生物技術制藥總結

第一章 緒論一、生物技術的發(fā)展簡史答：以技術特征來分可分為：傳統(tǒng)生物技術，近代生物技術，現(xiàn)代生物技術1、傳統(tǒng)生物技術階段 遠古人們對微生物的利用，釀造技術 1680年發(fā)現(xiàn)了微生物、揭示了發(fā)酵現(xiàn)象的奧秘 19世紀末，20世紀30年代出現(xiàn)了工業(yè)發(fā)酵、開創(chuàng)了工業(yè)微生物的新時期特點：生產(chǎn)過程簡單、生產(chǎn)設備要求低、產(chǎn)品多為結構簡單的初級代謝產(chǎn)物2、近代生物技術階段 1941年，開發(fā)研究青霉素 抗生素工業(yè) 氨基酸發(fā)酵工業(yè) 20世紀50年代 酶制劑工業(yè) 20世紀60年代特點 ：產(chǎn)品類型多、生產(chǎn)技術要求高、生產(chǎn)設備規(guī)模巨大、技術發(fā)展速度快。 3、現(xiàn)代生物技術階段 1953年watson ,crick.提出生命基本物質(zhì)DNA雙螺旋結構模型 1974年Boyer和Cohen建立了DNA重組技術 1975年，雜交瘤技術（抗體工程） 1977年，基因操作手段獲得生長激素抑制因子。胰島素等克隆。 1982年基因工程產(chǎn)品被投放市場。 2001年人類基因組草圖完成特點：（1）基因操作技術日新月異（2）新技術新方法迅速應用（3）基因工程藥物和疫苗研究開發(fā)快（4）新的生物治療制劑產(chǎn)業(yè)化前景光明（5）轉基因動、植物取得重大突破（6）現(xiàn)代生物技術給農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)帶來飛躍（7）重要基因的結構和功能研究是今后的研究熱點（8）基因治療取得了大的進展（9）蛋白質(zhì)工程的發(fā)展（10）生物信息學的發(fā)展二、生物技術藥物的分類答：1.生物技術制藥：采用現(xiàn)代生物技術、借助某些微生物、植物或動物來生產(chǎn)所需要的藥品。2.生物技術藥物：采用DNA重組技術或其他生物新技術研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。3.生物藥物：泛指包括生物制品在內(nèi)的生物體的初級和次級代謝產(chǎn)物或生物體的某一組成部分，甚至整個生物體用作診斷和治療疾病的醫(yī)藥品。4.生物藥物的分類（1）應用重組DNA技術制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療藥物（2）基因藥物（3）動物、植物和微生物的天然藥物（4）合成和部分合成的生物藥物。按功能分類（1）治療藥物（2）預防藥物（3）診斷藥物。三、生物技術制藥的特征：高技術，高投入，長周期，高風險，高收益。四、利用基因工程技術生產(chǎn)的兩個不同途徑：1.用克隆的基因表達生產(chǎn)有用的肽類和蛋白質(zhì)藥物或疫苗。2.利用基因工程技術改造傳統(tǒng)的制藥工業(yè)。第二章 基因工程制藥一、基因工程新藥：免疫性蛋白，細胞因子，激素，酶類。二、基因工程技術生產(chǎn)藥品的優(yōu)點（簡答）：1.利用基因工程技術可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（胰島素，干擾素，細胞因子等）。2.可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和機構進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應用范圍。3.利用基因工程可以發(fā)現(xiàn)挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。4.可以彌補內(nèi)源生理活性物質(zhì)藥物的不足，并對其進行改造。5.利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。三、目的基因的獲得原核細胞（較易獲得目的基因）基因組較小，可直接分離獲得。基因組限制性內(nèi)切酶水解成若干片段探針篩選提純擴增真核生物：一個單拷貝基因僅占整個基因組的10 甚至更少，不易獲得。構建cDNA文庫構建基因文庫人工合成PCR擴增DNA文庫：通過重組、克隆保存在宿主細胞中的各種DNA分子的集合體。文庫保存了該種生物的全部遺傳信息，需要時可從中分離獲得。如何構建DNA文庫：1.分離純化基因組DNA。條件應溫和，以保證得到較長的DNA鏈。2.DNA片段與載體連接?；蚪MDNA酶水解具一定長度的片段（粘性末端）載體（噬菌體等）酶解與目的基因連接3.導入宿主細胞：攜帶基因組DNA片段的噬菌體或粘粒經(jīng)包裝后轉入宿主細胞內(nèi)培養(yǎng)擴增。插入基因組片段的集合體即基因組文庫。4.篩選目的基因：原核細胞不可用來作為基因的表達系統(tǒng)（無轉錄后加工）。原核細胞基因庫只能用核算探針雜交篩選目的基因。cDNA文庫：以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA。利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。特點：（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構建。如何構建cDNA文庫：cDNA以mRNA為模板經(jīng)逆轉錄而成，故須選擇mRNA豐富、較易獲得的、目的基因表達活躍的組織細胞為材料。（1）修飾cDNA兩端接頭：人工合成的雙鏈寡核苷酸，二端均為平頭或含酶切位點。銜接頭：一端為平頭，一端為粘末端。（2）cDNA與載體相連各cDNA各自與一個載體在T4連接酶作用下以粘末端互相連接，即為重組DNA 分子。（3）導入宿主細胞 重組體在一定條件下導入宿主細胞培養(yǎng)或保存。宿主細胞必須是來自一個細胞的克隆體，以保證它們的遺傳性狀相同。（4）篩選目的基因 核酸雜交法：cDNA克?。ň呋蚴删撸┫跛崂w維素膜雜交（DNA探針）顯影定位挑選培養(yǎng)擴增純化。四、目的基因序列測定法：1、雙脫氧鏈終止法（Sanger法）原理：DNA鏈中的戊糖在3位碳原子上有-OH基團，在DNA合成、鏈的延長過程中，新?lián)饺氲拿撗鹾塑账?-p與前一核苷酸的戊糖3-OH以磷酸二酯鍵相連。 Sanger法是在反應體系中加入 2, 3 -ddNTP，由于其沒有 3-OH 而不能與下一個核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。2、化學裂解法（Maxam-Gilbert法）原理：使特定的堿基首先被化學修飾，然后再經(jīng)化學處理。如：用硫酸二甲酯使鳥嘌呤甲基化，然后再加哌啶，使甲基化的鳥嘌呤丟失，DNA鏈從鳥嘌呤修飾處后的3，5-磷酸二酯鍵斷裂。3、自動測序儀測序法 (ABI)原理：自動測序儀基于2，3-雙脫氧末端終止法的原理，標記系統(tǒng)由放射性核素改為發(fā)特定熒光信號的熒光染料，預先將四種熒光染料與四種雙脫氧核苷三磷酸共價相連，使其帶有不同的熒光標記。當某一種ddNTP摻入到正在合成的DNA單鏈分子中時，該鏈的延伸便終止并帶有相應的熒光染料。自動測序系統(tǒng)包括電泳分離系統(tǒng)、熒光檢測裝置、計算機成像系統(tǒng)及分析軟件組合。其它大片序列測序方法：隨機克隆法（先水解再亞克?。⑾拗菩悦盖衅蝸喛寺》?、互套缺失法（定向連續(xù)次級克隆） 五、表達載體具備的條件：1，載體能夠獨立地復制。2，應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記。3，應具有很強的啟動子。4，應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當受到誘導時才能進行轉錄。5，應具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉錄克隆的外源基因，而不轉錄其它無關的基因，同時很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。6，所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號。六、常用的酵母啟動子：【組成型】：磷酸甘油酸激酶，烯醇酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶，乙醇脫氫酶，磷酸三糖異構酶，信息素-因子，細胞色素-c?！菊T導型】：酸性磷酸酯酶，半乳糖激酶，UDP-D-半乳糖-4-差向酶。七、大腸桿菌表達外源蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點：細胞質(zhì)中：優(yōu)點：1，形成包涵體。2，蛋白質(zhì)產(chǎn)量高。3，表達的鍵簡單。 缺點：1，形成包涵體。2，還原環(huán)境不利于二硫鍵的形成。3，N-末端真實性受影響。4，蛋白質(zhì)酶解。5，種類分離純化復雜。細胞周質(zhì)：優(yōu)點：1，由于周質(zhì)蛋白質(zhì)種類少，純化簡單。2，蛋白質(zhì)酶解不甚嚴重。3，促進二硫鍵形成與蛋白質(zhì)折疊作用。4，蛋白質(zhì)N-末端結構真實。 缺點：1，信號肽并非總有助于蛋白質(zhì)轉運。2，有可能形成包涵體。細胞外：優(yōu)點：1，酶解作用程度低。2，容易純化。3，促進蛋白質(zhì)折疊作用。4，蛋白質(zhì)N-末端結構真實。 缺點：1，大腸桿菌中表達真實的外源蛋白質(zhì)不會分泌到細胞外。2，分泌在細胞內(nèi)的稀釋，分離純化相當復雜。融合蛋白：真核基因在大腸桿菌中表達時，產(chǎn)生的一種氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，由一條短的原核多肽和真核蛋白結合在一起的蛋白。八、人胰島素的生產(chǎn)方法：簡答胰組成結構 通過什么方式九、大腸桿菌表達中遇到的問題：1，內(nèi)含子 mRNA 酶系 錯誤產(chǎn)物。2，轉錄信號不同。3，分子結構。4，真核蛋白質(zhì)分離加工。5，降解。十、基因工程菌遺傳的不穩(wěn)定性的表現(xiàn)：1.結構不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失,重排,修飾,導致其表觀生物學功能的喪失。2,分配不穩(wěn)定性：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸。十一、基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制（導致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的原因）：1， 受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解。2， 外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝。3， 重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配。4， 受體細胞中內(nèi)源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排。十二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法：選擇合適的宿主菌。選擇合適的載體。選擇壓力。分階段控制培養(yǎng)?？刂婆囵B(yǎng)條件。固定化。一些基因重組菌在復合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性。十三、基因工程菌的培養(yǎng)方式：1，分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。2，連續(xù)培養(yǎng)：是將種子接入發(fā)酵反應器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。3，透析培養(yǎng)：是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。4，固定化培養(yǎng)：基因工程菌經(jīng)過固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，對分泌型菌更為有利。十四、培養(yǎng)基常用碳源：葡萄糖，甘油，乳糖，甘露糖，果糖。 氮源：酵母粉，蛋白胨，酪蛋白水解物，玉米漿，氨水，硫酸銨，氯化銨不同的碳源對菌體生長和外源基因表達有較大影響：使用葡萄糖和甘油菌體比生長速率和呼吸強度相差不大。葡萄糖對lac啟動子有抑制作用。用甘露糖做碳源不產(chǎn)生乙酸。乳糖啟動子使用乳糖作碳源較為有利，乳糖同時還起誘導作用。無機磷的影響：過量的無機磷會刺激葡萄糖的利用、菌體生長和氧消耗。在低磷濃度下，盡管最大菌體濃度較低，但產(chǎn)物比產(chǎn)率及產(chǎn)物濃度都最高。啟動子只有在低磷酸鹽的情況下才被啟動。溫度的影響：溫度對基因表達調(diào)控作用可發(fā)生在復制，轉錄，翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子合成水平上。大腸桿菌合成青霉素酰化酶不僅受苯乙酸誘導和葡萄糖調(diào)控，而且受溫度調(diào)控。是由于影響了細胞內(nèi)青霉素?；竚RNA的濃度。十五、如何建立基因工程菌分離工藝一、建立分離純化工藝需了解的各種因素：1，含目的產(chǎn)物的起始物料的特點。1）菌種類型及其代謝特性。2）原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量。3）生產(chǎn)工藝和條件。4）初始物料的物理化學和生物學特性。2，物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。3，目的產(chǎn)物特性4，產(chǎn)品質(zhì)量的要求。二、分離純化的基本過程：細胞破碎，固液分離，濃縮與初步純化，高度純化直至得到成品，成品加工。細胞破碎的方法：機械法-非機械法；物理法（勻漿法、珠磨法、超聲法），化學法（滲透沖擊、增容法），生物法（酶溶法）。固液分離常用方法：離心沉淀，膜過濾，雙水相萃取。三、選擇分離純化方法的依據(jù)：1根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇。2根據(jù)分離單元之間的銜接選擇。應盡早采用高效分離手段，將含量最多的雜質(zhì)先分離去除，將最昂貴最費時的分離單元放在最后階段。色譜分離次序的選擇同樣重要，經(jīng)鹽析后的液體不適宜于離子交換層析，但對疏水層析則可直接應用。離子交換、疏水及親和色譜通?？梢云鸬降鞍踪|(zhì)的濃縮的效應。親和層析選擇性最強，多放在第二步以后。3根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇1）應具有良好的穩(wěn)定性和重復性。2）盡可能減少組成工藝的步驟。3）組成工藝的各技術或步驟之間要能相互適應和協(xié)調(diào)，工藝和設備相適應。4）在工藝過程中盡可能少用試劑，尤其是對穩(wěn)定性差的產(chǎn)物。5）分離純化工藝所用的時間盡可能短，尤其是對穩(wěn)定性差的產(chǎn)物。6）工藝和技術必須是高效，收率高，易操作，對設備條件要求低，能耗低。7）具有較高的安全性。四、分離純化的技術要求：1技術條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。2選擇性要好，能從復雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離出來，達到較高的純化倍數(shù)。3收率要高。4兩個技術之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調(diào)整。5整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。十七、包含體的分離、溶解和復性：細胞破碎固液相分離去污劑或低濃度尿素或鹽酸胍去除可溶性蛋白和膜蛋白高濃度尿素或鹽酸胍溶解包含體，DTT打開二硫鍵逐步透析或稀釋去除變性劑。第三章 動物細胞工程制藥一、 如何選擇培養(yǎng)基（簡答題）：培養(yǎng)基的基本要求：營養(yǎng)成分，促生長因子，激素，滲透壓，PH，無毒無污染。1建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應該是這種細胞首選的培養(yǎng)基，查閱參考文獻，根據(jù)細胞株建議的培養(yǎng)基。2根據(jù)細胞株的特點和實驗要求選擇培養(yǎng)基。3用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結果選擇效果好的。二、 天然培養(yǎng)基：血清：成分：由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種多肽，脂肪，碳水化合物，生長因子，激素，無機物等。作用：1提供基本營養(yǎng)物質(zhì)。2提供激素和各種生長因子。3提供結合蛋白。4對培養(yǎng)基中的細胞起到某些保護作用。質(zhì)量標準：取材對象。取材過程。促生長效果?？寺⌒纬陕?。貼瓶率測定。續(xù)傳代培養(yǎng)。外觀：透明清亮，土黃或棕黃色。無沉淀或極少。渾濁沉淀多蛋白質(zhì)變性。棕紅色取材時有溶血現(xiàn)象。液體稀薄摻入生理鹽水過多。三、 合成培養(yǎng)基：人工設計，配制的培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基：優(yōu)點是成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)。氨基酸、維生素、糖類、無機鹽、其他成分（酚紅指示劑）。無血清培養(yǎng)基：即不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間繁殖的合成培養(yǎng)基。HamF12與DMEM1：1混合。優(yōu)點是1提高了細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了血清批次之間差異的影響。2減少了有血清帶來的病毒真菌支原體等微生物污染的危險。3供應充足，穩(wěn)定。4細胞產(chǎn)品易于純化。5避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性。6減少了血清中蛋白對某些微生物測定的干擾，便于對實驗結果的分析。無蛋白培養(yǎng)基：不含有動物蛋白的培養(yǎng)基限定化學成分培養(yǎng)基：指培養(yǎng)基中所有成分都是明確的平衡鹽溶液：由無機鹽，葡萄糖組成。維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其它試劑。消化液：用于取材進行原代培養(yǎng)時需要將組織塊消化解離形成細胞懸液。傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來。EDTA溶液（破壞細胞間的連接），膠原酶溶液（上皮類細胞原代培養(yǎng)時使用），胰酶溶液（消化酪蛋白）添加的抗生素：青霉素（革蘭陽性菌），鏈霉素（革蘭陰性菌）細胞營養(yǎng)污染的原因途徑：空氣，器材，操作，血清，組織樣本。污染補救措施：抗生素排除法（有價值的細胞），加溫除菌（支原體污染），動物體內(nèi)接種（腫瘤細胞），與巨噬細胞共培養(yǎng)第四章 抗體制藥一單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞體系，此細胞系能產(chǎn)生結構和特異性完全相同的高純度抗體。是針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細胞產(chǎn)生的，故稱單克隆抗體。（高度特異性，均一性，有穩(wěn)定來源可大量生產(chǎn)）二 B淋巴細胞及特點：三 骨髓瘤細胞及特點：四 利用HAT篩選機理：1體內(nèi)合成DNA兩途徑（主要 旁路）2HAT中有氨基蝶呤，抑制主要途徑，可以利用另兩個成分旁路合成DNA，正常的B細胞有旁路途徑，而腫瘤細胞沒有旁路途徑，B細胞與腫瘤細胞融合后有B細胞的旁路途徑，比B細胞長命，所以可以存活。五 人-鼠嵌合抗體：在基因水平上把鼠源性單克隆抗體的重鏈H和輕鏈L可變區(qū)分離出來，分別與人Ig的重鏈和輕鏈的穩(wěn)定區(qū)C基因連接成人-鼠嵌合