實(shí)驗(yàn)四氨基酸紙層析折光率的測定.ppt

實(shí)驗(yàn)四 氨基酸紙層析、 折光率的測定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、本實(shí)驗(yàn)采用紙色譜對(duì)幾種氨基酸進(jìn)行分離和鑒定,以了解紙色譜的原理，練習(xí)其操作方法。 2 、了解測定折光率的簡單原理，掌握阿貝折射儀的使用方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理,1、色譜分析法（簡稱色譜法或?qū)游龇ǎ?色譜分析法簡稱色譜法或?qū)游龇ā?906年，俄國植物學(xué)家Tsweet將CaCO3放在豎立的玻璃柱中，從頂端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚沖洗。在柱的不同部位形成色帶，因而命名為色譜。管內(nèi)填充物稱為固定相，沖洗劑稱為流動(dòng)相。 色譜法就是利用混合物中各組分在固定相和移動(dòng)相中進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配作用，達(dá)到各組分分開的目的。,分類: (1)按照被分離物質(zhì)在固定相中的作用原理不同，色譜法可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜等。 (2)按照操作方式不同，又可分為柱色譜、薄層色譜、紙色譜、氣相色譜、和高效液相色譜等。,紙色譜為分配色譜，色譜過程在固定相構(gòu)成的平面狀層下進(jìn)行。濾紙為載體，固定相為濾紙上的水，流動(dòng)相（展開劑）為用水飽和過的有機(jī)溶劑。紙色譜屬于分配色譜。 衡量物質(zhì)向上移動(dòng)的物理量是比移值（Rf）,例:大黃中游離蒽醌的紙色譜圖,溶劑前沿 大黃素甲醚 蘆薈大黃素 大黃素 大黃酸 點(diǎn)樣點(diǎn),、化合物的折光率,折光率象沸點(diǎn)一樣，是液體有機(jī)物最重要的物理常數(shù)之一。衡量液體有機(jī)物純度的標(biāo)準(zhǔn)，折光率比沸點(diǎn)更可靠。利用折光率不僅可鑒定未知物，且可確定沸點(diǎn)和結(jié)構(gòu)相似的液體混合物的組成。,液體的折光率不但與結(jié)構(gòu)和入射光的波長有關(guān)，而且也受溫度、壓力等因素的影響。由于大氣的變化對(duì)折光率的測定影響并不顯著，所以，通常表示折光率時(shí)只標(biāo)明入射光線的波長和測定時(shí)的溫度。例如，在入射光為鈉的黃光(波長為589.3nm)，測定溫度為20時(shí)，水的折光率為1.3330，表示為 = 13330。這里n代表折光率，20代表測定時(shí)的溫度，D代表鈉光。,折光率可以通過折光儀精確地測定出來，常用的是阿貝(Abble)折射儀。,阿貝折射儀基本原理 在一定的外界(如溫度、壓力等)條件下，波長一定的單色光從介質(zhì)A斜射入介質(zhì)B時(shí)，要發(fā)生折射現(xiàn)象。其入射角與折射的正弦之比是一個(gè)常數(shù)，并且與這兩個(gè)介質(zhì)的折射率nA(介質(zhì)A)、nB(介質(zhì)B)成反比。即：,根據(jù)折射定律可得：,當(dāng),則,所以,(折射角的最大值，稱為臨界角 ),時(shí)sin0=1,在臨界角以內(nèi)的區(qū)域都有光線通過,是明亮的，在臨界角以外的區(qū)域沒有光線通過，是暗的。在臨界角上正好是“半明半暗”（如圖4-2所示）。目鏡上有一個(gè)十字交叉線，若十字交叉線與明暗分界線重合，就表示光線由被測液體進(jìn)入棱鏡時(shí)的入射角正好為90。,由于 ,棱鏡的折光率nB是常數(shù)，各種液體的折光率不同，臨界角也不同。通過測定臨界角的相對(duì)位置，經(jīng)過換算就可以找出液體的折光率，阿貝折光儀的刻度是經(jīng)過換算后的折光率的讀數(shù)，故可直接讀出折光率。,阿貝(Abbe)折光儀,阿貝(Abbe)折光儀,阿貝（Abbe）折光儀的結(jié)構(gòu)如圖。它的主要組成部分是兩塊直角棱鏡組成的棱鏡組，上面一塊是表面光滑的測量棱鏡，下面一塊是表面磨砂的可以開啟的輔助棱鏡。左面的鏡筒是讀數(shù)鏡筒，內(nèi)有刻度盤，其上面有兩行數(shù)值。右邊一行是折射率數(shù)值（1.30001.7000），左邊一行是工業(yè)上測量溶液濃度的標(biāo)度（095%）。右面的鏡筒是測量目鏡，用來觀察折光情況。筒內(nèi)裝有消色散棱鏡。光線由反射鏡射入輔助棱鏡，發(fā)生漫射，以不同人射角射入液層，然后再射到測量棱鏡的表面上。此時(shí)一部分光線經(jīng)折射后進(jìn)入測量目鏡，另一部分光線則發(fā)生全反射。調(diào)節(jié)螺旋，以使測量目鏡中的視野 半明半暗。,三、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）紙層析,1在濾紙條上端邊緣約1厘米的中央剪一小孔。 2將濾紙條平放于潔凈的紙上，在距離濾紙下端1cm處用鉛筆輕畫一橫線，并在橫線的中央畫一直徑為2mm的小圓圈。 3用毛細(xì)管吸取氨基酸混合液，在濾紙條下端的小圓圈內(nèi)點(diǎn)樣。,4. 取干燥大試管，加入被水飽和的酚溶液10ml，注意勿使溶液沾到試管壁上，將試管垂直固定于鐵架臺(tái)上。 5. 在距濾紙條下端0.5cm處穿大頭針。從濾紙條上端小孔處穿棉線并左右分開，調(diào)節(jié)線的高度使濾紙垂直懸于試管內(nèi)且下湍浸入溶液0.5cm，注意勿使點(diǎn)樣點(diǎn)浸入溶液中，亦勿使濾紙條接觸試管壁。 6. 此時(shí)即可看到溶劑向上移動(dòng)，溶劑升到一定高度時(shí)，小心將紙條取出，以鉛筆標(biāo)出溶劑上升的前沿。,7. 將濾紙條兩端，用大頭針釘在小木框上，吹干后用噴霧器均勻地噴一層0.2%茚三酮乙醇溶液，然后再將濾紙條吹干，即可看到紙上顯出三色點(diǎn)，每個(gè)色點(diǎn)代表一種氨基酸。 8. 分別測量并計(jì)算三種氨基酸的Rf，再根據(jù)教師供給的值確定此三個(gè)色點(diǎn)各為何種氨基酸。 9. 留在試管內(nèi)的酚溶劑切勿棄去，塞緊塞子。,（二）折光率的測定 1、折光儀讀數(shù)的校正 （1）將阿貝折光儀置于普通白熾燈前或靠近窗戶的桌子上。但不要放在直射的陽光下，以免液體試樣迅速蒸發(fā)。將溫度計(jì)插人金屬匣中，然后接道恒溫水，恒溫20min左右。恒溫溫度可以從溫度計(jì)中讀出。 （2）旋開棱鏡鎖緊扳手，開啟鋪助棱鏡，用按鏡紙蘸少量乙酸（或丙酮）輕輕揩拭鏡面。待鏡面干燥后，滴加12滴蒸餾水于輔助棱鏡面上，旋緊棱鏡鎖緊扳手，使蒸餾水均勻地充滿視場，注意不要有氣泡。,（3）調(diào)節(jié)反光鏡，使從測量目鏡中觀察到的視場最亮。調(diào)節(jié)目鏡，使聚焦于“十”字的支點(diǎn)上。調(diào)整消色散棱鏡手輪，使視場中呈現(xiàn)黑白分界線。轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使黑白分界線恰與“十”字的交點(diǎn)重合。 （4）記下蒸餾水的折光率，重復(fù)操作23次，與標(biāo)準(zhǔn)值比較，得到零點(diǎn)的校正值。,2、加樣,打開棱鏡，用擦鏡紙(必要時(shí)用絲絹沾少量乙醇或丙酮)輕輕擦洗上下鏡面，要單向擦，不要來回擦。待溶劑揮發(fā)后，滴12滴待測液體于磨砂棱鏡面上,小心地關(guān)閉棱鏡，使液體鋪滿整個(gè)鏡面 。,3、對(duì)光,調(diào)節(jié)反光鏡使入射光達(dá)到最強(qiáng)，目鏡內(nèi)視場明亮，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡調(diào)節(jié)旋鈕，直到在望遠(yuǎn)鏡內(nèi)觀察到明暗分界線或彩色光帶。,4、消色,轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡微調(diào)旋紐（消色散）至看到一個(gè)黑白明晰的分界線,如圖所示.,轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡調(diào)節(jié)旋鈕使分界線對(duì)準(zhǔn)十字交叉線的中心。,5、精調(diào),6、 讀數(shù),從鏡筒讀出折光率（位于下面的刻度）并記下測定時(shí)的溫度,重復(fù)23次,7、清洗,測好樣品后，用擦鏡紙輕輕擦去上下鏡面上的液體，再用乙醇或丙酮潤濕的擦鏡紙單向擦上下鏡面，待棱鏡干后，旋緊鎖鈕.,1 層析缸要預(yù)先飽和，展開劑勿附著于大試管內(nèi)壁。 2點(diǎn)樣量要適當(dāng)，太少效果不明顯，太多分離不好。 要求點(diǎn)的樣直徑不超過.。 無論在準(zhǔn)備工作中還是以后的實(shí)驗(yàn)過程中，都不要用手觸摸紙條中部，因?yàn)槭稚喜桓蓛粑锘蚱ば悸湓诩埳蠒?huì)產(chǎn)生多余斑點(diǎn)而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4樣品點(diǎn)不能浸入展開劑中。,注意：,5Abbe折光儀使用前,必須用重蒸餾水( =1.3330)或標(biāo)準(zhǔn)折光玻璃塊校正.每次測定前、后都必需用12滴丙酮或乙醇滴于棱鏡面上，合上棱鏡，使上下鏡面全部被丙酮潤濕再打開棱鏡，然后用擦鏡紙擦干丙酮。 6嚴(yán)禁腐蝕性液體、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氟化物等的使用。 7阿貝折射儀的關(guān)鍵部位是棱鏡，必須注意保護(hù)。滴加液體時(shí)，滴管的末端切不可觸及棱鏡，擦洗棱鏡時(shí)要單向擦，不要來回擦，