DB51T 659-2007 牛奶中青霉素殘留檢測方法-酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法.doc

NY DB四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2007-05-01實(shí)施2007-03-17發(fā)布牛奶中青霉素殘留檢測方法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法Determination of Residues Penicillins in Milk by Enzyme-linked Immunosorbent AssayDB51/T 6592007四川省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS：65.020.30備案號：1DB51/T6592007目 次前言II1 范圍32 規(guī)范性引用文件33 制樣33.1 樣品的制備33.2 樣品的保存34 測定方法34.1 方法提要或原理34.2 試劑和材料34.3 儀器和設(shè)備44.4 測定步驟44.5 結(jié)果計(jì)算和表述45 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度55.1 靈敏度55.2 準(zhǔn)確度55.3 精密度5I前 言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.12000 標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則進(jìn)行編制本標(biāo)準(zhǔn)由四川省畜牧食品局提出并歸口本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省獸藥殘留監(jiān)控中心、四川省獸藥監(jiān)察所本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊松沛、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艷麗、王海波、吳曉嵐牛奶中青霉素殘留檢測方法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛奶中青霉素殘留量檢測的制樣和酶聯(lián)免疫吸附測定法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛奶中青霉素的殘留量的快速篩選檢測。對于可疑樣品需用確證法確認(rèn)。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 1.1-2000 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ)GB/T 6682-1992 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法農(nóng)牧發(fā)20031號 獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范（試行）3 制樣3.1 樣品的制備 取適量新鮮的空白或供試牛奶，渦旋混合使之均勻，密封。3.2 樣品的保存-20以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩? 測定方法4.1 方法提要或原理牛奶中殘留的青霉素用PB緩沖液提取，酶聯(lián)免疫吸附測定法測定,其基本原理是抗原抗體反應(yīng)。酶標(biāo)板的微孔包被有偶聯(lián)抗原，標(biāo)樣或樣品中的青霉素與酶標(biāo)記抗原競爭青霉素特異性抗體。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)記抗原。加入底物液，結(jié)合到板上的酶標(biāo)記物將底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。加入終止液，在450nm處測定吸光度值，吸光度值與試樣中青霉素濃度呈反比。 4.2 試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水。 4.2.1 正己烷4.2.2 PB緩沖液的配制 稱取51.6gNa2HPO4.12H2O和8.7gNaH2PO4.2H2O，用1000mL水溶解（pH=7.2）即可。4.2.3 青霉素試劑盒（采用官方備案的試劑盒）4.2.6.1 青霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 0mg/mL 、0.1mg/mL、0.3mg/ml、0.9mg/mL、2.7mg/mL、8.1mg/mL4.2.6.2 酶標(biāo)板 8條12孔，包被有偶聯(lián)抗原4.2.6.3 酶標(biāo)記物4.2.6.4 青霉素抗體 4.2.6.5 底物溶液A4.2.6.6 底物溶液B4.2.6.7 濃縮洗滌液 臨用前用水稀釋二十倍作為洗滌液4.2.6.8 終止溶液4.3 儀器和設(shè)備4.3.1 酶標(biāo)儀（配備450nm濾光片）4.3.2 天平 感量0.01g4.3.3 分析天平 感量0.00001g4.3.4 漩渦混合儀4.3.5 振蕩器4.3.6 組織勻漿機(jī)4.3.7 冷凍離心機(jī)4.3.8 氮吹儀4.3.9 離心管 20mL 4.3.10 微量移液器 單道20mL，50mL，100mL，1000mL；多道50250mL 4.4 測定步驟4.4.1 試料的制備試料的制備包括： 取混勻后的供試樣品,作為供試試料。 取混勻后的空白樣品,作為空白試料。 取混勻后空白樣品,添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為空白添加試料。4.4.2 提取和凈化精密量取1mL試料于離心管中，精密加入4mL0.1moL/LPB緩沖液(pH=7.2)，充分混合后加入5mL正己烷振蕩提取10min，于8000r/min15離心10min,取出下層液體50mL用于分析。4.4.3 樣品測定程序（2026條件下操作）4.4.3.1 使用前將試劑盒置于室溫（2026）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的酶標(biāo)板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于28。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均需做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。4.4.3.2 加入50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液到微孔底部，每孔再加入50mL青霉素抗體溶液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，37環(huán)境中反應(yīng)30min。4.4.3.3 倒出孔中液體，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。每孔加入250mL洗滌液，10s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。4.4.3.4 加入100mL酶標(biāo)記物到微孔底部，用蓋板膜封板，37環(huán)境中反應(yīng)30min。取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。4.4.3.5 加入50mL底物溶液A和50mL底物溶液B到微孔中，輕輕振蕩混勻37環(huán)境避光顯色15min。4.4.3.6 加入50mL終止液到微孔中，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測定每孔吸光度值（OD值）。4.5 結(jié)果計(jì)算和表述BB0所獲得的標(biāo)準(zhǔn)或樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比給出的吸光度值，以式（1.1）表示： 百分吸光度值= 100% 1.1 式中:B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的平均吸光度值；B0為零濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以X軸為標(biāo)準(zhǔn)溶液中青霉素濃度(mg/L)的自然對數(shù)，Y軸為百分吸光度值，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)的供試樣品的濃度（mg/L）可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。也可以求出回歸曲線的方程，計(jì)算未知樣品中青霉素的濃度。如果有專業(yè)計(jì)算機(jī)軟件可直接求出供試樣中青霉素的濃度。注：檢測結(jié)果小于2.0g/L時(shí)，可判為未檢出，大于2.0g/ L時(shí)，判為可疑