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文檔簡介

實驗九 動物細胞培養(yǎng),一、實驗?zāi)康?掌握無菌操作; 掌握原代和傳代細胞培養(yǎng); 了解培養(yǎng)成纖維細胞的形態(tài)。,原代培養(yǎng) :培養(yǎng)直接來自動物機體的細胞群,將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)。 細胞株:從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標志的細胞群。 細胞系:從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細胞,可無限繁殖。,二、實驗原理,三、實驗器材與試劑,1. 器具 顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、天平、CO2培養(yǎng)箱、蒸汽滅菌器、超凈工作臺、解剖刀、 眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿 、錐形瓶、容量瓶、紗布、培養(yǎng)瓶、移液槍。 2. 材料 9 - 12 日齡發(fā)育良好的鴨胚。,3. 主要試劑 雙蒸水、Hanks液、0.25%胰蛋白酶、EDTA、NaHCO3 、臺盼藍、洋紅。 營養(yǎng)液:DMEM培養(yǎng)基(含8%小牛血清、1萬單位/ml青、鏈霉素)。 維持液: DMEM培養(yǎng)基(含5%小牛血清、1萬單位/ml青、鏈霉素)。,四、原代培養(yǎng),1.酒精棉球消毒鴨蛋,剝出鴨胚,去頭、翅、爪和內(nèi)臟, 加Hanks 液,剪碎為0. 5 -1mm3 的小塊, Hanks 液洗滌2 - 3 次。 2. 組織塊移入培養(yǎng)瓶,間距0.5cm擺放后倒置培養(yǎng)瓶,加少量營養(yǎng)液,保持濕潤,37 培養(yǎng),2hr后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,添營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 3. 定期觀察細胞貼壁生長狀況,如顏色變黃,說明細胞生長,3-5天后更換培養(yǎng)液。 4 .倒置顯微鏡下觀察拍照。 5.單層細胞用Hanks 液洗滌后,加入維持液,用于原代細胞維持。,五、傳代培養(yǎng),當培養(yǎng)細胞接近匯合成片時,傾去培養(yǎng)液。 加入0. 25 %(含0. 02 %EDTA )消化2-3分鐘,傾去大部分消化液,留少量消化液浸潤細胞。發(fā)現(xiàn)細胞層出現(xiàn)裂痕或空洞后,加入Hanks 液洗去殘留消化液,終止消化。 加適量營養(yǎng)液吹打分散,補加營養(yǎng)液后,1:2分裝培養(yǎng)。 匯合后挑取少許細胞,染色,觀察拍照。,原代培養(yǎng)的紹鴨成纖維細胞,相差顯微鏡照片,正常細胞,凋亡細胞,分裂中期細胞,傳代培養(yǎng)的紹鴨成纖維細胞形態(tài)(DAPI染色),六、作

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