生物技術(shù)在植物育種中應(yīng).ppt

第十三章 生物技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用,1、教學(xué)的基本要求 （1）了解細(xì)胞工程與作物育種的原理和基本方法； （2）了解作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理和基本方法； （3）了解分子標(biāo)記的主要類型和分子標(biāo)記輔助選擇育種的原理和基本方法。,2、教學(xué)基本內(nèi)容 第一節(jié) 細(xì)胞工程與作物育種 一、細(xì)胞和組織培養(yǎng)與作物育種 二、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交 第二節(jié) 作物育種的轉(zhuǎn)基因技術(shù) 一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀 二、*轉(zhuǎn)基因育種的程序 三、轉(zhuǎn)基因作物品種的選育 四、轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性 第三節(jié) 分子標(biāo)記輔助選擇育種 一、*分子標(biāo)記的類型和特點(diǎn) 二、常用分子標(biāo)記的原理和遺傳特性 三、MAS育種方法,第十三章 生物技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用 第一節(jié) 細(xì)胞工程與作物育種,植物細(xì)胞工程（plant cell engineering）是以植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一門學(xué)科。它以細(xì)胞為基本單位，在體外（in vitro）條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿生產(chǎn)某種物質(zhì)的過程。,細(xì)胞工程與作物遺傳改良有著密切關(guān)系，利用細(xì)胞工程技術(shù)已培育出一些大面積推廣的品種。,早期，哈布蘭特在前人細(xì)胞學(xué)說的影響下，提出高等植物的組織和器官可以不斷分割，并進(jìn)一步提出了植物細(xì)胞全能性（cell totipotency）理論。,植物細(xì)胞全能性是植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)。細(xì)胞全能性是指細(xì)胞所具有的形成各種細(xì)胞類型的潛在能力，也包括植物細(xì)胞經(jīng)脫分化再形成植株的能力。,1904年，Hanning用蘿卜的胚培養(yǎng)，獲得小植株，為組織培養(yǎng)的工作奠定了基礎(chǔ)。,1934年，White對(duì)番茄切段進(jìn)行培養(yǎng)，建立了第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無性繁殖系，獲得了離體培養(yǎng)的真正成功。 三年后，White又發(fā)現(xiàn)B族維生素對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有重要作用。,經(jīng)過幾年的努力，以White為主的幾位科學(xué)家建立了植物組織培養(yǎng)（plaint tissue culture）的綜合培養(yǎng)基，成為以后各種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。,1948年，Skoog等發(fā)現(xiàn)腺嘌呤/生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根分化的決定因素之一，這一發(fā)現(xiàn)成為植物組織培養(yǎng)中控制器官形成的激素模式。 Miller（1956）發(fā)現(xiàn)激動(dòng)素比腺嘌呤更能促進(jìn)芽的形成。,1958年，Stewart & Shautz從胡蘿卜根的懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)分化成完整小植株，使50多年前哈布蘭特提出的細(xì)胞全能性假說首次得到科學(xué)驗(yàn)證，這一成果大大加速了植物組織培養(yǎng)研究的發(fā)展。 1964年，Guha等從曼佗羅花藥培養(yǎng)出單倍體植株。,1970年，Kameya等利用花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株。 1971年，Takebe等首次從煙草原生質(zhì)體獲得再生植株； 1972年，Carlson等獲得第一個(gè)煙草種間體細(xì)胞雜種植株。,至此，在愈傷組織水平、單個(gè)細(xì)胞水平、單個(gè)生殖細(xì)胞水平、原生質(zhì)體水平和體細(xì)胞雜種水平都獲得了完整植株，充分證實(shí)了植物細(xì)胞的全能性。 植物組織培養(yǎng)流程示意圖如下。,外植體來源外植體培養(yǎng) 愈傷組織 再生小植株再生植株,植物細(xì)胞工程的應(yīng)用在20世紀(jì)60年代就已受到重視，但真正的應(yīng)用研究在70年代才進(jìn)入高潮。我國第一個(gè)用花藥培養(yǎng)育成煙草品種，隨后又育成了一些水稻、小麥新品種。,經(jīng)濟(jì)植物的快繁與脫毒、體細(xì)胞變異的篩選、新種質(zhì)的創(chuàng)造、細(xì)胞器的移植、DNA的導(dǎo)入等均對(duì)作物改良和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到了促進(jìn)作用。,一、 植物的細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù),（一）培養(yǎng)基及其組成,1、培養(yǎng)基（Medium）的種類和特點(diǎn) 常用的培養(yǎng)基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。,2、培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基中都應(yīng)包括植物生長(zhǎng)必需的16種營(yíng)養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì)，通常將這些物質(zhì)分為三大類，即無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、有機(jī)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（表）。,表 植物組織培養(yǎng)所需的養(yǎng)分和激素 水 有機(jī)物 大量元素 微量元素 PH 糖 N Fe Co 氨基酸 P Zn Ni 維生素 K B Al 生長(zhǎng)素 Ca Mn Mo 細(xì)胞分裂素 Mg Cu I 調(diào)節(jié)物質(zhì) 赤霉素 S 脫落酸 乙烯 酵母提取物 椰子汁 成分不定物質(zhì) 植物提取物 水解酪蛋白 蛋白胨,（二）培養(yǎng)基的配制,1、母液的配制 為了減少配制培養(yǎng)基時(shí)每次稱量藥品的麻煩，減少極微量藥品在每次稱重時(shí)誤差，一般先配制高濃度的儲(chǔ)備液，即母液。,大量元素可配成10倍母液，使用時(shí)每配制1000ml培養(yǎng)基需要從母液中取100ml。配制母液時(shí)應(yīng)做到分別稱量，充分溶解，在混合次序上應(yīng)最后加入Ca2+，混合時(shí)要邊加邊混合。,微量元素因?yàn)槭褂昧康?，一般配?00倍甚至1000倍母液，使用時(shí)每配制1L培養(yǎng)基從母液中取10ml或1ml，配制時(shí)應(yīng)注意充分溶解后再依次混合。,第三種母液即鐵鹽，鐵鹽必須單獨(dú)配制，若與其它元素混合易造成沉淀。一般采用鰲合鐵，即FeSO4與EDTA鈉鹽的混合物，一般擴(kuò)大200倍。,EDTA鈉鹽須用溫水溶解，然后與FeSO4液混合，在7580之間讓其鰲合1h。使用鰲合鐵的目的是避免沉淀，并使培養(yǎng)基能緩慢不斷地供應(yīng)Fe+。,第四種母液為有機(jī)化合物母液，主要是維生素和氨基酸類物質(zhì)，這類物質(zhì)不能配成混合母液，一定要分別配成單獨(dú)的母液，濃度為每毫升含0.1、1、10mg，使用時(shí)根據(jù)需要量取。,最后一種母液是激素，每種激素應(yīng)單獨(dú)配制母液，其濃度為0.1、0.5或1.0mg/ml。多種激素難溶于水，配制時(shí)應(yīng)注意溶解次序。,IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少量95%酒精，再加水定容；NAA可溶于熱水或少量酒精后，再加水定容；2，4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后再定容；KT和BA應(yīng)先溶于少量1mol HCl中，然后定容。,表 一些植物組織培養(yǎng)基的成分（mg/L） - 成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER - 大量元素 NH4NO3 1650 - 1650 - 720 - - 1650 1200 KNO3 1900 2527.5 1900 80 950 2500 - 1900 1900 CaCl22H2O 440 150 - - - 200 75 440 440 CaCl2 - - 440 - 166 - - - - MgSO47H2O 370 246.5 370 750 185 400 250 370 370 KH2PO4 170 - 170 - 68 - - 170 340 NH4H2PO4 - - - - - 340 - - - （NH4）2SO4 - 134 - - - - - - - Ca（NO3）24H2O - - - 300 - - - - - NaNO3 - - - - - - 600 - - NaH2PO4H2O - 150 - 19 - - 125 - - KCl - - - 65 - - 750 - - -,- 成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER - 微量元素 KI 0.83 0.75 3.32 0.75 - 1 0.01 0.83 - H3BO3 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63 MnSO44H2O 22.3 - 89.2 5 25 - 0.1 22.3 2.23 MnSO4H2O - 10 - - - 10 - - - Zn SO47H2O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 - Zn SO44H2O - - - - - - - - - Zn Na2EDTA - - - - - - - - 15 Na2MoO42H2O 0.25 0.25 1.0 - 0.25 0.1 - 0.25 0.025 MoO3 - - - 0.001 - - - - - Cu SO4 - - - - - 0.2 - - - Cu SO45H2O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 - 0.03 0.025 0.0025 CoCl26H2O 0.025 0.025 0.1 - - 0.1 - 0.025 0.0025 CoSO47H2O - - - - - - 0.03 - - AlCl3 - - - - - - - - - NiCl26H2O - - - - - - 0.03 - - -,- 鐵鹽成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER - FeCl36H2O - - - - - - 1 - - Fe2(SO4)3 - - - 2.5 - - - - - FeSO47H2O 27.8 - 27.8 - 27.8 15 - 27.8 27.8 Na2EDTA2H2O 37.3 - 37.3 - 37.3 20 - 37.3 37.3 NaFeEDTA - 28 - - - - 1 - - -,成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER 有機(jī)物 鹽酸吡哆醇 0.5 1 1 0.01 0.5 0.5 - - 0.5 鹽酸硫胺素 0.1 10 13 0.01 0.5 5 - 0.4 0.5 煙酸 0.5 1 1 0.05 5 5 - - 0.5 肌醇 100 100 100 - 100 1000 - 100 - 甘氨酸 2 - - 3 2 - - - 2 脯氨酸 - - 1381 - - - - - - 葉酸 - - - - 0.5 - - - - 生物素 - - - - 0.05 - - - - 蔗糖 3% 2% 3% 2% 2% 3% - 3% 4%,2、培養(yǎng)基的配制 以配制1L培養(yǎng)基為例，培養(yǎng)基配制方法如下：, 混合各成分母液。取大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、鐵鹽母液5ml于一個(gè)1L燒杯中，依次加入有機(jī)成分和激素，并加水至500ml。,熔化瓊脂：稱78g瓊脂和所需蔗糖于另一1L燒杯中，加水至500ml，待糖溶解后，加熱使瓊脂充分熔化。,將（1）和（2）混合，攪拌均勻，補(bǔ)水至1000ml。,調(diào)PH。一般用0.1mol NaOH或1N HCl調(diào)PH至所需PH。一般PH調(diào)至5.8，但也有PH調(diào)到7.0的，不同材料的最適PH不一樣。對(duì)培養(yǎng)基的凝固來說，PH較高時(shí)，培養(yǎng)基過硬，不便于培養(yǎng)材料吸收營(yíng)養(yǎng)；PH過低，低到4.0以下時(shí)，培養(yǎng)基很難凝固。,分裝：將培養(yǎng)基分裝于100ml或50ml三角瓶中，每瓶50或30ml左右，封口包裝。,滅菌：一般用1.1kg/cm2壓力，在121下滅菌1520min。滅菌時(shí)間應(yīng)根據(jù)材料掌握。時(shí)間短，滅菌不徹底；時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)引起培養(yǎng)基成分降解。,放置備用。滅菌后取出培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)臺(tái)上，使之冷卻凝固。培養(yǎng)瓶應(yīng)平放，以免形成斜面。,（三）無菌操作方法,1、消毒劑 在接種前，必須使材料完全無菌，這是取得植物組織培養(yǎng)成功的基本保證。要保證這一點(diǎn)，取材時(shí)應(yīng)選取植物組織內(nèi)部無菌的材料。從健壯植株上取材，不要有傷口；嚴(yán)格防止病蟲。,應(yīng)在晴天取材，最好中午或下午取材。最好避免選用田間材料，選用無菌苗較好。非要用田間材料時(shí)，為避免消毒困難，可將材料種在大棚或生長(zhǎng)箱里。常用的消毒劑見表。,表 植物材料消毒常用的消毒劑及使用方法 - 消毒劑 使用濃度 消除難易 消毒時(shí)間 消毒效果 （%） （min） - 次氯酸鈉 2 易 530 很好 次氯酸鈣 910 易 530 很好 漂白粉 飽和溶液 易 530 很好 氯化汞 0.11.0 較難 210 最好 酒精 7075 易 0.22 好 H2O2 1012 最易 515 好 溴水 12 易 210 很好 AgNO3 1 較難 530 好 抗生素 450mg/L 中 3060 較好,對(duì)于難消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用肥皂水洗，自來水沖凈，在70%酒精或1L HCl中浸30s，再加入消毒劑。不同的材料消毒的方式和所需時(shí)間不一樣，研究者應(yīng)根據(jù)不同材料確定具體消毒方案。,2、無菌操作 準(zhǔn)備好接種材料用的培養(yǎng)基、待消毒的材料、無菌水、無菌燒杯及其它必需玻璃器皿、無菌操作工具（如剪刀、鑷子、解剖刀等，這些工具可用高溫消毒，也可用高壓高溫滅菌，也可隨用隨消毒）、70%酒精等。,將超凈工作臺(tái)打開，讓其運(yùn)行10min左右，在超凈工作臺(tái)上打開燒杯和無菌水瓶蓋，將HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料的燒杯中，510min后取出另一盛有無菌水的燒杯中，無菌水沖洗34次，然后將材料取出接種在培養(yǎng)基中，封口，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。,無菌操作時(shí)應(yīng)注意下面幾個(gè)問題：整過操作過程一切用具必須始終保持無菌狀態(tài)；無菌操作前必須用肥皂洗手，然后用70%酒精洗手；操作時(shí)無菌器皿一旦打開，應(yīng)盡量避免手再從其上橫過；避免強(qiáng)呼吸，呼吸時(shí)應(yīng)將臉移開超凈臺(tái)；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。,3、無菌培養(yǎng) 材料接種后移入培養(yǎng)室培養(yǎng)，一般培養(yǎng)室要求非常衛(wèi)生，恒溫，有理想的光照控制系統(tǒng)，一般材料要求25左右，晚上一般不低于20。,二、 細(xì)胞和組織培養(yǎng)與作物育種,（一） 體細(xì)胞克隆變異及其育種利用,在近50年中，以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物技術(shù)的研究與發(fā)展為植物育種提供了一些新的實(shí)驗(yàn)方法和手段，并且培養(yǎng)出一些在生產(chǎn)上有利用價(jià)值的品種。,體細(xì)胞克隆變異指植物組織和體細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異。Larkin等（1981）在其綜述文章中開始使用“體細(xì)胞克隆變異”（somaclonal variation）這一概念。,為了區(qū)分來源于體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞的變異，Evans將來自配子體組織的變異稱為“配子體克隆變異”（gametoclonal variation），以與體細(xì)胞克隆變異區(qū)分開。,對(duì)于遺傳變異的分析而言，Orton為了統(tǒng)一術(shù)語，引進(jìn)了R0、R1、R2等，分別表示再生當(dāng)代、自交第一代、第二代等，至今這一概念還在廣泛應(yīng)用。,1、體細(xì)胞克隆變異的遺傳基礎(chǔ) （1）染色體數(shù)目變異 最多見的是多倍體，主要是培養(yǎng)基中使用了細(xì)胞分裂素。,變異的大小與培養(yǎng)狀態(tài)、年齡、原始材料的倍性及培養(yǎng)時(shí)期有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)：二倍體變異的頻率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，四倍體變異的頻率卻隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。,（2）染色體結(jié)構(gòu)變異 染色體結(jié)構(gòu)變異似乎是體細(xì)胞克隆變異的主要來源，最重要的是染色體缺失、倒位、重復(fù)和異位。很多體細(xì)胞再生株減數(shù)分裂時(shí)形成多價(jià)體、染色體橋、小片段、環(huán)等，充分說明了染色體結(jié)構(gòu)變異的存在。,（3）點(diǎn)突變 這類突變可分為多種類型，一種類型是自發(fā)突變，最早證實(shí)點(diǎn)突變存在的是從煙草中利用體外篩選獲得抗chlorsulfuron的突變體。很多通過細(xì)胞篩選獲得的抗病、抗除草劑等突變體屬于此類。,另一種點(diǎn)突變是誘發(fā)突變，培養(yǎng)基中加入化學(xué)誘變劑或進(jìn)行誘變處理。由于培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物一直處于誘變的環(huán)境條件下，所以突變究竟是自發(fā)還是誘發(fā)很難搞清楚。,第三種點(diǎn)突變是基因的表達(dá)及基因放大或衰減。高等植物的某些基因在發(fā)育過程中受到某一環(huán)境刺激，可以放大自己，即基因的拷貝數(shù)大量增加，這意味著該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA及蛋白質(zhì)增加。最初在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，后來在植物中發(fā)現(xiàn)也存在。,比如，對(duì)某一物質(zhì)的抗性，可以通過逐步增加濃度的辦法而使細(xì)胞對(duì)該物質(zhì)的抗性提高很多倍，這就是基因放大系統(tǒng)存在的很好例證。同樣，也發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞DNA的丟失（衰減），如大豆懸浮系經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，其核糖體基因丟失了1/3。,第四種點(diǎn)突變是有絲分裂交換。這種交換盡管很微弱地改變了基因的順序，但仍影響基因的表達(dá)。這種變化包括：某一基因拷貝的丟失，某一基因拷貝的重復(fù)或修復(fù)過程中基因的轉(zhuǎn)變。,轉(zhuǎn)座因子也是造成體細(xì)胞突變的原因之一，轉(zhuǎn)座子通過插入與解離使某些基因的表達(dá)受到調(diào)控。,最后細(xì)胞質(zhì)基因葉綠體和線粒體基因也能發(fā)生突變。Gengenbach et al（1975）利用玉米T小種毒素篩選獲得了抗T小種的細(xì)胞系，這個(gè)基因已知位于胞質(zhì)中。,離體培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生各種類型的突變體，除抗性突變體外，還有形態(tài)性狀突變體、不育性、產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的改變等。形態(tài)變異如矮化性、葉型等，利用這些變異可以進(jìn)行高光效育種。,培養(yǎng)再生植株中出現(xiàn)不育性的頻率較高，但大多為核基因的突變，可以用來培育不育系。產(chǎn)量和品質(zhì)的突變必須在田間通過適當(dāng)?shù)姆治霾拍艽_定。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)細(xì)胞水平的突變體篩選多數(shù)在抗性突變體方面開展工作，如抗病、耐鹽、抗重金屬等。,2、突變體的篩選 為了增加突變頻率，需要進(jìn)行誘變處理。將外植體、愈傷或懸浮系用誘變劑處理，如使用化學(xué)誘變劑，要充分洗滌后再進(jìn)入下一步的工作。使用多大劑量和處理多長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到較好誘變效果，應(yīng)根據(jù)具體試驗(yàn)確定。,在突變體篩選中常采用兩種選擇法，即一步篩選法和多步篩選法。 一步篩選法是將培養(yǎng)物接種在含有最低全部致死劑量的培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出生長(zhǎng)的培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)移到含有抑制劑的新鮮培養(yǎng)基上。,可以看出，這種方法是一次就把篩選壓設(shè)定很高，使不抗細(xì)胞（野生細(xì)胞）完全不可能生長(zhǎng)，篩選出的能生長(zhǎng)的細(xì)胞即為耐（抗）性細(xì)胞系。,但在有些情況下這種方法不一定實(shí)用，有的細(xì)胞在超過最低全部致死濃度時(shí)，細(xì)胞均死亡，或單個(gè)細(xì)胞不能生存。多步篩選法是首先使用半致死劑量對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，每次繼代將上代能生長(zhǎng)的細(xì)胞系繼代到篩選劑濃度提高的新鮮培養(yǎng)基上。,在這種篩選體制下，抗性細(xì)胞應(yīng)該比野生細(xì)胞長(zhǎng)的快，通過逐步增加篩選劑水平，最終會(huì)篩選出在抑制劑超過最低全部致死濃度時(shí)也能旺盛生長(zhǎng)的細(xì)胞系。,但是，去除抑制劑后，抗性培養(yǎng)物的穩(wěn)定性是常出現(xiàn)的一個(gè)問題，抗性丟失來自很多原因，包括細(xì)胞對(duì)抑制劑的生理適應(yīng)?？梢?，多步篩選易獲得在某一抑制劑水平下，細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞系。,篩選的材料對(duì)象可以是原生質(zhì)體、愈傷塊、懸浮培養(yǎng)物和花粉/小孢子培養(yǎng)物。利用原生質(zhì)體進(jìn)行抗性篩選有一大優(yōu)點(diǎn)：篩選出的克隆極有可能來自單細(xì)胞，但是操作困難。,利用愈傷塊篩選是最簡(jiǎn)單的方法，但這種篩選存在一定缺陷，愈傷塊里的各個(gè)細(xì)胞不能均等地接觸抑制劑，下部愈傷細(xì)胞比上部細(xì)胞吸收到較多的抑制劑，這樣就使篩選結(jié)果在一定程度上失去可靠性。,懸浮細(xì)胞篩選也很常用，細(xì)胞接觸選擇劑較均勻，但存在一定的操作復(fù)雜性。花粉/小孢子培養(yǎng)物用于突變體篩選有一定優(yōu)勢(shì)，突變體很容易表現(xiàn)出來，也很易純合。,3、在作物改良上的應(yīng)用 利用上述方法便可篩選體細(xì)胞克隆變異，將這一技術(shù)應(yīng)用于作物改良技術(shù)路線見圖。,優(yōu)良品種 細(xì)胞培養(yǎng) R0 R1群體 改良的體細(xì)胞克隆 確定遺傳方式 田間實(shí)驗(yàn) 遺傳穩(wěn)定性測(cè)試 多點(diǎn)田間實(shí)驗(yàn) 育成新品系 繼續(xù)田間實(shí)驗(yàn)，種子富集 區(qū)域試驗(yàn) 審 定 投入生產(chǎn) 圖 利用體細(xì)胞克隆變異育種的技術(shù)路線,（二） 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種利用,1、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)在遺傳和育種中的應(yīng)用價(jià)值 花藥培養(yǎng)（anther culture）是指在獲得單倍體的一種技術(shù)，之后，花粉和小孢子培養(yǎng)逐漸獲得成功，從而使單倍體細(xì)胞培養(yǎng)體系更加完善。單倍體在遺傳和育種研究中有如下優(yōu)點(diǎn)：,（1）后代的快速純合 通過單倍體迅速產(chǎn)生純系。在異花授粉作物中，可用單倍體產(chǎn)生加倍單倍體（DH系），從中篩選純合自交系用于雜交制種。由于加速純合，從而就縮短了育種周期（圖）。,母本 父本 F1 花藥培養(yǎng) F2 花粉植株 加倍 品系比較試驗(yàn) 選擇鑒定 區(qū)域試驗(yàn) 圖 雜交育種與單倍體育種的周期比較,（2）提高選擇效率 如果某一性狀受一對(duì)基因控制，在AAaa F2中，純合AA個(gè)體只有1/4。如F1采用花藥或花粉培養(yǎng)，產(chǎn)生的后代中AA個(gè)體占1/2，比常規(guī)雜交育種提高一倍。,（3）排除雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)后代選擇的干擾 對(duì)于雜交育種來講，由于低世代很多基因位點(diǎn)尚處于雜合狀態(tài)，會(huì)有不同程度的雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)，對(duì)個(gè)體的選擇會(huì)造成一定誤差。采用DH群體進(jìn)行選擇育種，由于各基因位點(diǎn)在理論上均處于純合狀態(tài)，選擇到的變異能更大程度上代表真實(shí)變異。,（4）遺傳研究的良好材料體系 單倍體是基因互作檢測(cè)、遺傳變異估計(jì)、連鎖群構(gòu)建、QTL估計(jì)及定位等數(shù)量遺傳學(xué)的良好材料。尤其是近代分子生物學(xué)的發(fā)展，DH系成為分子標(biāo)記作圖的良好群體，它在一定程度上成為一種永久BC或F2群體。,（ 5）突變體的篩選 由于單倍體的各基因均處于純合狀態(tài)，突變體很容易表現(xiàn)出來，從而大大提高了抗性或其它突變體的篩選效率，利用這一體系獲得各種突變體的事例已很多，這里就不一一贅述。,2、離體培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育 小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體小孢子，然后經(jīng)單核早期、單核靠邊期、雙核期（一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和一個(gè)生殖核），最后到達(dá)三核期而成為成熟花粉粒。在離體培養(yǎng)條件下，花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制。,3、影響花藥培養(yǎng)的因素 （1）供體植株的生長(zhǎng)條件 供體植株的生長(zhǎng)條件對(duì)培養(yǎng)效果有重要影響，有時(shí)只有在控溫、一定光周期和光強(qiáng)的條件下，其花藥才能有反應(yīng)。環(huán)境條件對(duì)于不同的植物種有很大不同，所以沒有一個(gè)固定的環(huán)境控制模式。,（2 ）供體植株的年齡 供體植株對(duì)培養(yǎng)效果也有一定影響，一般講，開花初期植株的花蕾易于培養(yǎng)。,（ 3）花粉發(fā)育時(shí)期 用于培養(yǎng)的花蕾，其花藥內(nèi)小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)培養(yǎng)效果有較大影響，但因物種而異。在煙草中，處于第一次有絲分裂期的花粉效果最好，而在禾本科和蕓苔屬中，單核早期最好。,（4）花蕾和花藥的預(yù)處理 對(duì)于有些物種，培養(yǎng)前對(duì)花藥和花蕾進(jìn)行預(yù)處理，能顯著提高培養(yǎng)效果。如大麥花藥，4處理28d，或7處理14d，能收到最好效果?？蓪?duì)整穗、小穗、甚至分離的花藥施加預(yù)處理，只要注意處理期間不要與水接觸。也有人將花藥接種后放在低溫下預(yù)處理，不同材料需不同的預(yù)處理方式，沒有一個(gè)固定模式。,（5）培養(yǎng)基 究竟使用固體或液體培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料的要求定。多數(shù)情況下，MS、N6及馬鈴薯提取液培養(yǎng)基在禾谷類作物中用的較多?；ㄋ幣囵B(yǎng)時(shí)往往需要一定的滲透壓，有的要求低濃度的蔗糖（2%4%），有的要求高濃度的蔗糖（8%12%）。,二細(xì)胞結(jié)構(gòu)的成熟花粉往往需低濃度糖，而三細(xì)胞結(jié)構(gòu)的成熟花粉植物往往需高滲條件，如油菜小孢子培養(yǎng)時(shí)，糖的濃度可用到13%17%。培養(yǎng)基中所添加的維生素和激素對(duì)培養(yǎng)效果可產(chǎn)生重要影響。對(duì)于某些植物種來講，添加某種植物的提取物或椰汁可以改善培養(yǎng)效果。,（6）培養(yǎng)條件 多數(shù)植物在25下培養(yǎng)能誘導(dǎo)愈傷組織，可某些植物，尤其是蕓苔屬，在高溫35下處理幾天，然后進(jìn)入25培養(yǎng)能收到最好效果?；ㄋ幣囵B(yǎng)一般在暗處進(jìn)行，直到愈傷或胚狀體形成再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。此外，接種花藥的外植體置向、培養(yǎng)密度等有時(shí)對(duì)培養(yǎng)效果也有影響。,4、花粉（小孢子）培養(yǎng) 花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)在于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)后經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株或雙單倍體，不含藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的干擾而形成的體細(xì)胞植株，但它的培養(yǎng)難度大。,5、單倍體誘導(dǎo)中存在的問題 對(duì)于多數(shù)植物來講，能形成有活力胚的花藥百分率很低，除此之外，還有很多問題存在。,通?；ㄋ幓蚧ǚ垭x體培養(yǎng)時(shí)沒有生長(zhǎng)和發(fā)育跡象，或剛開始生長(zhǎng)便導(dǎo)致胚敗育；在產(chǎn)生單倍體的同時(shí)產(chǎn)生二倍體或四倍體；培養(yǎng)中我們需要小孢子分裂，而二倍體組織不分裂，但這種情況往往難以辦到；白化苗難以避免，尤其是在禾本科作物中；在混倍性的材料中很難分離出單倍體，因?yàn)閱伪扼w細(xì)胞的生長(zhǎng)很易被生長(zhǎng)旺盛的多倍體細(xì)胞所掩蓋。,6、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)與植物育種 單倍體是高度不育的，需要進(jìn)行加倍處理才能應(yīng)用。秋水仙素是常用的染色體加倍藥劑，可以用1%的秋水仙素對(duì)正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮細(xì)胞進(jìn)行處理，一般24h左右。也可在固體培養(yǎng)基中加適當(dāng)濃度的秋水仙素。,花粉植株在培養(yǎng)過程中可以自然加倍，但頻率很低。將單倍體植株的組織或器官用作外植體，重新誘導(dǎo)愈傷組織，讓培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自然加倍也是一種方法。,A品種 B品種 F1雜交種 小孢子培養(yǎng)或花藥培養(yǎng) 單倍體培養(yǎng) 染色體加倍 重組純合系 選擇 重組了A和B品種優(yōu)點(diǎn)的純系 自交、田間測(cè)試 遺傳穩(wěn)定性測(cè)試 田間測(cè)試 新品系確定遺傳基礎(chǔ) 品種 親本 -雜交 推廣利用 雜種優(yōu)勢(shì)利用 圖 單倍體細(xì)胞培養(yǎng)及育種技術(shù),（三）幼胚培養(yǎng)與遠(yuǎn)緣雜交育種,植物胚胎培養(yǎng)（embryo culture）是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在離體無菌培養(yǎng)條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。植物幼胚和胚珠培養(yǎng)是植物遠(yuǎn)緣雜交育種的重要輔助手段。,（四）種質(zhì)的長(zhǎng)期保存,細(xì)胞培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)再生植株技術(shù)的實(shí)現(xiàn)為離體試管保存種質(zhì)提供了條件，這種方法只需要較少的空間就能保存大量的無性系，而且保存過程中可避免病蟲害的侵襲，在特定的條件下可以長(zhǎng)期保存，需要的時(shí)候只需將材料取出來迅速繁殖即可。,保存的材料可以是多種類型，依植物材料的性質(zhì)和需要定。材料可以是愈傷組織、莖尖、幼胚、花粉形成的單倍體愈傷組織等。,保存的方法主要有緩慢生長(zhǎng)保存法和超低溫保存法。對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的材料，在常規(guī)培養(yǎng)條件下就能保存很長(zhǎng)時(shí)間，但大多數(shù)植物離體培養(yǎng)時(shí)需要頻繁繼代，需要通過降低生長(zhǎng)速度來延長(zhǎng)繼代間隔。,緩慢生長(zhǎng)法主要是基于改變培養(yǎng)環(huán)境和修改培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn)對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行短期和中期保存。緩慢生長(zhǎng)法的保存技術(shù)包括降低培養(yǎng)溫度、減少氧氣含量、將組培材料脫水干燥等。,超低溫保存法可以長(zhǎng)期保存植物材料，不需要繼代，其原理是在超低溫情況下，使生物的代謝和衰老過程大大減慢甚至完全停止。,超低溫通常指低于-80的低溫，保存介質(zhì)或容器有干冰（-79）、超低溫冰箱（-80150）、液氮（-196）和液氮蒸汽相（-140）等，其中液氮最常用。,超低溫保存與緩慢生長(zhǎng)保存法相比，具有一定的技術(shù)復(fù)雜性，使用時(shí)應(yīng)根據(jù)具體的材料和相關(guān)文獻(xiàn)確定技術(shù)方案。,（五）脫毒及繁殖重要品種或材料,多數(shù)作物，尤其是無性繁殖作物，由于病毒或其他病原菌的侵襲，有一個(gè)產(chǎn)量和品質(zhì)下降的過程，常常需要對(duì)受病毒侵染的材料進(jìn)行脫毒處理。病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，在受侵染的植株中，頂端分生組織一般不帶毒，或只攜帶濃度很低的病毒。,由于存在這一規(guī)律，我們便可利用莖尖培養(yǎng)的方法使植物脫去病毒。植物莖尖脫毒在無性繁殖作物的提純復(fù)壯中有很重要的應(yīng)用價(jià)值，如馬鈴薯、甘薯、果樹、多年生花卉等。,組織培養(yǎng)在植物快速繁殖中有很好的用途。大多數(shù)果樹和觀賞植物是高度雜合的，它們的種子后代無法與原品種相同，在這種情況下，如要保持原種特性，需利用莖尖培養(yǎng)快速繁殖。此外，莖尖培養(yǎng)在保存稀有野生資源、繁殖不育遠(yuǎn)緣雜種等方面具有優(yōu)勢(shì)。,植物材料的快速繁殖主要是通過誘導(dǎo)莖芽形成實(shí)現(xiàn)的，可以通過兩種途徑使莖芽增殖。一種是通過愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽形成，然后分株培養(yǎng)，便可獲得大量遺傳上基本一致的無性系。,另一種是誘導(dǎo)莖尖或不定芽萌發(fā)或形成叢生芽也可達(dá)到快速繁殖的目的。一些腋芽、植物器官或節(jié)段起源的芽，一般處于休眠狀態(tài)，通過離體培養(yǎng)可解除休眠而萌發(fā)。植物的脫毒與快速繁殖技術(shù)很易使某些作物，如甘薯、果樹、經(jīng)濟(jì)林木等形成產(chǎn)業(yè)化，創(chuàng)造顯著的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。,（六）人工種子的生產(chǎn),人工種子（artificial seeds）是指將細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或其類似物，經(jīng)過有機(jī)化合物的包埋而形成的能在適宜條件發(fā)芽的類似于天然植物種子的顆粒體。它通常由三部分組成：體細(xì)胞胚、人工胚乳、人工種皮。,人工種子的研究在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有重要意義，它在固定雜種優(yōu)勢(shì)、快速繁殖良種和不育材料、節(jié)約用種、工廠化生產(chǎn)種子方面都有潛在價(jià)值。對(duì)木本植物來說，用人工種子可不必等待漫長(zhǎng)的有性世代，即可以快速繁殖優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因植物推廣到生產(chǎn)上去。此外，人工種子體積小，便于運(yùn)輸。,三、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交,植物原生質(zhì)體（protoplast）是一個(gè)沒有壁的細(xì)胞，由于沒有壁及質(zhì)膜暴露在外界環(huán)境下，使原生質(zhì)體的結(jié)構(gòu)變得很脆弱，在沒有一定的滲透劑和穩(wěn)定劑的情況下，很快會(huì)破裂。由于上述特點(diǎn)，使得原生質(zhì)體的操作難度較大，可一旦再生了壁就恢復(fù)了細(xì)胞的全能性，具有了同正常細(xì)胞一樣的特性。,（一）原生質(zhì)體的分離,原生質(zhì)體分離的最基本原則是保證原生質(zhì)體不受傷害及不損害它的再生能力，其先決條件是要有一個(gè)合適的滲透壓。,1、分離方法 分離原生質(zhì)體的方法一般有機(jī)械分離和酶法分離兩種。,機(jī)械法分離是早期采用的分離方法，先對(duì)材料進(jìn)行質(zhì)壁分離處理，然后切割，這一過程中會(huì)釋放出少量的不受損傷的原生質(zhì)體。用這一方法僅能從液泡很大的材料中獲得原生質(zhì)體，而不能應(yīng)用于分生細(xì)胞。,酶法分離原生質(zhì)體是目前常用的方法，可分為一步法和二步法。 一步法是將果膠酶（pectinase）和纖維素酶（celluluse）等混合處理材料，直接分離獲得原生質(zhì)體。,二步法是先用果膠酶處理材料，降解細(xì)胞間層使細(xì)胞分離，再用纖維素酶水解胞壁釋放原生質(zhì)體。目前多用一步法。,2、影響原生質(zhì)體分離的因素 （1）材料來源 葉肉細(xì)胞是常用的材料，因?yàn)槿~片很容易獲得而且能充分供應(yīng)，其次為愈傷細(xì)胞或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。從葉片來源的原生質(zhì)體在遺傳上較一致，而培養(yǎng)細(xì)胞來源的原生質(zhì)體則不然，因?yàn)榕囵B(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生變異。,但由愈傷或懸浮系來源的原生質(zhì)體，可以避免植株生長(zhǎng)環(huán)境的不良影響，還可以常年供應(yīng)，易于控制新生細(xì)胞的年齡，處理時(shí)操作簡(jiǎn)便，無需消毒。此外，從根、莖、葉、花、果實(shí)、胚芽鞘、子葉、花粉、四分體等均能分離原生質(zhì)體。,（2）滲透壓 原生質(zhì)體分離之前必須確定一個(gè)適合的滲透壓。在這種滲透壓下，原生質(zhì)體的分離、純化過程中都不致使原生質(zhì)體受損傷。,（3）酶 植物細(xì)胞壁是一個(gè)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，由纖維素和半纖維素組成，需要一定的酶組成才能降解它。廣泛使用的商品酶制劑可以從很多公司購買。,（4）分離培養(yǎng)基 Ca2+對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和穩(wěn)定性有很大影響，它是細(xì)胞壁的主要成分，同時(shí)能穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)。另外，Mg2+、PO43-對(duì)于原生質(zhì)體活力的保持也有重要作用，所以分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)基中除酶外，一般含這些離子。,（5）培養(yǎng)條件 酶處理時(shí)的溫度和pH最重要。PH使用范圍為4.8-7.2，可是，高pH（大于6.0）一般有利于原生質(zhì)體的生存，可能是高pH降低了細(xì)胞壁降解時(shí)產(chǎn)生的有害酶活性和存在于分離培養(yǎng)基中的毒性物質(zhì)的活性。為了防止pH的變化，常加入MES2（N-morpholino）-ethanesulfonic acid。這是一種緩沖劑，一般使用量為3mM。,分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)時(shí)間與溫度成反比，可是，高溫下短時(shí)間分離的原生質(zhì)體不適于培養(yǎng)，它們易發(fā)褐和破裂。常用溫度為23-32。有的材料溫度很低，5-10。也有高、低溫結(jié)合使用的。酶處理時(shí)一般在暗處培養(yǎng)，但有些材料在光下有利。培養(yǎng)過程中，間斷低速震蕩有利于酶滲透。,（6）組織前處理 高滲前處理、激素處理、低溫處理、激素與低溫結(jié)合前處理等對(duì)不同植物原生質(zhì)體分離可能有較好的效果。,3、原生質(zhì)體的收集、純化和活力測(cè)定 原生質(zhì)體酶解完成后，將其用200目篩過濾，濾液再用400目過濾，收集濾液，低速離心，去上清液。用含有酶解液同樣滲透劑的無酶CPW液將原生質(zhì)體懸起，再離心，去上清，反復(fù)幾次，便完成原生質(zhì)體的洗滌工作。,原生質(zhì)體的純化可采用蔗糖懸浮法、梯度離心法或二相界面法，具體操作方法可參考專業(yè)書籍。用Evans blue或FDA測(cè)定原生質(zhì)體活力，以確定原生質(zhì)體的分離效果。,（二）原生質(zhì)體培養(yǎng),原生質(zhì)體培養(yǎng)前必須調(diào)到一定密度，一般103-105/ml的密度比較適合原生質(zhì)體培養(yǎng)。原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法各種各樣，依作物和材料來源而異。平板培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、液-固雙層培養(yǎng)、瓊脂糖包埋、看護(hù)培養(yǎng)等是原生質(zhì)體培養(yǎng)常用的方法。,但不管哪種培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)過程中，都應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況不斷降低滲透壓。待肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)形成后，便可轉(zhuǎn)移到普通細(xì)胞培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞繁殖和分化工作。,影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素很多，物理?xiàng)l件如密度、光照和溫度等都會(huì)影響培養(yǎng)效果。低于一定密度原生質(zhì)體不能分裂，一般認(rèn)為大群體的原生質(zhì)體有利于將培養(yǎng)基中原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中釋放的有害物質(zhì)脫毒。,原生質(zhì)體培養(yǎng)一般在暗處進(jìn)行，有利于壁形成和細(xì)胞再生，有的物種一直在暗處直到形成愈傷組織，有的一周后移到光下。,原生質(zhì)體培養(yǎng)一般在22-25進(jìn)行，高、低溫都有害。但有的植物要求27-30，在25時(shí)不能形成愈傷組織。,原生質(zhì)體比細(xì)胞需要更復(fù)雜的培養(yǎng)條件，有時(shí)需要在有飼養(yǎng)層細(xì)胞的情況下原生質(zhì)體才能再生。培養(yǎng)基無機(jī)營(yíng)養(yǎng)和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)組成都對(duì)培養(yǎng)效果有顯著影響。,選擇適當(dāng)?shù)臐B透壓對(duì)于獲得大量原生質(zhì)體并保持其活力均很重要，一般用甘露醇或山梨醇調(diào)節(jié)滲透壓。在培養(yǎng)過程中一般需降低滲透壓以促進(jìn)分裂。,對(duì)于瓊脂糖包埋培養(yǎng)，可將其切成小塊，轉(zhuǎn)移到低滲的液體培養(yǎng)基中漂浮培養(yǎng)，液體培養(yǎng)則可加入低滲的一定體積的培養(yǎng)基，但一般每一步降低程度不超過25%。現(xiàn)在一個(gè)趨勢(shì)是將蔗糖或葡萄糖單獨(dú)使用或與甘露醇結(jié)合作為穩(wěn)定劑，一旦糖被降解，培養(yǎng)基滲透壓降低，利于細(xì)胞分裂。,生長(zhǎng)素對(duì)于培養(yǎng)早期壁的形成是需要的，最常用的是2，4-D，有時(shí)需要生長(zhǎng)素與分裂素結(jié)合使用。生長(zhǎng)素的使用量一定要小心確定，因?yàn)樗苋菀资挂号蓍L(zhǎng)大或增加新液泡而使細(xì)胞分裂。,實(shí)驗(yàn)證明，生長(zhǎng)素通過調(diào)節(jié)一些特異mRNA的合成而起作用。分裂誘導(dǎo)后，需要轉(zhuǎn)到低生長(zhǎng)素的條件下才能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，維生素、水解酪蛋白、椰汁等，對(duì)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。在培養(yǎng)過程中也需注意一些氨基酸的使用。,原生質(zhì)體形成愈傷團(tuán)后，便可采用常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)方法使細(xì)胞擴(kuò)大繁殖或分化形成植株。,（三）細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜交） 物種間生殖隔離阻礙了物種間的基因交流，從而給作物育種帶來很大的局限性。原生質(zhì)體融合技術(shù)是實(shí)現(xiàn)基因重組的一條途徑，目前利用細(xì)胞融合已從很多作物種、屬間，甚至科間獲得雜種體細(xì)胞雜種，創(chuàng)造了一些自然界不存在的植物類型，有效地拓寬了植物育種的資源。,1、融合方法 分離的原生質(zhì)體不帶電荷，它們相互排斥，所以一般要在誘發(fā)條件下才能發(fā)生融合。異種原生質(zhì)體首先發(fā)生膜接觸，然后兩個(gè)原生質(zhì)體形成細(xì)胞質(zhì)橋，最后兩種細(xì)胞質(zhì)將兩個(gè)核包圍起來而完成融合。常用的融合方法簡(jiǎn)單介紹如下：,（1）NaNO3處理誘發(fā)融合 由NaNO3誘導(dǎo)的可重復(fù)、控制的離體原生質(zhì)體融合是由Power等（1970）報(bào)道的。利用這一融合劑，Carlson等（1972）雖然在植物中獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種，但這種方法存在的嚴(yán)重缺陷就是融合頻率低，而且對(duì)于來源于葉肉的高度液泡化的原生質(zhì)體有害。這種融合的機(jī)制一般認(rèn)為是Na+造成了膜電位的改變。,（2）高pH高濃度鈣離子處理 煙草葉肉原生質(zhì)體在高Ca2+（0.05M CaCl2）和高pH（10.5）條件下能很快誘發(fā)融合（37），但融合頻率不很高，高pH也影響原生質(zhì)體的存活率，且易誘發(fā)多個(gè)原生質(zhì)體融合。高Ca2+高pH誘發(fā)融合的機(jī)制尚不很清楚，一般認(rèn)為是改變了膜位及膜的物理結(jié)構(gòu)。,（3）PEG（聚乙二醇）處理 PEG誘導(dǎo)不僅融合頻率高，而且使二核融合頻率增加且無特異性。PEG是一個(gè)高分子量的多聚體（15006000），25%50%PEG可立刻刺激原生質(zhì)體引起收縮，隨后發(fā)生聚集。PEG誘發(fā)融合后應(yīng)逐步去除。影響原生質(zhì)體聚集及隨后融合的因子很多，如PEG的分子量及濃度、原生質(zhì)體的材料來源、分離原生質(zhì)體時(shí)使用的酶制劑、離子種類和濃度、融合溫度等。,（4）電融合 當(dāng)兩個(gè)原生質(zhì)體處于接觸狀態(tài)時(shí)，給一個(gè)512amp的電流持續(xù)15s，原生質(zhì)體首先受刺激，然后馬上融合。應(yīng)用電融合時(shí)，原生質(zhì)體輕微收縮，表明其膜