DB21T1687-2008生鮮肉中三聚氰胺的測(cè)定.doc

DB33/T 2005遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布2008-12-01實(shí)施2008-11-19發(fā)布生鮮肉中三聚氰胺的測(cè)定Determination of Melamine in Fresh MeatsDB21/T 16872008DB21遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS 65.120B 46備案號(hào)：1DB21/T 16872008前 言本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量及畜產(chǎn)品安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（沈陽）。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：王淑芬 張建勛 劉全 劉敬先 劉凱 楊希國(guó) 于家豐 王麗娜 田曉玲 曲韻坤。本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。I生鮮肉中三聚氰胺的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生鮮肉中三聚氰胺殘留檢測(cè)的制樣和酶聯(lián)免疫（ELISA）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉中三聚氰胺殘留檢測(cè)。本標(biāo)準(zhǔn)中的酶聯(lián)免疫法為篩選方法，篩選結(jié)果為陽性的樣品需要用仲裁法確證，高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法為定量方法，其中氣相色譜-質(zhì)譜法為仲裁法。酶聯(lián)免疫法定量限為0.20mg/kg，高效液相色譜法定量限為0.20mg/kg，氣相色譜-質(zhì)譜法定量限為0.10mg/kg。2 規(guī)范性引用文件下列文件的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法3 制樣3.1 試樣的制備從原始樣品中分取出約500g，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎、勻質(zhì)使均勻。3.2 試樣的保存-20以下貯存。4 酶聯(lián)免疫法4.1 原理本方法基于酶聯(lián)免疫法中的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定法原理，通過樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，除去未結(jié)合的三聚氰胺酶標(biāo)記物后，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)，加終止液后在450nm下讀取各微孔吸光度值。吸光度值與樣品中的三聚氰胺含量成反比。4.2 試劑和溶液4.2.1 除特殊注明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。水應(yīng)符合GB/T 6682二級(jí)水的規(guī)定。4.2.2 三聚氰胺試劑盒（附系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，酶標(biāo)記物，清洗液、底物，終止液，說明書）。4.2.3 異辛烷（C8H18）4.2.4 三氯甲烷（CHCl3）4.2.5 異辛烷+三氯甲烷混合液：準(zhǔn)確量取40ml異辛烷（4.2.3）和60ml三氯甲烷(4.2.4),混勻即得。4.2.6 10%甲醇/20mMPBS：稱取0.62gNaH2PO4H2O，5.73gNa2HPO412H2O和9gNaCl用蒸餾水溶解，并定容至1000mL，取此溶液900mL，加入100mL甲醇混勻即得。4.3 儀器和設(shè)備4.3.1 酶標(biāo)儀（帶450nm濾光片）。4.3.2 渦旋混合器。4.3.3 冷凍離心機(jī)。4.3.4 微量加樣器：20L、50L、100L、150L、250L。4.3.5 恒溫干燥箱。4.3.6 分析天平：感量0.01g。4.3.7 振蕩器4.3.8 絞肉機(jī)4.3.9 勻漿機(jī)4.4 測(cè)定步驟4.4.1 樣品處理準(zhǔn)確稱量2g試料（3.1）精確到0.01g，加入10mL 10%甲醇/20mMPBS（4.2.6），渦旋30s，振蕩5min，4000r/min離心5min，取2mL上清液加入2mL異辛烷+三氯甲烷混合液（4.2.5），混勻，4000r/min離心5min，靜置，取上層150L待測(cè)。4.4.2 測(cè)試程序取出欲測(cè)數(shù)量的微孔條安插在酶標(biāo)板上，分別吸取0g/L、20g/L、100g/L、250g/L、500g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.2.2）和試樣萃取液（4.4.1）各150L至包被有三聚氰胺抗體的對(duì)應(yīng)微孔中，分別加入50L三聚氰胺酶標(biāo)記物溶液，振蕩使混勻，25左右孵育30min。傾盡酶標(biāo)板，清洗液（4.2.2）洗板4次，拍干。加100L底物（4.2.2）至每個(gè)微孔中，振蕩使混勻，25左右孵育30min。加100L終止液（4.2.2）至每個(gè)微孔中，振蕩混勻，450nm下讀取各微孔吸光度值。注：不同品牌的試劑盒其操作步驟可能略有差異，比如稀釋倍數(shù)，具體操作步驟可根據(jù)試劑盒使用說明書略作調(diào)整。試劑盒使用前恢復(fù)到室溫。標(biāo)準(zhǔn)和樣品做平行試驗(yàn)以增加準(zhǔn)確性。4.5 結(jié)果計(jì)算以空白溶液（濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度值為100%作為計(jì)算基準(zhǔn)，折算出各標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣萃取液的相對(duì)吸光度值。（1）相對(duì)吸光度值（%）= 繪制標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)吸光度值與濃度（g/L）關(guān)系曲線，校正曲線在20g/L-500g/L范圍內(nèi)為線性。試樣萃取液的濃度（g/L）可以從校正曲線上讀出。5 高效液相色譜法5.1 原理試料中的三聚氰胺經(jīng)三氯乙酸和乙酸鉛提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性雜質(zhì)，混合型陽離子交換固相萃取小柱凈化，高效液相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。5.2 試劑和材料除特殊注明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。除色譜用水應(yīng)符合GB/T 6682一級(jí)水的規(guī)定外，水應(yīng)符合GB/T 6682二級(jí)水的規(guī)定。5.2.1 三聚氰胺對(duì)照品：含三聚氰胺（C3H6N6）不得少于95.0%。5.2.2 三氯甲烷（CHCl3）。5.2.3 乙腈(CH3CN)：色譜純。5.2.4 甲醇（CH3OH）:色譜純。5.2.5 庚烷磺酸鈉（C7H15SO3Na）。5.2.6 檸檬酸（C6H8O7H2O）。5.2.7 氨水（NH3H2O）。5.2.8 氮?dú)?N2)：普通氮?dú)狻?.2.9 0.122mol/L三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸20g于1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。5.2.10 0.058mol/L乙酸鉛溶液：準(zhǔn)確稱取乙酸鉛22g于1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。5.2.11 20%甲醇溶液：準(zhǔn)確量取20mL甲醇（5.2.4）于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。5.2.12 5%氨化甲醇溶液：準(zhǔn)確量取5mL氨水（5.2.7）于100mL容量瓶中，用甲醇（5.2.4）定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)制。5.2.13 離子對(duì)緩沖溶液：稱取2.02g庚烷磺酸鈉（5.2.5）和2.10檸檬酸（5.2.6）于1000mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。5.2.14 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取約50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（5.2.1），精確到0.0001g，置50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液（5.2.11）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4避光保存。5.2.15 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：用移液管準(zhǔn)確吸取5.00mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5.2.14）于50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液（5.2.11）定容至刻度，配成濃度為100g/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。5.2.16 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液（5.2.15）于100mL容量瓶中，用20%甲醇溶液（5.2.11）定容至刻度，配制濃度為0.50、1.00、2.50、5.00、10.00g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。5.3 儀器和設(shè)備5.3.1 高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）。5.3.2 色譜柱：SB-C18或SB-C8柱。5.3.3 分析天平：感量0.0001g。5.3.4 天平：感量0.01g。5.3.5 組織勻漿機(jī)。5.3.6 勻漿杯：30mL。5.3.7 離心機(jī)5.3.8 離心管：50mL。5.3.9 混合型陽離子交換固相萃取柱：60mg/3mL。5.3.10 固相萃取裝置。5.3.11 氮?dú)獯蹈蓛x。5.3.12 渦旋混合器。5.3.13 振蕩器。5.3.14 微孔濾膜： 0.45m。5.4 測(cè)定5.4.1 提取?。?0.05）g試料（3.1），置50mL離心管中，依次加入10mL三氯乙酸溶液（5.2.9）、2mL乙酸鉛溶液（5.2.10）、3mL三氯甲烷（5.2.2），渦旋30s使其充分混勻，中速振蕩提取10min，10000r/min離心5min，取上清液備用。5.4.2 凈化依次用3mL甲醇（5.2.4）、3mL水活化混合型陽離子交換固相萃取柱（5.3.9），取備用上清液（5.4.1）全部過柱，再依次用3mL水、3mL甲醇（5.2.4）淋洗，抽干。用5mL氨化甲醇溶液（5.2.12）洗脫，收集洗脫液置試管中。于60下用氮?dú)獯蹈?，加?.00mL甲醇溶液（5.2.11）于試管中，渦旋10s，用微孔濾膜（5.3.14）過濾，濾液供高效液相色譜儀分析。5.4.3 測(cè)定5.4.3.1 色譜條件色譜柱：SB-C18或SB-C8柱，粒度5m，25cm4.6mm（ID）。流動(dòng)相：900mL離子對(duì)緩沖溶液（5.2.13）：100mL乙腈（5.2.3），搖勻。檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm。柱溫：30。流速：1.0mL/min。進(jìn)樣體積：20L。5.4.3.2 測(cè)定取試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。5.4.4 空白試驗(yàn)除不加試料外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。5.5 結(jié)果計(jì)算與表述試料中三聚氰胺的殘留量按式（2）計(jì)算：X= （2）式中：X 試料中三聚氰胺的含量,單位為毫克每千克（mg/kg）； C 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； A 試樣溶液中三聚氰胺的峰面積； As 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積； M 供試試樣質(zhì)量，單位為克（g）。 V 試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）。注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。5.6 方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度5.6.1 靈敏度三聚氰胺在豬肉、牛肉、羊肉、雞肉中的定量限為0.20mg/kg。5.6.2 準(zhǔn)確度本方法在0.50mg/kg10.00mg/kg添加濃度的回收率為80%110%。5.6.3 精密度本方法的批內(nèi)變異系數(shù)15%，批間變異系數(shù)20%。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、豬肉樣品空白色譜圖、豬肉樣品回收色譜圖見附錄A中圖 A.1、圖A.2和圖A.3。 6 氣相色譜-質(zhì)譜法6.1 原理試料中殘留的三聚氰胺經(jīng)三氯乙酸和乙酸鉛提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性雜質(zhì)，經(jīng)混合型陽離子交換固相萃取小柱凈化，雙三甲基三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷衍生，氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定，以m/z327碎片離子色譜峰面積定量。6.2 試劑和材料除特殊注明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。水應(yīng)符合GB/T 6682二級(jí)水的規(guī)定。6.2.1 三聚氰胺對(duì)照品：含三聚氰胺（C3H6N6）不得少于95.0%。6.2.2 三氯甲烷（CHCl3）。6.2.3 乙腈(CH3CN)：色譜純。6.2.4 甲醇（CH3OH）:色譜純。6.2.5 庚烷磺酸鈉（C7H15SO3Na）。6.2.6 檸檬酸（C6H8O7H2O）。6.2.7 氨水（NH3H2O）。6.2.8 氮?dú)?N2)：普通氮?dú)狻?.2.9 吡啶(C5H5N)：優(yōu)級(jí)純。6.2.10 雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷(TMCS)=99:1。6.2.11 0.122mol/L三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸20g于1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。6.2.12 0.058mol/L乙酸鉛溶液：準(zhǔn)確稱取乙酸鉛22g于1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。6.2.13 20%甲醇溶液：準(zhǔn)確量取20mL甲醇（6.2.4）于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。6.2.14 5%氨化甲醇溶液：準(zhǔn)確量取5mL氨水（6.2.7）于100mL容量瓶中，用甲醇（6.2.4）定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)制。6.2.15 稱取2.02g庚烷磺酸鈉（6.2.5）和2.10檸檬酸（6.2.6）于1000mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。6.2.16 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精確稱取約50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（6.2.1），精確到0.0001g，用20%甲醇溶液（6.2.13）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4避光保存。6.2.17 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取5.00mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液（6.2.16）于50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液（6.2.13）稀釋、定容，配成濃度為100g/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。6.2.18 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取1.00mL標(biāo)準(zhǔn)中間液（6.2.17）于100mL容量瓶中，用甲醇（6.2.4）稀釋、定容至濃度為1.00g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。6.3 儀器和設(shè)備6.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜儀。6.3.2 毛細(xì)管柱：HP-5MS毛細(xì)管柱。6.3.3 分析天平：感量0.0001g。6.3.4 天平：感量0.01g。6.3.5 組織勻漿機(jī)。6.3.6 勻漿杯：30mL。6.3.7 離心機(jī)。6.3.8 離心管：50mL。6.3.9 混合型陽離子交換固相萃取柱：60mg/3mL。6.3.10 固相萃取裝置。6.3.11 氮?dú)獯蹈蓛x。6.3.12 渦旋混合器。6.3.13 振蕩器。6.3.14 微孔濾膜：孔徑0.22m，有機(jī)相。6.4 測(cè)定6.4.1 提取?。?0.05）g試料試料（3.1），置50mL離心管中，依次加入10mL三氯乙酸溶液（6.2.11）、2mL乙酸鉛溶液（6.2.12）、3mL三氯甲烷（6.2.2），渦旋30s使其充分混勻，中速振蕩提取10min，10000r/min離心5min，取上清液備用。6.4.2 凈化依次用3mL甲醇（6.2.4）、3mL水活化混合型陽離子交換固相萃取柱（6.3.9），取備用上清液（6.4.2）全部過柱，再依次用3mL水、3mL甲醇（6.2.4）淋洗，抽干。用5mL氨化甲醇溶液（6.2.14）洗脫。6.4.3 衍生化將洗脫液（或根據(jù)洗脫液中三聚氰胺的濃度用甲醇適當(dāng)稀釋）在60下用氮?dú)獯蹈?，加?00L吡啶和200L的衍生化試劑（6.2.10），渦旋混勻，密封玻璃塞，70在恒溫干燥箱中反應(yīng)30min，冷卻后用微孔濾膜（6.3.14）過濾，濾液用氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。6.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別準(zhǔn)確吸取1.00g/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液（6.2.18）0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL置具塞小試管，按6.4.3衍生后，（因試樣溶液最終定容體積為0.5ml，則對(duì)應(yīng)濃度對(duì)應(yīng)分別是0.2g/mL，0.4g/mL，0.6g/mL，0.8g/mL，1.0g/mL）氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。每一個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定2次，測(cè)得的峰面積平均值與對(duì)應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。6.4.5 測(cè)定6.4.5.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱或相當(dāng)者。載氣：氦氣，流速為1.3mL/min。進(jìn)樣量：1L。進(jìn)樣口溫度：260。升溫程序：起始溫度75，持續(xù)1.0min,以30/min升溫至300，保持2.0min。傳輸線溫度：280。運(yùn)行時(shí)間：10.5min。掃描范圍：60m/z-400m/z。掃描模式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）。監(jiān)測(cè)離子m/z99、171、327、342，定量離子m/z327。離子源：EI源。離子源溫度：230。