《其他重要工具酶》PPT課件.ppt

第二節(jié) 其它重要的工具酶,DNA 聚合酶（DNA polymerase）,DNA 聚合酶是催化以 DNA 或 RNA 為模板合成 DNA 的一類酶的總稱。 經(jīng)常使用的 DNA 聚合酶有大腸桿菌 DNA 聚合酶 I(全酶)、Klenow 酶、T4 DNA 聚合酶、T7 DNA 聚合酶、耐高溫的 Taq DNA 聚合酶以及反轉(zhuǎn)錄酶等。 這些 DNA 聚合酶的共同特點(diǎn)是：它們都能夠把脫氧核糖核苷酸(dNTP，包括 dATP、 dTTP、 dCTP 和 dGTP)連續(xù)的加到雙鏈 DNA 引物鏈的 3-羥基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的 DNA 鏈。,DNA 聚合酶 I,DNA 聚合酶 I 具有三種活性，即 53聚合活性、53外切活性和 35外切活性。 DNA 聚合酶 I 要發(fā)揮作用需滿足以下三個(gè)條件。 底物和激活劑：DNA 聚合酶 I 催化聚合反應(yīng)需要四種 dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)作為底物，同時(shí)Mg2是不可缺少的激活劑。 帶有 3-端羥基末端的引物：DNA 聚合酶 I 所催化的聚合反應(yīng)總是在引物的 3-OH末端基團(tuán)和攙入的 dNTP 之間發(fā)生的，且只能沿引物末端由 53方向延伸。 DNA 模板：可以是 ssDNA 或 dsDNA，后者只有在其主鏈上有一至數(shù)個(gè)斷裂的情況下才能成為有效的模板。,實(shí)驗(yàn)室中，利用 DNA 聚合酶 I，通過(guò) DNA 缺口平移的方法制備 DNA 探針，可以用于核酸雜交分析。 雙鏈 DNA 的單鏈缺口在 DNA 聚合酶 I 的 53外切作用下，從缺口的5端逐步水解核苷酸時(shí)，酶的聚合活性則利用缺口的 3端游離羥基逐個(gè)加上相應(yīng)的單核苷酸，使得缺口向下游移動(dòng)，這種缺口移動(dòng)的現(xiàn)象就稱為缺口平移。 如果反應(yīng)中使用的是用同位素標(biāo)記過(guò)的單核苷酸底物，則合成產(chǎn)生的 DNA 分子即可作為帶放射性標(biāo)記的 DNA分子雜交探針。,DNA 聚合酶 I,DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段),是 E. coli DNA 聚合酶 I 的蛋白水解產(chǎn)物，特點(diǎn)是： 具有 DNA 聚合酶活性和 35核酸外切酶活性，但缺失了 53 核酸外切酶活性。 Klenow 既保留了全酶的高保真性，又不會(huì)降解 DNA 5末端。 用途：在基因工程中主要用于切口平移法標(biāo)記 DNA，同時(shí)也可用于 DNA 的缺口補(bǔ)平和延伸。,用途： 用隨機(jī)引物制備探針 補(bǔ)平5突出端，形成平末端 切除3突出端，形成平末端 合成cDNA第二條鏈 誘變反應(yīng)中第二條鏈的合成 雙脫氧法DNA序列測(cè)定 (Sanger 法),DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段),DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段),T4 DNA 聚合酶,在模板及引物存在的條件下，T4 DNA 聚合酶催化沿 53 方向合成 DNA。此酶還具有 35 外切核酸酶的活性，該活性比 DNA 聚合酶 I 強(qiáng)。與 E. coli DNA 聚合酶 I 不同，T4 DNA 聚合酶不具有 53 外切核酸酶活性。,T4 DNA 聚合酶, 缺口填充 (無(wú)鏈置換活性) 產(chǎn)生平末端的最佳用酶 補(bǔ)平 5 突出端，形成平末端 切除 3 突出末端，形成平末端 通過(guò)置換合成法標(biāo)記探針 單鏈刪除后亞克隆 基因定點(diǎn)突變中第二條鏈的合成,DNA片段的末端平滑化示例,T7 DNA 聚合酶,T7 DNA 聚合酶是從受 T7 噬菌體感染的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來(lái)的一種復(fù)合形式的核酸酶。 它由兩種亞基組成：一種是 T7 噬菌體基因 5 編碼的蛋白質(zhì)，其分子量為84 kD；另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白(thioredoxin)，其分子量為 12 kD。,T7 DNA聚合酶是目前已知的持續(xù)合成能力最強(qiáng)的 DNA 聚合酶，能連續(xù)合成數(shù)千個(gè)核苷酸。 除聚合活性以外，T7 DNA 聚合酶還具有單鏈和雙鏈的 35外切酶活性，它的活性也很強(qiáng)，約為 Klenow 酶的 1000 倍。 T7 DNA 聚合酶不具有 53外切酶活性。由于 T7 DNA 聚合酶的高度續(xù)進(jìn)性和不受 DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，在分子生物學(xué)中常被用于長(zhǎng)模板 DNA 的引物延伸反應(yīng)。同時(shí)，經(jīng)修飾的 T7 DNA 聚合酶還是雙脫氧終止法對(duì)長(zhǎng)片段 DNA 進(jìn)行測(cè)序的理想工具酶。,T7 DNA 聚合酶,堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase）,堿性磷酸酶是一類能特異性地切去DNA或RNA的5-磷酸基團(tuán)的工具酶，它們的作用底物可以是ssDNA或dsDNA或RNA，也可以是NTP或dNTP。 用途 1）去除DNA片段的5-末端的磷酸基。防止線狀DNA的自身環(huán)化（Self-Ligation）。 2）除去PCR反應(yīng)后殘存的dNTP。PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，在反應(yīng)體系中如果有多余的Primer和dNTP，將影響測(cè)序反應(yīng)的正常進(jìn)行。使用Exonuclease I分解殘存的Primer；用SAP處理可降解多余的dNTP，之后不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行精制，立即可以進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。,從細(xì)菌中分離的堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, E.coli C75; BAP) 從小牛腸中分離的堿性磷酸酶 (Alkaline phosphase, calf intestinal, CAP)。 從蝦提取的蝦堿性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP ）,堿性磷酸酶,堿性磷酸酶,T4 多聚核苷酸激酶 （T4 polynucleotide kinase，PNK）,DNA 或 RNA 5 末端的磷酸化，以便進(jìn)行連接反應(yīng)。 DNA 或 RNA 的末端標(biāo)記，用作探針和進(jìn)行 DNA 測(cè)序。,雙鏈DNA片段的磷酸化,在微量離心管中配置溶液如下：37反應(yīng)3min,70反應(yīng)510分鐘使酶失活。進(jìn)一步用酒精沉淀的方法精制DNA。,T4 polynucleotide kinase 2 l ATP(10mM) 5 l 10 reaction buffer 5 l 雙鏈DNA片段 10 pmol 超純水 補(bǔ)足 50 l,DNA 酶 I （DNase）,DNA 酶 I（DNase I）是隨機(jī)水解雙鏈或單鏈 DNA的一種內(nèi)切酶，使 DNA 分子降解成帶有 5磷酸末端的單核苷酸和寡核苷酸的混合物。 進(jìn)行重組 DNA 研究時(shí)，必須注意防止 DNA 酶的污染，否則制備的 DNA 樣品將會(huì)降解。 因此使用的器皿或試劑要高溫處理，樣品中需加 EDTA，或放置冰上以破壞或抑制酶活性。,用 途 1）與DNA Polymerase I 一起用于切口平移（Nick translation）。 2）在Mn2+存在的條件下，為鳥(niǎo)槍法測(cè)序（Shot gun sequencing）制作DNA文庫(kù)。 3）用于足跡法（Foot printing）分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用。 4) DNase I 可以作用于單鏈 DNA、雙鏈 DNA、染色質(zhì)和RNA:DNA雜交鏈。,RNA酶A（Ribonuclease A）,Ribonuclease A是一種內(nèi)切核糖核酸酶，可在C和U殘基位置特異性降解單鏈RNA。該酶可以切割核苷上5-核糖與鄰近嘧啶核苷3-核糖上磷酸基團(tuán)之間的磷酸二脂鍵。產(chǎn)生的2，3-環(huán)磷酸可以水解成相應(yīng)的3-核苷磷酸鹽。,產(chǎn)品用途： 質(zhì)粒和基因組DNA制備時(shí)用于去除RNA； 重組蛋白質(zhì)制備過(guò)程中，除去溶液中的RNA。,質(zhì)粒提取后用RNA酶處理,其它的RNA酶,RNA 酶T1只作用于鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的3磷酸根，切開(kāi)與其相鄰核苷酸連接的 5磷酸鍵； RNase H 可以降解 DNA-RNA雜交鏈中的 RNA分子。,防護(hù)RNA酶的污染,人體的分泌物如唾液、汗液中都含有 RNA 酶。 因此在操作 RNA 樣品時(shí)，必須戴手套，實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿都要經(jīng) 250 烘烤 4h(RNA 酶耐熱)，或用 RNA 酶的抑制劑處理。,末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶，分子量為 60 kD，來(lái)源于前淋巴細(xì)胞和分化早期的類淋巴樣細(xì)胞。在二價(jià)陽(yáng)離子的存在下，該酶能夠逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性 DNA 分子的3-OH末端。末端轉(zhuǎn)移酶在反應(yīng)過(guò)程中不需要模板的存在。 對(duì)不同的dNTP所需要的二價(jià)陽(yáng)離子不同，若加入的核苷酸是嘧啶核苷酸，則Co2+為首選陽(yáng)離子；如果加入的核苷酸是嘌呤核苷酸，則Mg2+為首選陽(yáng)離子。 當(dāng)反應(yīng)體系中只有一種dNTP時(shí)，就可以在DNA分子的3末端加上同聚物尾巴(homopolymeric tail)。,末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途,分別給外源 DNA 片段和載體分子加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們可以連接起來(lái)。 例如：可以給用做克隆載體的線性 DNA 分子的 3-OH 末端加上poly(dT)尾巴，給待克隆的外源 DNA 片段的 3-OH 末端加上poly(dA)尾巴。然后將外源 DNA 連接于載體中，形成重組 DNA 分子。,末端轉(zhuǎn)移酶的主要用途,D N A 連接酶,作用機(jī)制及特點(diǎn)DNA 連接酶(DNA ligase)能利用 NAD+或 ATP 中的能量，催化多段 DNA 的 3羥基和5磷酸末端之間形成 3，5-磷酸二酯鍵，把兩個(gè) DNA 片段連接在一起，封閉 DNA 雙鏈上形成的切口(見(jiàn)圖 3-3)。連接酶和限制酶一樣是基因工程中不可缺少的重要工具。 應(yīng)當(dāng)注意，DNA 連接酶只能連接雙鏈 DNA 分子的單鏈切口(nick)，既不能催化兩條單鏈 DNA 分子的連接(T4 DNA 連接酶例外)，也不能催化雙鏈中一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失所造成的缺口(gap)。,DNA 連接酶的分類,常用的 DNA 連接酶有 T4 DNA 連接酶和大腸桿菌 DNA 連接酶兩種。 在這兩種連接酶中，最常使用的是 T4 DNA 連接酶，它的連接效率高，既可用于黏性末端的連接，也可用于平齊末端的連接。一般來(lái)說(shuō)，片段越小，末端黏性越強(qiáng)，連接反應(yīng)則可使用較高的溫度。DNA 平齊末端的連接比黏性末端連接效率低得多。平齊末端的連接一般需要在 1020 進(jìn)行，且需要較高的 DNA 濃度和 T4 DNA 連接酶的濃度。而黏性末端的連接一般在 1626 進(jìn)行。,大腸桿菌 DNA 連接酶催化的連接反應(yīng)中所需要的能量由 NAD+提供， T4 DNA連接酶催化的反應(yīng)中所需要的能量由 ATP 提供。其他方面大腸桿菌 DNA 連接酶和 T4 DNA 連接酶的作用機(jī)制相同。,各種連接酶特性的比較,反轉(zhuǎn)錄酶,商品化的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，一種來(lái)自禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)，另一種來(lái)自大腸桿菌中表達(dá)的 Moloney 鼠白血病病毒(Mo-MLV)。 它們均具有： 依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶活性； RNase H 活性(即持續(xù)地、特異地降解 DNA-RNA 雜交鏈中的 RNA 鏈的活性)； 依賴于 DNA 的 DNA 聚合酶活性。 AMV 及 Mo-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶在許多方面有差別，如 RNase H 活性強(qiáng)弱，最適反應(yīng)溫度及 pH 等。,反轉(zhuǎn)錄酶的主要作用是將 mRNA 轉(zhuǎn)錄成雙鏈 cDNA，并可用反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 進(jìn)行序列分析，再推導(dǎo)出 RNA 序列。,反轉(zhuǎn)錄酶,Taq DNA 聚合酶,Taq DNA 聚合酶是一種熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶，因從生存在熱泉水中的耐熱的水生嗜熱菌(Thermus aquaticus)體內(nèi)分離得到而命名。 Taq DNA 聚合酶最適反應(yīng)溫度是 72 ，但能夠耐受 96