶液(0.2 m o l/L) 與2 2 0 m L乙酸鈉溶液(0.2m o l/L)混合, 用水稀釋至10 0 0m L。A.3.2.2.4 碳酸鈉溶液(1m o l/L) : 準確稱取1 0 5.9g碳酸鈉, 用水溶解并稀釋至10 0 0m L。A.3.2.2.5 對硝基酚標準液(1m g/m L) : 稱取對硝基酚1 0 0m g, 加乙酸鹽緩沖液溶解, 定容至1 0 0m L。A.3.2.2.6 -葡糖苷酶溶液: 用乙酸鹽緩沖液進行稀釋、 定容( 稀釋后的酶液中-葡糖苷酶活力在2U/m L4U/m L之間) 。A.3.2.2.7 對硝基酚-麥芽糖苷溶液(1 0mm o l/m L) : 準確稱取4.6 3g對硝基酚-麥芽糖苷, 用-葡糖苷酶溶液溶解并稀釋至10 0 0m L。A.3.2.3 儀器A.3.2.3.1 分析天平。A.3.2.3.2 電熱恒溫水浴鍋。A.3.2.3.3 分光光度計。A.3.2.3.4 計時器。A.3.2.4 分析步驟A.3.2.4.1 對硝基苯標準曲線的繪制吸取乙酸鹽緩沖液2.0m L, 加入1.0m L碳酸鈉溶液, 混勻, 制成標準空白樣。G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 69 分別吸取對硝基酚標準液1.0 0m L、2.0 0m L、3.0 0m L、4.0 0m L、5.0 0m L、6.0 0m L、7.0 0m L, 分別用乙酸鹽緩沖液定容至1 0 0 m L, 配制成濃度0.1 0m g/m L、0.2 0m g/m L、0.3 0m g/m L、0.4 0m g/m L、0.5 0m g/m L、0.6 0m g/m L、0.7 0m g/m L對硝基酚標準使用液, 吸取對硝基酚標準使用液各1m L, 分別加入到5m L刻度試管中, 再分別加入1.0m L乙酸鹽緩沖液和1.0m L碳酸鈉溶液, 以標準空白液為對照調(diào)零, 在4 0 0n m處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標, 對硝基酚含量(m g) 為橫坐標, 繪制標準曲線。A.3.2.4.2 待測酶溶液的配制稱取測試酶樣品, 用乙酸鹽緩沖液進行稀釋、 定容( 稀釋后的酶液中-葡糖苷酶活力在2U/m L4U/m L之間 ) 。A.3.2.4.3 測定步驟吸取1 0.0m L對硝基酚-麥芽糖苷溶液,4 0平衡2 0m i n。吸取1 0.0m L待測酶液,4 0平衡2 0m i n。吸取1.0m L平衡后待測酶液, 加入到5m L刻度試管中, 再加入1.0m L碳酸鈉溶液, 混勻, 然后加入1.0m L平衡后的對硝基酚-麥芽糖苷溶液,4 0平衡1 0m i n, 室溫放置5m i n, 以標準空白液為對照調(diào)零, 在4 0 0n m處測定吸光度值A(chǔ)B。吸取1.0m L平衡后待測酶液, 加入到5m L刻度試管中, 再加入1.0m L平衡后的對硝基酚-麥芽糖苷溶液, 混勻,4 0平衡1 0m i n, 然后加入1.0m L碳酸鈉溶液, 室溫放置5m i n, 以標準空白液為對照調(diào)零, 在4 0 0n m處測定吸光度值A(chǔ)E。A.3.2.5 酶活力計算葡糖苷酶的酶活力按式(A.3) 計算:XD= (AE-AB)K+C0Mt10 0 0(A.3) 式中:XD 待測酶液的淀粉葡糖苷酶活力, 單位為活力單位每毫升(U/m L) ;AE 酶反應(yīng)液的吸光度;AB 酶空白液的吸光度;K 標準曲線的斜率;C0 標準曲線的截距;M 對硝基酚的摩爾質(zhì)量,M(C6H5NO3)=1 3 6.1 1g/m o l;t 酶解反應(yīng)的時間, 單位為分(m i n) ;10 0 0 換算系數(shù)。G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 61 0 附 錄 B色譜參考條件B.1 四電位離子色譜檢測條件B.1.1 離子色譜條件分析柱:C a r b o P aP A 1( 粒徑1 0m,2 5 0mm2mm) ; 保護柱:C a r b o P aP A 1( 粒徑1 0m,5 0mm2mm) ,或等效柱。進樣量:2 0