《分子生物學(xué)技術(shù)》PPT課件.ppt

第六章 分子生物學(xué) 基本操作技術(shù),第一節(jié) 核酸的提取 第二節(jié) 核酸雜交技術(shù) 第三節(jié) PCR技術(shù),第一節(jié) 核酸的提取,一、提取核酸的基本步驟,（一）總則 保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類 分子的污染應(yīng)降低到最低程度； 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 應(yīng)盡量去除非目標(biāo)核酸分子。,（二）措施 溫度不要過高； 控制pH值范圍(pH值5-9)； 保持一定離子強度； 減少物理因素對核酸的機械剪切力； 所用器械和一些試劑需高溫滅菌； 提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。 細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。,（三）核酸分子抽提的技術(shù)設(shè)計,1、核酸的釋放-破裂細胞，釋放核酸。 高速組織搗碎機搗碎 玻璃勻漿器勻漿 超聲波處理法 液氮研磨法 化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等） 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）,2、核酸的分離與純化 將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離 非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非目的核酸分子、試劑 3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌 沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子 加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等） 少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌,4、核酸的鑒定 濃度鑒定 濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液-紫外分光光度法。 DNARNA濃度(g/ml)=OD260稀釋倍數(shù)5040 低濃度核酸溶液-溴化乙錠熒光光度法。 純度鑒定 DNA:OD260/OD280=1.8；OD260/OD2302.0。 RNA:OD260/OD280=1.7-2.0；OD260/OD2302.0。 完整性鑒定-凝膠電泳法,5、核酸的儲存 DNA： 溶于pH8.0的TE（tris和EDTA）緩沖液中，4 或-20 保存； 長期保存樣品中可加入1滴氯仿。 RNA： 溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 保存; 溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，-20 保存?；蚣?滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70。,二、基因組DNA的分離與純化,（一）樣品準(zhǔn)備,常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織、培養(yǎng)細胞、細菌等。 生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存70或液氮中。,（二）DNA提取,1、酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎細胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進行沉淀。獲DNA大小為100150kb。,主要試劑及其作用： EDTA： 二價金屬螯合劑，抑制核酸酶； 降低細胞膜的穩(wěn)定性。 SDS： 溶解膜蛋白和脂肪，使細胞膜破裂； 溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸 釋放出來； 對RNA、DNA酶有抑制作用； 與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。,蛋白酶K： 消化DNA酶和細胞中的蛋白質(zhì)。可與SDS、EDTA同時使用，仍保持較高活性。 酚： 使蛋白質(zhì)變性沉淀，抑制DNA酶活性。 pH8.0的Tris溶液： 使抽提出的DNA進入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。 酚或酚-氯仿中少許的異戊醇： 減少氣泡的產(chǎn)生，利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。,2 甲酰胺解聚法： 破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟。 適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品-可得200kb左右的DNA。,3 玻璃棒纏繞法： 用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。,4 異丙醇沉淀法： 基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）。,5 表面活性劑快速制備法： 用Triton X-100或NP-40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。,（三）DNA樣品的純化 方法：透析、層析、電泳及選擇性沉淀。 瓊脂糖電泳適用于0.1-60Kb片段，聚丙烯酰胺（PAGE）電泳適用于5-500bp大小的片段。,（四）DNA的濃縮,1、固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量。 2、丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積。,（六）DNA回收,主要是從電泳中分離回收DNA片段。 回收原則：盡量提高回收率，去除回收DNA樣品中的污染物。 電泳到DEAE-纖維素膜：500bp-5kb的DNA片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過10kb和單鏈DNA。 透析袋電洗脫： 低熔點瓊脂糖凝膠：有機溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。,核酸分子雜交 （nucleic acid hybridization） 指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。 不同來源的DNA或RNA單鏈在一定條件下重新組成的新的雙鏈分子雜交分子。,第二節(jié) 核酸雜交技術(shù),一、核酸分子雜交的基本原理,1、DNA的變性(denaturation)： 在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被拆開，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子的過程。 常用的變性方法： 熱變性；酸堿變性；化學(xué)試劑變性,2、DNA的復(fù)性（renaturation)： 在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補鏈可再恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。 熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱為退火(annealing)。,3、解鏈溫度（融解溫度，Tm） (melting temperature)：,使50%的DNA發(fā)生變性時的環(huán)境溫度。,增色效應(yīng)： DNA變性后對260nm紫外光收增加的現(xiàn)象。,減色效應(yīng)： 變性DNA復(fù)性后對260nm紫外光吸收減少的現(xiàn)象。,單鏈核酸的起始濃度：濃度越高，復(fù)性越快。 核酸鏈長度：越長，形成配對的難度越大，復(fù)性也慢。 核酸分子的復(fù)雜性：復(fù)雜性越高，形成正確配對的難度也越大，復(fù)性越慢。,影響復(fù)性的因素,溫度：溫度過低則分子運動減慢，少數(shù)堿基形成的局部雙鏈也不易解離。適宜的復(fù)性溫度是比Tm低25。 離子強度：適當(dāng)?shù)碾x子強度可中和核酸分子上磷酸基團所帶的負(fù)電，減少雙鏈間的靜電斥力，有利于復(fù)性。但離子強度過高也不利于復(fù)性。,Tm值與核酸含量的關(guān)系 20bp Tm = 69.3+0.41(GC)%,4、雜交,來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補形成異源雙螺旋分子，稱為核酸分子雜交。 雜交可分成：DNA與DNA、RNA與RNA、DNA與RNA之間的雜交。 核酸分子雜交技術(shù)：使已知序列的DNA或RNA片段上帶上可檢測的標(biāo)記，可用來檢測樣品中未知的核酸序列。,探針濃度、長度、復(fù)雜性：探針濃度越高，復(fù)性速度越快。但雙鏈探針濃度過高會增加自我復(fù)性而影響雜交；濃度過高也會增加非特異結(jié)合，使雜交背景增強。探針越長擴散速度越慢；復(fù)雜性越高，配對難度也增大。 離子強度：高離子強度溶液中，有利于雜交分子形成。,影響核酸分子雜交的因素,溫度：通常在低于Tm 20-25的溫度下進行雜交。 添加劑：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸可吸附DNA探針，使DNA接觸面增大，而加速雜交反應(yīng)。 雜交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸雜交的Tm。含30%50%甲酰胺的雜交溫度能降低到3042。較低的雜交溫度，使探針更穩(wěn)定，并能更好地保留非共價結(jié)合的核酸。,4、預(yù)雜交,為了減少探針與廣泛存在的非互補核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前可用封閉物將這些非特異位點封閉。在雜交前的這些處理過程稱為預(yù)雜交。,常用于預(yù)雜交的封閉物,變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個背景覆蓋一層。由于它們與探針無同源性，在雜交反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點的能力。一般常用Denhardt溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。,二、核酸探針,指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段。一般而言，核酸探針帶有特殊的標(biāo)記物。 核酸探針的類型： 寡核苷酸探針、基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、單鏈DNA探針。 常用的探針標(biāo)記物： 放射性同位素（3H、32P、35S、125I）；非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等）。,三、核酸分子雜交信號的檢測,放射性同位素標(biāo)記探針： 放射自顯影。 非放射性同位素標(biāo)記探針： 偶聯(lián)反應(yīng)+顯色反應(yīng)。,四、核酸分子雜交技術(shù),固相雜交：結(jié)合于某種固相支持物上的待測樣品與溶解于雜交液中的探針進行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。 液相雜交：待測樣品和探針均溶于液體中進行雜交反應(yīng)。,（一）膜上印跡雜交,將待測核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進行雜交的過程稱為膜上印跡雜交。 印記的方法： 虹吸印跡法；真空轉(zhuǎn)移法；電轉(zhuǎn)移法,DNA或RNA 電泳分離核酸片段 轉(zhuǎn)移至固相支持物（印跡技術(shù)） 雜交 洗去未雜交探針 雜交信號檢測,Northern 雜交 原理：RNA經(jīng)過變性瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜上，經(jīng)過雜交，分析mRNA的大小及含量。 應(yīng)用：半定量分析mRNA的含量；確定mRNA分子的大小。 方法：提取組織細胞總RNARNA定量變性膠電泳轉(zhuǎn)膜干膜預(yù)雜交雜交洗膜壓片洗片圖像分析,Western印跡雜交,將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。,斑點印跡雜交和狹線印跡雜交,適于核酸樣品定量檢測。,（二）原位雜交,用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，使其與細胞組織或切片中核酸進行雜交檢測的方法稱為原位雜交。 原位雜交的類型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA雜交。,取材 組織、細胞固定 預(yù)雜交 雜交 放射自顯影或免疫酶法顯色 觀察結(jié)果,（三）液相雜交,RNA酶保護分析法 核酸酶S1保護分析法,待測RNA樣品 液相雜交 DNA-RNA雜交雙鏈 酶解 雜交體系純化 脲-聚丙烯酰胺凝膠電泳 放射自顯影,單鏈DNA探針（M13體系合成）,待測RNA樣品 液相雜交 RNA-RNA雜交雙鏈 酶解 雜交體系純化 脲-聚丙烯酰胺凝膠電泳 放射自顯影, 單鏈RNA探針,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定克隆或基因組DNA序列進行的體外擴增反應(yīng)。,第三節(jié) PCR技術(shù),PCR反應(yīng)的特點,特異性強：引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性。 靈敏度高：指數(shù)增長，從pg (10-12)可擴增至 mg (10-6)水平 簡便、快速：2-4 小時完成擴增。 對標(biāo)本的純度要求低：DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。,一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程,DNA的體外復(fù)制包括3個步驟： 變性（denaturation）:94 C 95 C 退火（annealing）:40 C 70 C 延伸（extension）:72 C 3個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當(dāng)完成一個循環(huán)，一個分子的模板被復(fù)制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。,二、PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,（一）PCR反應(yīng)體系 參與PCR反應(yīng)的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 緩沖液等。,1、模板（template）,包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等。 模板DNA需較高的濃度 RNA作為模板時，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA作為擴增的模板。 模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng,2、引物（Primers),引物是化學(xué)合成的寡核苷酸片段，它決定了PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度。 化學(xué)合成的寡核苷酸 能與模板特異地結(jié)合 引物決定產(chǎn)物的特異性和長度 引物設(shè)計時必須遵循一些原則,設(shè)計引物的原則,二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補。 長度為18 - 25個核苷酸。 二條引物之間避免形成引物二聚體。 引物的堿基組成應(yīng)平衡。 引物的5端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標(biāo)記）,引物濃度：0.1 0.2 umol/L,濃度過高容易生成引物二聚體。,3、脫氧核苷三磷酸（dNTP）,是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸的混合物 反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致。 濃度過高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異 性擴增也隨之增加 。,dNTP濃度：20 200 umol/L,濃度升高增加非特異性擴增。,4、DNA聚合酶,從一種生活在熱泉（8090）中的水棲噬熱菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的熱穩(wěn)定性。 Taq 酶的作用: 在模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，于引物3-OH末端處加上脫氧單核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿53方向延伸，催化DNA合成。,最適酶量：1-2.5U 。酶量過多，導(dǎo)致非特異性擴增。,5、鎂離子濃度,鎂離子濃度對于Taq 酶的活性有直接影響。 PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及鰲合劑的均可與Mg2+結(jié)合，降低游離Mg2+的濃度，從而影響酶的活性。,當(dāng)dNTP濃度為200umol/L，MgCl2的濃度為1.5mmol/L時較適宜。,（二）PCR的反應(yīng)條件,反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸） 反應(yīng)時間（變性、退火、延伸） 循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）,1、溫度,變性溫度：94 97 退火溫度：低于引物Tm 5 左右 溫度過高-降低擴增效率； 溫度過低-增加非特異性擴增 延伸溫度：72，此時Taq酶具有較高的酶促活性,2、時間,第一次變性應(yīng)給予足夠時間（5 7分鐘） 每個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為30秒 1分鐘，時間過長易導(dǎo)致非特異性擴增。,3、循環(huán)次數(shù),重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為2535個循環(huán) 擴增反應(yīng)的平臺效應(yīng)： 理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增長形式在擴增25-25個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到反應(yīng)平臺，此時擴增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長。,三、PCR中試劑與樣本的保存,1、裂解液 4貯存，避免反復(fù)凍融，否則影響裂解效果，造成假陰性。 2、反應(yīng)液 -20貯存。試劑開封后，4保存在12周內(nèi)用完。反應(yīng)液反復(fù)凍融5次影響不大，但過多的凍融會降低擴增效率。,（一）試劑貯存,3、Taq酶 -20貯存（存于有霜冰箱）。 4、陽性模板 -20貯存，可反復(fù)凍融5次左右。陽性模板4也可貯存2周左右。,1、尿道、陰道、宮頸分泌物 棉拭子經(jīng)生理鹽水洗滌后，2000r/min后取上清500ul。過多的沉淀物裂解后，會導(dǎo)致PCR抑制而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，或出現(xiàn)電泳背景模糊和拖尾現(xiàn)象。尤其是膿性分泌物，沉淀物過多，易造成假陰性。,（二）標(biāo)本處理,2、尿液 男性尿道炎患者，若無分泌物，可用初段尿。尿液置冷凍保存，但解凍后需37保溫，以使尿鹽充分溶解，過多的鹽沉積物