實驗九動物細胞培養(yǎng).ppt

實驗九 動物細胞培養(yǎng),一、實驗目的,掌握無菌操作； 掌握原代和傳代細胞培養(yǎng)； 了解培養(yǎng)成纖維細胞的形態(tài)。,原代培養(yǎng) ：培養(yǎng)直接來自動物機體的細胞群，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉移到另外一個培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)。 細胞株：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群。 細胞系：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉化的細胞，可無限繁殖。,二、實驗原理,三、實驗器材與試劑,1. 器具 顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、天平、CO2培養(yǎng)箱、蒸汽滅菌器、超凈工作臺、解剖刀、 眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿 、錐形瓶、容量瓶、紗布、培養(yǎng)瓶、移液槍。 2. 材料 9 - 12 日齡發(fā)育良好的鴨胚。,3. 主要試劑 雙蒸水、Hanks液、0.25%胰蛋白酶、EDTA、NaHCO3 、臺盼藍、洋紅。 營養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基（含8%小牛血清、1萬單位/ml青、鏈霉素）。 維持液： DMEM培養(yǎng)基（含5%小牛血清、1萬單位/ml青、鏈霉素）。,四、原代培養(yǎng),1.酒精棉球消毒鴨蛋，剝出鴨胚，去頭、翅、爪和內臟， 加Hanks 液，剪碎為0. 5 -1mm3 的小塊， Hanks 液洗滌2 - 3 次。 2. 組織塊移入培養(yǎng)瓶，間距0.5cm擺放后倒置培養(yǎng)瓶，加少量營養(yǎng)液，保持濕潤，37 培養(yǎng)，2hr后翻轉培養(yǎng)瓶，添營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 3. 定期觀察細胞貼壁生長狀況，如顏色變黃，說明細胞生長，3-5天后更換培養(yǎng)液。 4 .倒置顯微鏡下觀察拍照。 5.單層細胞用Hanks 液洗滌后，加入維持液，用于原代細胞維持。,五、傳代培養(yǎng),當培養(yǎng)細胞接近匯合成片時，傾去培養(yǎng)液。 加入0. 25 %（含0. 02 %EDTA ）消化2-3分鐘，傾去大部分消化液，留少量消化液浸潤細胞。發(fā)現(xiàn)細胞層出現(xiàn)裂痕或空洞后，加入Hanks 液洗去殘留消化液，終止消化。 加適量營養(yǎng)液吹打分散，補加營養(yǎng)液后，1：2分裝培養(yǎng)。 匯合后挑取少許細胞，染色，觀察拍照。,原代培養(yǎng)的紹鴨成纖維細胞，相差顯微鏡照片,正常細胞,凋亡細胞,分裂中期細胞,傳代培養(yǎng)的紹鴨成纖維細胞形態(tài)（DAPI染色）,六、作