樣品前處理技術.ppt

第二章 現代樣品前處理技術,1. 檢驗技術基本原則和要求 2. 現代樣品前處理技術(樣品制備),本 章 內 容,基 本 原 則,質量原則 要求檢測技術保證檢測質量，方法成熟，穩(wěn)定，具有較高的精密度，準確度和良好的選擇性，確保實驗結果的科學性，可信性和重復性。 安全原則：所使用的方法不應對操作人員和環(huán)境造成危害 快速原則 經濟原則 可操作原則,第一節(jié) 檢驗技術基本原則和要求,一 般 要 求,檢驗方法中采用的名詞和單位符合國家規(guī)定的標準要求. 檢驗方法中使用試劑均為分析純, 水為蒸餾水. 檢驗中所用計量器具必須按國家規(guī)定及規(guī)程計量和校正. 檢驗時必須做空白試驗和平行試驗. 有多種檢驗方法時, 必須以國家標準方法的第一法為仲裁方法. 采樣必須注意樣品的生產日期, 批號, 代表性和均勻性. 樣品在檢驗結束后,應保留1個月, 以備需要時復查.,第二節(jié) 現代樣品前處理技術,樣本前處理（樣本制備）： 指樣本分析測定之前的一系列準備工作。,整理 清洗 勻化 縮分,樣本制備,粉碎 勻漿 提取 凈化 濃縮 衍生化,樣品前處理,過 程：,提?。菏侵竿ㄟ^溶解、吸附（吸著）或揮發(fā)等方式將樣 品中的殘留農藥分離出來的操作步驟，也叫萃取。 避免：強酸、強堿、高溫、劇烈操作 極性-溶解度、分配系數；揮發(fā)性-蒸汽壓。 2. 凈化： 樣品經萃取被測成分萃取液含有雜質干擾測定。 萃取液適當處理除去雜質純化。 3. 濃縮：通過減少樣品溶液中的溶劑或水分而使組分的濃度升高。 目的：使供測定的樣品達到儀器能夠檢測的濃度，或進行溶 劑轉換。,基 本 概 念,現代樣品前處理技術,1、進展和發(fā)展趨勢,2、樣品處理的原則,3、樣品制備原理,4、現代樣品前處理技術,5、其它相關技術,樣品前處理：采樣技術和樣品制備技術。采集樣品適合分析的形態(tài)。 前處理不好 需要靈敏度高、測定范圍寬的檢測器和分離效率高的分離柱。 過程耗時、繁瑣、誤差 發(fā)展趨勢：,1 、進展和發(fā)展趨勢,制備過程中避免組分發(fā)生化學變化； 要防止和避免欲測定組分的沾污； 盡可能減少無關化合物引入制備過程； 盡可能快速，簡單易行。,2、樣品處理的原則,原 則:,3、樣品制備原理,利用被檢測物質與樣品基質的物理化學差異，使其從檢測系統有干擾作用的樣品基質中提取分離出來（相似相溶）。 極性-溶解度、分配系數；揮發(fā)性-蒸汽壓。,、分子的極性和水溶性,1、分子的極性: 提取、凈化條件的重要參考依據。 相似相溶原理：使用與被分析物質極性相近的溶劑為提取劑，使被分析物在溶劑中達到最大溶解度。 分子極性判斷：電負性、空間構型,電負性：電負性綜合考慮了電離能和電子親合能，首先由萊納斯鮑林于1932年提出。它以一組數值的相對大小表示元素原子在分子中對成鍵電子的吸引能力，稱為相對電負性，簡稱電負性。元素電負性數值越大，原子在形成化學鍵時對成鍵電子的吸引力越強。,2、水溶性 被分析物的極性決定其在溶劑中的溶解性。 影響溶解性的其他因素 溫度：高溶解性高 一般溫度每上升10 ，溶解度增加一倍，但氣體則隨溫度的上升溶解度下降。 含鹽量：鹽會降低有機物的溶解度?！胞}析” pH：影響可解離的物質的溶解度,、分配定律,分配定律：在一對互不相溶的兩相溶劑系統中，由于物質在非極性相和極性相中的溶解度不同，當達到平衡時，物質在該兩相中的濃度比在一定條件下為常數的定律。 KD （分配系數） = A非極性相 / B極性相,KD 稱為分配系數(distribution coefficient)，其值大小與溶質、溶劑的性質及平衡時的溫度等條件有關，與相體積無關。KD值越大，存在于非極性溶劑中的分析物越多，越有利于用非極性溶劑向極性溶劑中提取分析物，而KD值越小，則存在于極性溶劑中分析物越多，越有利于用極性溶劑向非極性溶劑中提取分析物。,、揮發(fā)性與蒸汽壓,揮發(fā)性：液態(tài)或固態(tài)物質轉變?yōu)闅鈶B(tài)的物理性能。 揮發(fā)性決定：物質在氣-液或氣-固兩相中的分布。分為沸點和蒸汽壓。它在氣相色譜、頂空提取和吹掃捕集等提取分析物的常用技術方法中得到應用。 蒸汽壓：固態(tài)、液態(tài)氣態(tài),4 、現代樣品前處理技術,固相微萃取,超聲波提取,微波輔助 萃取,超臨界流體萃取,樣品制備,固相萃取,頂空技術,4-1、固相萃取技術,固相萃取(solid phase extraction ,SPE)是 由液固萃取和柱液相色譜技術相結合發(fā)展而來, 近年來得到了快速的發(fā)展。在樣品分離提純方面發(fā)揮了越來越重要的作用., 、固相萃取(SPE)概念,SPE ：Solid Phase Extraction 是一種液相色譜分離，利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物與干擾化合物分離，達到分離和富集目標化合物的目的。,2 、固相萃取的模式及原理,反相固相萃取 正相固相萃取 離子交換固相萃取, 陰離子交換 陽離子交換,、反相固相萃取,流動相：極性（水溶液）或中等極性 固定相：非極性。 分離對象：中等到非極性物質。,、正相固相萃取,流動相：非極性、中等極性 固定相：極性。 分析物質：極性、中等極性、非極性,、離子交換固相萃取,適用于帶有電荷的化合物（水溶液、有機溶液）。 原理：靜電吸引，化合物上的帶電荷基團與鍵合硅膠上的帶電荷基團之間的相互作用。 分為：陰離子交換和陽離子交換。,1 、陰離子（負電荷）交換,LC-SAX、脂肪族季銨類鹽 + 硅膠,SAX 是脂肪族季銨鹽類鍵合到硅膠上，季銨鹽是一個很強的堿，帶有一個正電荷，能交換或吸附溶液中的陰離子。季銨鹽的pka 很高(14),在水溶液中，所有的pH 條件下，都能帶上電荷。對于陰離子分析物，為了使之帶上電荷，其pH 值必須比其pka大2 個單位。大多數情況下，被分析物是強酸性或者是弱酸性的。,2、陽離子交換,LC-SCX：磺酸基；LC-WCX：羧酸基團,SCX 是磺酸基鍵合在硅膠表面。磺酸基有很強的的酸性（pka1），能吸附或者交換溶液中的陽離子。在所有的pH 條件下，這種官能團都能帶上電荷。對所分析的陰離子化合物，其樣品的pH 值要比其pka 小2 個單位，以保證其帶電荷。通常分析的化合物是強堿性或弱堿性的。, 溶劑的選擇, 目標化合物在極性/非極性溶劑中的溶解度，這主要涉及淋洗液的選擇。 目標化合物有無可能離子化（可用調節(jié)pH值實現離子化）。 目標化合物有無可能與吸附劑形成共價鍵。 目標化合物和雜質在吸附劑上吸附點的競爭程度，關系到能否很好分離。,、固相萃取的裝置及操作程序,固相萃取的裝置,1、固相萃取的裝置,2、操作程序,（1）、活化吸附劑 萃取之前要用適當的溶劑淋洗小柱，以使吸附劑保持濕潤，可以吸附目標化合物或干擾化合物。,2、操作程序,（2）、上樣（吸附） 樣品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加壓或離心的方法使樣品進入吸附劑。,2、操作程序,3）、洗滌（去除雜質） 在樣品進入吸附劑，目標化合物被吸附后，可先用較弱的溶劑將弱保留干擾化合物洗掉。,2、操作程序,4）、洗脫和收集 再用較強的溶劑將目標化合物洗脫下來，加以收集。,、SPE分離機制與溶劑的選擇,固相萃取的應用領域,固相萃取小柱體積的選擇：可根據樣品的量和對萃取速度的要求來確定,加拿大Silicycle公司產品,4-2、固相微萃取 SPME,SPME是在固相萃取的基礎上發(fā)展起來的一種樣品前處理技術，集采樣、萃取、濃縮、進樣為一體，對樣品有很強的富集作用，可以大大提高分析靈敏度。,SPME的發(fā)展歷史 1989年，加拿大的Pawliszyn 提出 1993年，商品化Fiber-SPME 1993年， （管內固相微萃?。㊣n-Tube-SPME -GC 1996年，商品化Fiber-SPME-HPLC 1997年，商品化Fiber-SPME-GC 1997年， In-Tube-SPME-HPLC 1999年，Pat Sandra 提出（攪拌棒吸附萃?。㏒BSE技術 2001年，一種新形式In-Tube SPME-GC,原理和方法,原理: 通過在樣品與固相涂層間的平衡來達到分離。,方法： 玻璃纖維浸入樣品中被分析物質擴散吸附平衡取出玻璃纖維洗脫分析。,固相微萃取裝置,類似于微型注射器： 手柄和萃取纖維頭 關鍵：石英纖維上涂吸附劑 原則：目標化合物是非極性時選擇非極性涂層；目標化合物是極性時選擇極性涂層。,固相微萃取裝置,非極性涂層,極性涂層,中等極性 混合型,固定相涂層的類型,如: 聚丙烯酸酯(PA)、聚乙二醇 ( C W ) ，適于極性化合物,如: 聚二甲基硅氧烷(PDMS)，適于非極性和弱極性化合物,如: 聚乙二醇- 聚二乙烯基苯(CW-DVB)、羧乙基- 聚二乙烯基苯(CAR-DVB)、羧乙基- 聚二乙烯基苯- 聚二甲基硅氧烷(CAR-DVB-PDMS)等,影響萃取效率的因素,1. 涂層性質和厚度的影響 涂層厚度對分析的固相吸附量和平衡時間都有影響， 涂層越厚，固相吸附量越大，靈敏度亦越高；達到分析平均的時間越長，解析平衡時間也越長，分析速度慢; 涂層厚度對分析靈敏度影響較大，對分析速度影響較小。,2. 萃取時間的影響 萃取時間即萃取達到平衡所需的時間，由待分析物的分配系數、物質的擴散速率、樣品基質、樣品體積、萃取頭膜厚等因素決定，是影響涂層萃取量的一個重要因素.,影響萃取效率的因素,3. 萃取溫度的影響 溫度升高，分析物擴散速度增大，蒸汽壓也隨之增大，可提高分析速度。溫度升高，使分析物的分配系數減小，固相吸附量減少。根據樣品的性質確定最佳萃取溫度，一般萃取溫度為4 0 80 。,4. 攪拌的影響 攪拌是影響SPME分析速度的重要因素。樣品經攪拌后可以促進萃取并減少萃取時間，特別對于大分子量和高擴散系數的組分。一般攪拌形式有磁力攪拌、高速勻漿、超聲波等方式，采取攪拌方式時一定要注意攪拌的均勻性,影響萃取效率的因素,5. 鹽的影響 萃取前于樣品中添加無機鹽(NaCl、Na2SO4等) ，水溶液的離子強度增大，有機物的溶解度減小產生鹽析，分配系數提高，增加萃取頭固定相對分析組分的吸附，可提高分析的靈敏度。一般添加無機鹽適用于頂空方式，對于浸入方式，鹽分容易損壞萃取頭。,6. pH值的影響 調節(jié)至合適的pH值，使有機物在水中溶解度減小，增大分配系數，提高分析的靈敏度，但pH 值過高或過低都會影響固定相涂層的使用壽命。,特 點,實現了無溶劑化 減輕了對環(huán)境的負擔 裝置便于攜帶，操作簡單，成本低廉，適于推廣應用 并且可以實現野外現場取樣分析,方 法,研 究 進 展,與GC連用: (最早) 主要適用于小分子量高揮發(fā)性物質或半揮發(fā)性物質的測定。 缺點:不適用于熱不穩(wěn)定性物質的萃取測定，也不適用于極性大, 不易揮發(fā)物質的萃取測定 樣品脫附: 熱解析 幾秒,2. 與高效液相色譜( H P L C ) 的聯用: 系統還處于發(fā)展階段, 適合于極性較大的物質 樣品脫附: 溶劑洗脫,3. 與毛細管電泳( CE ) 的聯用: 微量分析,固相微萃取技術在食品中的應用,分析食品風味物質的組成,農藥殘留,水果 蔬菜,葡 萄 酒,肉 類 制 品,酒 類 風 味,天然調味料,茶 葉 品 質,水果 蔬菜,SPME 技術的發(fā)展趨勢,進一步發(fā)展SPME 與各種分析儀器的聯用，以拓寬其使用范圍; 研制更多新型涂層和涂漬技術的改進; 使裝置自動控制系統更趨完善和成熟; SPME 裝置及外圍設備進行改進，使其適應工業(yè)和野外自動采樣和檢測; S P M E 的理論也將會得到更進一步的發(fā)展。,4-3 、超臨界流體萃取 技術,超臨界流體 超臨界流體萃取技術,1.1 超臨界流體的含義,超臨界流體（SCF）是指在臨界溫度和臨界壓力以上的流體。高于臨界溫度和臨界壓力而接近臨界點的狀態(tài)稱為超臨界狀態(tài)。處于超臨界狀態(tài)時，氣液兩相性質非常接近，以至于無法分辨，故稱之為SCF。,1. 超臨界流體,1822年，Cagniard 首次報道物質的臨界現象。 1879年，Hanny and Hogarth 發(fā)現了超臨界流體對固體有溶解能力，為超臨界流體的應用提供了依據。 1943年，Messmore首次利用壓縮氣體的溶解力作為分離過程的基礎，發(fā)展出超臨界萃取方法。 1970年，Zosel采用sc-CO2萃取技術從咖啡豆提取咖啡因，從此超臨界流體的發(fā)展進入一個新階段。 1992年，Desimone 首先報道了sc-CO2為溶劑，超臨界聚合反應，得到分子量達27萬的聚合物,開創(chuàng)了超臨界CO2高分子合成的先河。,1.2 超臨界流體的發(fā)展,1.3 超臨界流體的性質,密度類似液體，因而溶劑化能力很強，壓力和溫度微小變化可導致其密度顯著變化 粘度接近于氣體, 具有很強傳遞性能和運動速度 擴散系數比氣體小，但比液體高一到兩個數量級； SCF的介電常數，極化率和分子行為與氣液兩相均有著明顯的差別; 壓力和溫度的變化均可改變相變,1.4 超臨界流體的主要特性,2. 超臨界流體萃取技術,2.1 超臨界萃取概述,超臨界流體萃取 (Supercritical Fluid Extraction，SFE)是一項新型提取技術，它是利用超臨界條件下的氣體作萃取劑，從液體或固體中萃取出某些成分并進行分離的技術。 超臨界條件下的氣體，也稱為超臨界流體(SF)，是處于臨界溫度(Tc)和臨界壓力 (Pc)以上，以流體形式存在的物質。通常有二氧化碳(CO2)、氮氣(N2 )、氧化二氮(N2 O)、乙烯 (C2 H4)、三氟甲烷 (CHF3 )等。,超臨界流體具有選擇性溶解物質的能力，并隨著臨界條件（T，P）而變化。超臨界流體可從混合物中有選擇地溶解其中的某些組分，然后通過減壓，升溫或吸附將其分離析出。,2.2 基本原理,超臨界萃取劑的臨界溫度越接近操作溫度，則溶解度越大。臨界溫度相同的萃取劑，與被萃取溶質化學性質越相似，溶解能力越大。應該選取與被萃取溶質相近的超臨界流體作為萃取劑。,2.3 超臨界流體的選擇性,用作萃取劑的超臨界流體應具備以下條件: 化學性質穩(wěn)定，對設備沒有腐蝕性，不與萃取物反應； 臨界溫度應接近常溫或操作溫度，不宜太高或太低； 操作溫度應低于被萃取溶質的分解變質溫度； 臨界壓力低，以節(jié)省動力費用； 對被萃取物的選擇性高（容易得到純產品）； 純度高，溶解性能好，以減少溶劑循還用量； 貨源充足，價格便宜，如果用于食品和醫(yī)藥工業(yè)，還應考慮選擇無毒的氣體。,2.4 超臨界流體的選擇原則,改性劑,分別混合: 2臺泵,胡蘿卜在不同丙酮含量下胡蘿卜素在CO2中的溶解度和提取率。,1. CO2超臨界萃取具有廣泛的適應性，特別對于天然物料 的萃取，其產品稱得上是100%純天然產品。,2. 可在較低溫度下操作，特別適合于熱敏性物質，完整保留生物活性，而且能把高沸點，低揮發(fā)度，易熱解的物質分離出來。,3. 溶劑沒有污染，可以回收使用，簡單方便，節(jié)省能源。,4. 須在高壓下操作，設備與工藝要求高，一次性投資比較大。,2.5 超臨界CO2萃取的特點,超臨界流體萃取裝置組成,（1）超臨界流體發(fā)生源，由萃取劑儲瓶、高壓泵及其他附屬裝置組成，其功能是將萃取劑由常溫壓態(tài)轉化為超臨界流體。 （2）超臨界流體萃取部分，由樣品萃取管及附屬裝置組成，處于超臨界態(tài)的萃取劑在這里將被萃取的溶質從樣品基質中溶解出來，隨著流體的流動，使含被萃取溶質的流體與樣品基體分開。 （3）溶質減壓吸附分離部分，由噴口及吸收管組成，萃取出來的溶質及流體，必須由超臨界態(tài)經噴口減壓降溫轉化學常溫常壓態(tài)，此時流體揮發(fā)逸出，而溶質在吸收管內多孔填料表面，用合適溶劑洗吸收管，就可把溶質洗脫收集備用。,超臨界流體萃取裝置過程,將萃取原料裝入萃取釜。二氧化碳氣體經熱交換器冷凝成液體，用加壓泵把壓力提升到工藝過程所需的壓力(應高于二氧化碳的臨界壓力)，同時調節(jié)溫度，使其成為超臨界二氧化碳流體。二氧化碳流體作為溶劑從萃取釜底部進入，與被萃取物料充分接觸，選擇性溶解出所需的化學成分。含溶解萃取物的高壓二氧化碳流體經節(jié)流閥降壓到低于二氧化碳臨界壓力以下進入分離釜(又稱解析釜)，,由于二氧化碳溶解度急劇下降而析出溶質，自動分離成溶質和二氧化碳氣體二部分，前者為過程產品，定期從分離釜底部放出，后者為循環(huán)二氧化碳氣體，經過熱交換器冷凝成二氧化碳液體再循環(huán)使用。整個分離過程是利用二氧化碳流體在超臨界狀態(tài)下對有機物有特異增加的溶解度，而低于臨界狀態(tài)下對有機物基本不溶解的特性，將二氧化碳流體不斷在萃取釜和分離釜間循環(huán)，從而有效地將需要分離提取的組分從原料中分離出來。,壓縮機,萃取釜,制冷MVC-760L,二氧化碳循環(huán)泵,超臨界流體萃取技術在食品中的應用,逐 步 產 業(yè) 化,天然香料色素的生產,食 品 脫 臭,油質的提取分離,1.德國伍德公司,云南亞太致興生物工程研究所,4-4、微波萃取,微 波,金屬,水分,微波萃取,微波： 頻率：300300 000MHz的電磁波。 穿透：玻璃、塑料、陶瓷等絕緣體。 當微波作用于水和酸性物質時，將被極性分子所吸收，因而物質很快被加熱。,微波輔助萃取,微波輔助萃取：微波和傳統的溶劑提取法相結合的一種萃取方法，利用不同結構的化合物吸收微波能力的差異，使得細胞內的某些成分被微波選擇性加熱，導致細胞結構發(fā)生變化，從而提高有效成分的溶出程度和速度。20世紀70年代，普通家用微波爐首次走進實驗室；80年代，首次發(fā)表了微波用于植物提取的文獻；90年代商業(yè)化的MAP(microwaveassisted extractionprooess)開始應用于中藥有效成分的提取；,工作原理,吸收微波細胞內部溫度，細胞內部壓力超過細胞壁膨脹承受能力細胞破裂有效成分自由流出。,影響因素,（一）萃取溫度的影響 （二）萃取時間的影響 （三） 萃取溶劑的影響 （四） 樣品杯：聚四氟乙烯,特 點,質量高,可有效保護食品中的功能成分 對萃取物具有高選擇性 省時(50-90%) 溶劑用量少(50-90%),微波提取在應用中應注意 的幾個問題, 微波對不同的植物細胞或組織有不同的作用，對細胞內產物的釋放也有一定的選擇性。因此應根據產物的特性及其在細胞內所處的位置的不同，選擇不同的處理方式。 微波提取僅適用于對熱穩(wěn)定的產物，如生物堿、黃酮、苷類等，而對于熱敏感的物質如蛋白質、多肽等，微波加熱能導致這些成分的變性、甚至失活。 由微波加熱原理可知，微波提取要求被處理的物料具有良好的吸水性，否則細胞難以吸收足夠的微波能將自身擊破，使其內容物難以釋放出來。,微波萃取技術在食品中的應用,食品分析,農獸藥殘留,海產品中的重金屬,真 菌 毒 素,4-5、超聲波輔助萃取,原理： 能量外部向內部傳遞。 超聲波使溶液形成氣泡（空化效應）爆裂溫度和壓力，增強化學反應能力。,優(yōu)點：價廉快速，簡便安全，批量處理樣品。,4-6、氣體萃取（頂空技術）,取樣品基質（液體和固體）上方的氣相部分進行色譜分析。 用途：痕量高揮發(fā)性物質的分析測定，氣體是揮發(fā)性物質的最理想的溶劑。,特 點, 操作簡單 可自動化 可變因素多 靈敏度高：檢出限可達10-12水平。,分 類,靜態(tài)頂空：在一個密閉的容器中，樣品與樣品上方氣體（1/2）達到平衡。 動態(tài)頂空： “連續(xù)氣體萃取”方法，不必兩相達到平衡。經捕集濃縮后進行測定。,5、其它相關技術,衍生化技術 生物大分子的細胞破碎 與蛋白質的去除,衍生化技術,化學反應定量生成適于分析。,目的： 靈敏度與選擇性 改善色譜分離： 揮發(fā)性、降低與色譜材料的相互作用 理化穩(wěn)定性,分 類,柱前衍生化：為了分離 柱后衍生化：為了檢測,氣相色譜的衍生化,（1）硅烷化衍生化方法 （2）酯化衍生化方法 （3）鹵化衍生化方法 （4）酚化衍生化方法,方法,（1）、硅烷化衍生化方法,利用醇，酚，酸，胺等與硅烷化試劑反應，形成揮發(fā)性的硅烷衍生物,（2）酯化衍生化方法,大多數有機酸揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差。在GC分析之前衍生為相應的酯。, 甲醇法 重氮甲烷法 三氟乙酸配法, 甲醇法,甲醇法 有機酸與甲醇在催化劑的存在下加熱，可以發(fā)生酯化反應，生成有機酸的甲酯, 重氮甲烷法,與有機酸反應，生成有機酸的甲酯， 重氮甲烷不穩(wěn)定，有爆炸性，有毒。,（3）、鹵化衍生化方法,引入鹵原子ECD檢測器也改善揮發(fā)性和穩(wěn)定性。,鹵素的作用是加成或取代,液相色譜的衍生化,1. 紫外衍生化反應,2 熒光衍生化反應,3 電化學衍生化反應,（1）紫外衍生化反應,苯甲酰氯 + 胺、醇、酚苯甲酸酯類衍生物（ ）,苯甲?；磻?