斷面修復(fù)過(guò)程微生物生態(tài)變化研究

斷面修復(fù)過(guò)程微生物生態(tài)變化研究張洪勛 李珂（中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院）1、課題背景和意義 我國(guó)高速公路的迅猛建設(shè)雖然帶動(dòng)了區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展，然而對(duì)沿線的生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了很大的壓力，特別是生態(tài)環(huán)境脆弱地帶，使自然人文景觀、生態(tài)環(huán)境都受到嚴(yán)重的破壞。隨著道路設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)的逐步提高，路基填挖高度加大，勢(shì)必造成大量的高填深挖路段，嚴(yán)重破壞公路沿線的原有生態(tài)特性。另外，在施工過(guò)程中的亂挖、亂棄土石方，大量的廢棄物堵塞河道，施工破壞原有植被與原狀水系統(tǒng)造成的水土流失，直接后果是對(duì)自然環(huán)境改變與破壞，造成生態(tài)失衡(徐廣彬 2011)。 生態(tài)恢復(fù)對(duì)于公路建設(shè)而言有特殊意義，微生物修復(fù)是生態(tài)修復(fù)的一部分，并且同植物修復(fù)互為作用，對(duì)于生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)有重要的貢獻(xiàn)。土壤微生物是土壤生態(tài)環(huán)境的重要生命體，它不僅可以指示土壤的生態(tài)穩(wěn)定性，而且還具有巨大的潛在環(huán)境修復(fù)功能(滕應(yīng), 駱永明 et al. 2007)。目前，關(guān)于微生物生態(tài)修復(fù)的研究大量出現(xiàn)，涉及微生物固碳、對(duì)有機(jī)物、重金屬污染土壤以及煤礦廢棄地的修復(fù)等(李珂 and 張洪勛 2014；李順鵬 and 蔣建東 2004; 李榮林, 李優(yōu)琴 et al. 2005; 崔樹(shù)軍, 谷立坤 et al. 2010; 王鳳花, 羅小三 et al. 2010; 代穩(wěn), 朱清華 et al. 2012; 王麗娜 2013)，正是由于已經(jīng)積累了諸多土壤微生物修復(fù)知識(shí)，開(kāi)展土壤微生物于公路斷面修復(fù)研究與應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。受破壞的公路斷面生態(tài)環(huán)境條件脆弱，土壤貧瘠，植被的覆蓋率低，但是土壤微生物卻普遍存在。土壤微生物能夠通過(guò)自身的生理特性，改善土壤的物理性質(zhì)，起到保護(hù)土壤的作用。土壤表層的藻類(lèi)則能夠通過(guò)光合作用固定空氣中的C02，是土壤表層固碳的重要貢獻(xiàn)者。有了碳源，就可提供其他異養(yǎng)微生物生存的能量來(lái)源，進(jìn)而使土壤肥力增加。此外，固碳量的大小不僅受自然條件的約束，也與藻類(lèi)的組成密切相關(guān)(李珂 and 張洪勛 2014)，因此斷面修復(fù)過(guò)程中微生物的群落結(jié)構(gòu)（微生物的多樣性及豐度）可作為斷面修復(fù)效果的評(píng)估指標(biāo)。從應(yīng)用的角度來(lái)看，篩選抗逆能力強(qiáng)的藻類(lèi)，應(yīng)用于斷面修復(fù)將會(huì)起到事半功倍的作用。如優(yōu)化其固碳條件，使其能夠以更高效率的修復(fù)斷面生態(tài)，顯然具有重要的實(shí)際意義。2、課題目標(biāo)2.1獲得斷面修復(fù)過(guò)程中微生物多樣性及數(shù)量變化的數(shù)據(jù)，建立固碳微生物修復(fù)指標(biāo)，應(yīng)用于評(píng)估斷面恢復(fù)狀況。2.2 分離純化抗逆藻類(lèi)，優(yōu)化固碳條件，為提高斷面修復(fù)效率工藝改進(jìn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。3、研究技術(shù)路線及研究?jī)?nèi)容3.1 斷面修復(fù)過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)查1）微生物多樣性調(diào)查 斷面的土壤樣品采用FastDNA SPIN kit for soil (Bio101 System Germany)提取DNA，提取過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用高通量測(cè)序獲得斷面土壤中細(xì)菌和真菌的序列數(shù)據(jù)，分析優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)及其他微生物。2）微生物豐度調(diào)查 微生物的豐度是土壤中微生物含量的一種表征方式。采用熒光定量PCR，對(duì)斷面中的優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)及其他微生物菌種進(jìn)行定性定量分析。該研究的技術(shù)路線圖如下所示：圖1 研究技術(shù)路線圖3.2獲得高效率斷面恢復(fù)速度1）藻類(lèi)的分離培養(yǎng)在容積為250mL 的三角瓶?jī)?nèi)，加入100mL的液體BG-11培養(yǎng)基，滅菌備用，然后把5 g的土壤樣品加入液體培養(yǎng)基中，充分震蕩，在25，70E m-2s-1條件下培養(yǎng) 2 周后，一部分接種于固體培養(yǎng)基中涂平板，并進(jìn)行劃線法分離純化藻類(lèi)，剩余樣品在顯微鏡下進(jìn)行觀察。2）純種藻類(lèi)的鑒定及藻結(jié)皮固碳條件的優(yōu)化 純種藻類(lèi)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，可看到三角瓶中有藍(lán)綠色的藻類(lèi)生長(zhǎng)，取液體培養(yǎng)液中的藻類(lèi)，制成臨時(shí)裝片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，并根據(jù)(Drouet 1981; Tirkey and Adhikary 2006; 胡鴻鈞 and 魏印心 2006)等相關(guān)參考文獻(xiàn)將其鑒定到屬或種。 純種的優(yōu)勢(shì)藻用BG-11培養(yǎng)基在室溫通氣培養(yǎng)，光照為40E m-2s-1，15天后，將培養(yǎng)物噴霧接種于沒(méi)有斷面土壤表面（沒(méi)有植物覆蓋）。通過(guò)設(shè)置不同光照強(qiáng)度及濕度來(lái)觀察結(jié)皮的生長(zhǎng)狀況(蘭書(shū)斌, 胡春香 et al. 2010)。參考文獻(xiàn)Drouet, F. (1981). Revision of the Stigonemataceae with a summary of the classification of the blue-green algae, J. Cramer Vaduz.Tirkey, J. and S. Adhikary (2006). Blue green algae in the biological soil crusts of different regions of India. Feddes Repertorium 117(34): 280-306.崔樹(shù)軍, 谷立坤, et al. (2010). 煤礦廢棄地的微生物修復(fù)技術(shù). 金屬礦山(04): 176-179+182.代穩(wěn), 朱清華, et al. (2012). 水污染微生物修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展. 水科學(xué)與工程技術(shù)(04): 4-6.胡鴻鈞 and 魏印心 (2006). 中國(guó)淡水藻類(lèi)-系統(tǒng), 分類(lèi)及生態(tài).蘭書(shū)斌, 胡春香, et al. (2010). 人工藻結(jié)皮形成過(guò)程中表土非降雨型水分吸收的變化情況. 中國(guó)科學(xué): 生命科學(xué)(8): 751-757.李珂 and 張洪勛 (2014). 荒漠地區(qū)土壤表層固碳作用研究進(jìn)展. 科技導(dǎo)報(bào)(19): 77-83.李榮林, 李優(yōu)琴, et al. (2005). 重金屬污染的微生物修復(fù)技術(shù). 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)(04): 1-3+25.李順鵬 and 蔣建東 (2004). 農(nóng)藥污染土壤的微生物修復(fù)研究進(jìn)展. 土壤(06): 577-583.滕應(yīng), 駱永明, et al. (2007). 污染土壤的微生物修復(fù)原理與技術(shù)進(jìn)展. 土壤(04): 497-502.王鳳花, 羅小三, et al. (2010). 土壤鉻(VI)污染及微生物修復(fù)研究進(jìn)展. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)(02): 153-161.王麗娜 (2013). 海洋近岸溢油污染微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究 博士, 中國(guó)海洋大學(xué).徐廣彬 (2011). 公路建設(shè)對(duì)生態(tài)影響及植被恢復(fù)評(píng)價(jià)技術(shù)研究 博士, 吉林大學(xué). 7 / 74、預(yù)期成果4.1微生物群落結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)提供藻類(lèi)微生物分子生態(tài)多樣性及生物量的變化規(guī)律，給出修復(fù)前后的對(duì)比數(shù)據(jù)。獲得優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)和抗逆性藻類(lèi)的純化菌株。4.2優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)的顯微鏡照片4.3尋找抗逆藻類(lèi)微生物的種源并探討實(shí)際應(yīng)用 通過(guò)接種抗逆性藻類(lèi)，增加斷面土壤的恢復(fù)效果。 土壤結(jié)皮在土壤中有重要作用，土壤中的絲狀藻類(lèi)大部分具有較厚的細(xì)胞壁，能夠分泌胞外多聚糖（EPS），使藻類(lèi)在干旱時(shí)能夠有效保持體內(nèi)水分，濕潤(rùn)時(shí)能夠快速吸收大量水分促使菌絲的生長(zhǎng)，將其他微生物以及土壤粒子凝結(jié)在一起，促進(jìn)土壤生物結(jié)皮的形成及演替。中科院水生生物所聯(lián)同內(nèi)蒙古林業(yè)科學(xué)院在庫(kù)布齊沙漠邊緣建立了荒漠藻綜合治沙基地和示范區(qū)，取得了一定的成效(饒本強(qiáng), 劉永定 et al. 2009)。5. 已有的研究成果(1) Li Ke, Liu Ruyin, Zhang Hongxun, et al. The diversity and abundance of bacteria and oxygenic phototrophs in saline biological desert crusts in Xinjiang, Northwest ChinaJ. Microbial ecology, 2013, 66(1): 40-48. (2) 李珂, 張洪勛. 荒漠地區(qū)土壤表層固碳作用及其分析方法的研究進(jìn)展J. 科技導(dǎo)報(bào), 2014, 19: 77-83.(3)Liu Ruyin, Li Ke, Zhang Hongxun, et al. Spatial distribution of microbial communities associated with dune landform in the Gurbantunggut Desert, ChinaJ.Journal of Microbiology 6.經(jīng)費(fèi)預(yù)算（萬(wàn)）總經(jīng)費(fèi)26.0經(jīng)費(fèi)支出預(yù)算科 目預(yù)算經(jīng)費(fèi)計(jì)算依據(jù)與說(shuō)明研究經(jīng)費(fèi)26一、人員費(fèi)6.0研究生勞